MX2012005252A - Loci genetico asociado con la resistencia a la roya tropical (physopella zeae) en el maiz. - Google Patents

Loci genetico asociado con la resistencia a la roya tropical (physopella zeae) en el maiz.

Info

Publication number
MX2012005252A
MX2012005252A MX2012005252A MX2012005252A MX2012005252A MX 2012005252 A MX2012005252 A MX 2012005252A MX 2012005252 A MX2012005252 A MX 2012005252A MX 2012005252 A MX2012005252 A MX 2012005252A MX 2012005252 A MX2012005252 A MX 2012005252A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
marker
sec
ident
plant
allele
Prior art date
Application number
MX2012005252A
Other languages
English (en)
Other versions
MX341421B (es
Inventor
Victor Llaca
Marymar Goncalves Butruille
Sandra Cristina Kothe Milach
Emerson Limberger
Elcio De Oliveira Alves
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of MX2012005252A publication Critical patent/MX2012005252A/es
Publication of MX341421B publication Critical patent/MX341421B/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Abstract

La invención se refiere a los métodos y composiciones para identificar las plantas de maíz que tienen resistencia aumentada o disminuida a la roya tropical. Los métodos usan los marcadores moleculares para identificar y seleccionar las plantas con resistencia aumentada a la roya tropical o para identificar y contra seleccionar plantas con resistencia disminuida a la roya tropical. Las plantas de maíz generadas por los métodos de la invención son, además, una característica de la invención. Además, de interés son métodos usados para correlacionar la variación alélica con un rasgo de interés.

Description

LOCI GENETICO ASOCIADO CON LA RESISTENCIA A LA ROYA TROPICAL (PHYSOPELLA ZEAE) EN EL MAIZ CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción se refiere a las composiciones y los métodos útiles para mejorar la resistencia a la roya tropical en plantas y los métodos para identificar las variaciones alélicas asociadas con un rasgo de interés.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La roya tropical es una enfermedad fúngical causada por el patógeno Physopella zeae (Mains) Cummins & Ramachar (syn. Angiopsora zeae Mains) , clasificado, previamente, como Angiopsora zeae Mains (Donald G. White, ed. 1999. Compendium ' of corn diseases. Tercera edición. APS Press, ISBN 0-89054- 234-1). La roya tropical puede propagarse, muy rápidamente, y matar a la planta en poco tiempo.
Las estrategias de manejo de la enfermedad incluyen rotación del cultivo, destrucción de los residuos del maíz viejo por medio de la labranza, y aplicación de fungicida, todos ellos destinados a reducir el inoculo fúngico. Sin embargo, el método de control más efectivo y con mayor preferencia para la roya tropical es la plantación de híbridos resistentes.
Los métodos para controlar la roya tropical por medio de la reducción del inoculo fúngico requieren tiempo y recursos REF: 230165 adicionales por parte del granjero, y, adicionalmente, pueden tener efectos perjudiciales en el medio ambiente. Esto hace que la plantación de híbridos resistentes sea aun más atractiva para los granjeros y el público en general. Así, es preferible proporcionar composiciones y métodos para identificar y seleccionar las plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Se proporcionan composiciones y métodos para identificar y seleccionar las plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical. Además, se proporcionan métodos para la selección de plantas asistidos por marcadores que han mejorado la resistencia a la roya tropical.
En una modalidad, se proporcionan métodos para seleccionar las plantas de maíz o germoplasma con resistencia mejorada a la roya tropical mediante la detección de la presencia de al menos un alelo de un primer locus marcador que está enlazado y asociado con la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR (sec. con núm. de ident . : 155) o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec. con núm. de ident.: 167 y mediante la selección de las plantas de maíz o germoplasma que comprenden al menos un alelo de un primer locus marcador que está enlazado y asociado con la deleción "T" en posición 16 de PHMTR (sec. con núm. de ident.: 155) o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec . con núm. de ident . : 167. Al menos un alelo del primer locus marcador se puede enlazar y asociar con la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR (sec. con núm. de ident.: 155) o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia sec. con núm. de ident.: 167 hasta 20 cM en un mapa de meiosis simple.
En otra modalidad, se proporcionan métodos para seleccionar las plantas de maíz o germoplasma con resistencia mejorada a la roya tropical mediante la detección de. la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR (sec. con núm. de ident.: 155) o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec. con núm. de ident.: 167; y mediante la selección de las plantas de maíz o germoplasma que comprenden la deleción. "T" en la posición 16 de PHMTR (sec. con núm. de ident.: 155) o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec. con núm. de ident.: 167.
En otra modalidad, se proporcionan métodos para identificar las plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical mediante la detección de un locus marcador en el genoma de la planta de maíz, por medio del uso de la secuencia del locus marcador, una parte de la secuencia del locus marcador, o un complemento de la secuencia del locus marcador, o de una parte de esta, como una sonda marcadora.
La sonda marcadora hibridiza bajo condiciones estrictas al ADN contiguo entre e incluso, la sec. con núm. de ident . : 89, o una secuencia de nucleótidos que es 95% idéntica a la sec. con núm. de ident. : 89 basada en el método de alineamiento Clustal V, y sec. con núm. de ident.: 96, o una secuencia nucleotídica que es 95% idéntica a la sec. con núm. de ident.: 96 basada en el método de alineamiento Clustal V, y el locus marcador comprende al menos un alelo que está asociado con la resistencia mejorada a la roya tropical.
En otra modalidad, se proporcionan métodos para identificar las plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical mediante la detección de al menos un alelo marcador asociado con la resistencia mejorada en el germoplasma de la planta de maíz. El locus marcador se puede seleccionar de cualquiera de los siguientes loci marcadores: PH 1192-26-U, PHM1192-4-U, C00435 -802 -U, C00436-801-U, PHM187-7-U, C00423-801-U, PHM5028-24-U, PHM13818-15-U, PHM15721-39-U, PHM15721-180-U, C00441-801-U, C00441- 802 -U, PHM4370-19-U, PHM731-107 -U, C00071-01-U, PHM8249-21-U, C00428-801-U, PHM18427 - 13 -U, PHM9535-10-U, PHM9535-6-U, PHM9535-7-U, y PHM4003 -13 -U; los marcadores PHM PHM15590, PHM13818, PHM1192, PHM187, PHM5028, PHM4370, PHM731, y PHM15721; Sub2e, Sub9d, Subl9c, Sub23m, C06621-1-K2, y C06621- 1-K4 ; así como cualquier otro marcador que esté enlazado a estos marcadores. El locus marcador se. puede encontrar, además, dentro de cualquiera de los siguientes intervalos en el cromosoma 10 que comprende y está flanqueado por : i. PHM15590 y PHM9535; Ü. PHM15590 y PHM15721; iii. C00441 y C00428; iv. PHM731 y PHM15721; y v. C00071 y PHM731.
El locus marcador comprende al menos un alelo que está asociado con la resistencia mejorada a la roya tropical.
En otra modalidad, se proporcionan métodos para identificar las plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical mediante la detección de un haplotipo en el germoplasma de la planta de maíz que está asociada con la resistencia mejorada a la roya tropical. El haplotipo comprende alelos en uno o más loci marcadores, en donde uno o más loci marcadores se encuentran dentro de cualquiera de los siguientes intervalos en el cromosoma 10 que comprende y está flanqueado por: i. PHM15590 y PHM9535; ii. PHM15590 y PHM15721; iii. C00441 y C00428; iv. PHM731 y PHM15721; y v. C00071 y PHM731.
El haplotipo puede comprender una deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec. con núra. de ident . : 167.
En otra modalidad, se proporcionan métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical. En este método, se obtiene una primera planta de maíz en donde la planta de maíz tiene al menos un alelo de un locus marcador que está ubicado dentro de cualquiera de los siguientes intervalos en el cromosoma 10, que comprende y está flanqueado por: i. PHM15590 y PHM9535; ii. PHM15590 y PHM15721; iii. C00441 y C00428; iv. PHM731 y PHM15721; y v. C00071 y PHM731; y el alelo está asociado con resistencia mejorada a la roya tropical. La primera planta de maíz se cruza con una segunda planta de maíz, y se evalúan las plantas de progenie resultantes para el alelo de la primera planta de maíz. Las plantas de progenie que poseen el alelo de la primera planta de maíz se seleccionan, después, porque tienen resistencia mejorada a la roya tropical.
En otra modalidad, se proporcionan métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical. En este método, se obtiene una primera planta de maíz donde la planta de maíz comprende en su genoma la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec . con núm. de ident . : 167. La primera planta de maíz se cruza con una segunda planta de maíz, y las plantas de progenie resultantes se evalúan para la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec. con núm. de ident.: 167. Las plantas de progenie que poseen la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, sec. con núm. de ident.: 167 se seleccionan, después, porque tienen resistencia mejorada a la roya tropical.
Además, las plantas de maíz identificadas o seleccionadas por medio de los métodos descritos anteriormente, en donde la planta no es CML339, son de interés. Además, la progenie de las plantas de maíz identificadas o seleccionadas por los métodos descritos anteriormente son de interés .
En otra modalidad, se presentan métodos para identificar las variaciones alélicas asociadas con una forma deseable de un rasgo. En estos métodos, las secuencias crudas se alinean con una relación costo extensión abierta mayor que 10 y el ruido de transfondo se elimina al recortar las colas. La variación alélica aleatoria es, después, recortada y se aplica un método de agrupamiento en pares no ponderados con media aritmética (UPG A, por sus siglas en inglés) . El recorte de la variación alélica aleatoria y la aplicación de UPGMA a la alineamiento se repiten hasta que se identifique un fenograma. Las variaciones alélicas asociadas con el fenotipo de interés se pueden identificar, después, del fenograma .
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La invención se puede comprender, más claramente, con la siguiente descripción detallada y las figuras adjuntas y el Listado de Secuencias, los cuales forman una parte de esta solicitud. El Listado de Secuencias contiene el código de una letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para los aminoácidos, como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 (núm. 2): 345-373 (1984), que se incorporan a la presente descripción como referencia en su totalidad. Los símbolos y el formato usado para los datos sobre secuencia de aminoácidos y de nucleótidos cumplen con las regulaciones estipuladas en C.F.R. 37 § 1.822. la Figura 1 muestra la disposición del mapa físico de BAC secuenciados (obtenidos del Navegador de Genoma de Maíz, que se encuentra disponible públicamente en internet) que se ensambla a la región del cromosoma 10 definido y que incluye BAC C0497L12 y b0191E02. Se indican las posiciones de los marcadores PHM descritos en la presente descripción, (región definida y que incluyen PHM15590 y PHM15721) , dado que son las posiciones de los marcadores públicos que se sitúan dentro del intervalo .
Las Figuras 2A y 2B muestran las distribuciones de frecuencia de población PH468 x PHS6Y F2 para puntuaciones de roya del sur y tropical, respectivamente.
La Figura 3 muestra los resultados de mapeo por intervalo compuesto, obtenidos mediante el uso de la población PH468 x PHS6Y F2. Se identificó un pico significativo en un brazo corto del cromosoma 10. Las posiciones del marcador en el eje-x corresponden al Mapa genético de PHB. El eje-y representa la puntuación de LOD.
La Figura 4A muestra líneas endogámicas susceptibles y conversión resistente correspondiente mediante el uso de PHS6Y como dador parental . La Figura 4B muestra un híbrido elaborado con una versión susceptible de una línea endogámica. La Figura 4C muestra un híbrido elaborado con la versión ("convertida") resistente de la misma línea endogámica. Esto muestra que el gen de la roya tropical tiene un efecto dominante en el nivel del híbrido.
La Figura 5 muestra un híbrido que es altamente susceptible a la roya tropical (en la izquierda) y el mismo híbrido que se ha convertido para tener una resistencia mejorada de PHS6Y (en la derecha) .
La Figura 6 muestra los clones BAC públicos usados como referencia para el diseño cebador de las líneas de maíz del genotipo que son resistentes y susceptibles a la roya tropical. La información interna respecto de la superposición BAC se usó para disminuir más aun; el orden de la secuencia de la región 2-2.5 Mb en las subregiones 24.
La Figura 7 muestra parte de la secuencia de referencia (parte superior) obtenida por la genotipificación de las líneas de maíz resistentes y susceptibles a la roya tropical mediante el uso de cebadores PCR (sec. con núm. de ident.: 133 y 134) diseñados para el clon ID Ct9050c064Gllc (Tabla 9). La sec. con núm. de ident.: 137-142 representa amplicones obtenidos de las líneas resistentes, mientras que la sec. con núm. de ident.: 143-154 representa amplicones obtenidos de las líneas susceptibles. El área resaltada en gris representa una región 21 bp de la secuencia de referencia (referida como PHMTR; sec. con núm. de ident.: 155). Todas las líneas de maíz que tienen deleción T en bp 16 (indicada por la flecha) muestran resistencia mejorada a la roya tropical y tienen la secuencia de la sec. con núm. de ident.: 156.
La Figura 8 muestra parte del alineamiento de las secuencias del amplicón obtenidas mediante el uso de cebadores, la sec. con núm. de ident.: 135 y la sec. con núm. de ident.: 136. Se encontró que un haplotipo "GAG" (compacto) es único a todas las líneas con resistencia mejorada a la roya tropical.
Breve Descripción del Listado de Secuencias Las descripciones de la secuencia y el Listado de Secuencias adjunto en la presente descripción cumplen con las reglas que rigen las descripciones de las secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos en las solicitudes de patente, tal como se exponen en 37 C.F.R. §1.821-1.825. El listado de Secuencias contiene el código de una letra para los caracteres de las secuencias de nucleótidos y los códigos de tres letras para las secuencias de aminoácidos, tal como se define de conformidad con los estándares de la IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) y en el Biochemical J. 219 (2) : 345-373 (1984) que se encuentran en la presente descripción, incorporados como referencia. Los símbolos y el formato usados para los datos de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos cumplen con las regulaciones estipuladas en 37 C.F.R. §1.822.
La Tabla 1 lista las secuencias descritas en la presente descripción, que están asociadas con los marcadores de Producción InvaderPlus, junto con los identificadores correspondientes (sec. con núm. de ident . : ) como se usa en el Listado de Secuencias adjunto.
Tabla 1: Marcadores de Producción InvaderPlus. 10 La Tabla 2 lista las secuencias descritas en la presente descripción que están asociadas con los marcadores PHM, junto con los identificadores correspondientes (sec. con núm. de ident . : ) como se usa en el Listado de Secuencia adjunto.
Tabla 2: Secuencias de Marcador PHM: amplicón e información del cebador.
La sec . con núra . de ident . : 129 es el cebador L diseñado para Clon ID Ct9050c497L12e.
La sec . con núm. de ident.: 130 es el cebador R diseñado para el Clon ID Ct9050c497L12e.
La sec . con núm. de ident.: 131 es el cebador L diseñado para el Clon ID Ct9050c064Glld.
La sec . con núm . de ident . : 132 es el cebador R diseñado para el Clon ID Ct9050c064Glld.
La sec . con núm. de ident.: 133 es el cebador L diseñado para el Clon ID Ct9050c064Gllc.
La sec . con núm . de ident . : 134 es el cebador R diseñado para el Clon ID Ct9050c064Gllc.
La sec . con núm . de ident . : 135 es el cebador L diseñado para el Clon ID Ct9050bl91E02m.
La sec . con núm. de ident. : 136 es el cebador R diseñado para el Clon ID Ct9050bl91E02m.
La sec . con núm. de ident . : 137 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident. : 133 y la sec. con núm. de ident. : 134 como los cebadores y el ADN PHS6Y.
La sec. con núm. de ident.: 138 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso ,de la sec. con núm. de ident.: 133 y sec. con núm. de ident.: 134 como los cebadores y el ADN PH1JG22. El PH1JG22 es una línea endogámica de maíz que es resistente a la roya tropical.
La sec. con núm. de iden . : 139 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH1FT71. El PH1FT71 es una línea endogámica de maíz que es resistente a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 140 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la SEC ID NUM: 133 y SEC ID NUM: 135 como los cebadores y el ADN PH1G3H1. El PH1G3H1 es una línea endogámica de maíz que es resistente a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 141 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident. ::133 y SEC ID NUM:135 como los cebadores y ADN PH1JG01. PH1JG01 es una línea endogámica de maíz que es resistente a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 142 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PHS7W. El PHS7W es una línea endogámica de maíz que es resistente a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 143 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH7 3. El PH7W3 es una línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 144 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH9VF. El PH9VF es una línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 145 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident. : 133 y la sec. con núm. de ident. : 135 como los cebadores y el ADN PHBNA. El PHBNA es üna línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 146 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH2JR. El PH2JR es una línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 147 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PHOTJ. El PHOTJ es una línea endogámica que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 148 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH467. El PH467 es una línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 149 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH48F. El PH48F es una línea endogámica que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 150 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH7WC. El PH7 C es una línea endogámica de maíz que es susceptible · a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 151 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN 625. El 625 es una línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 152 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PHP3P1. El PHP3P1 es una línea endogámica que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident.: 153 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PHY7M2. El PHY7M2 es una línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident . : 154 es la secuencia del amplicón obtenida por medio del uso de la sec. con núm. de ident.: 133 y la sec. con núm. de ident.: 135 como los cebadores y el ADN PH147G5. El PH147G5 es una línea endogámica de maíz que es susceptible a la roya tropical.
La sec. con núm. de ident. : 155 es la secuencia de la región PHMTR.
La sec. con núm. de ident.: 156 es la secuencia, de la región PHMTR sin la "T" en la posición 16 de la sec. con núm. de ident . : 155.
La sec. con núm. de ident.: 157-164 son las secuencias para los cebadores C06621-1-K2 y C06621-1-K4 (Tabla 3) .
Tabla 3: C06621-1-K2 y C06621-1-K4 Información sobre el Marcador KASP.
Nombre del marcador C06621-1-K2 C06621-1-K4 Cebador Reverso para Marcador 1 (Objetivo Sec. con núm. de Sec. con núm. de específico) ident.: 157 ident.: 161 Cebador Reverso para Marcador 2 (Control Sec . con núm . de Sec. con núm.
Interno) . ident. : 158 ident. : 162 Alelo 1 P P Alelo 2 X X Tinte 1 VIC VIC Tinte 2 FAM FAM Cebador hacia adelante para Marcador 1 + Secuencia universal VIC. Sec . con núm. de Sec . con núm.
(Objetivo Específico) ident . : 159 ident. : 163 Cebador Directo para Marcador 2 + Secuencia universal FAM (Control Sec. con núm. de Sec. con núm. de Interno) . ident. : 160 ident. : 164 La sec. con núm. de ident.: 165 es la secuencia universal FAM.
La sec. con núm. de ident.: 166 es la secuencia universal VIC.
La sec. con núm. de ident.: 167 es la secuencia de referencia para Sub23Mes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones alélicas en el maíz y métodos para identificar y seleccionar las plantas de maíz con la resistencia mejorada a la roya tropical. Además, dentro del alcance de la presente invención se encuentran las composiciones alélicas y los métodos usados para identificar y contra seleccionar plantas de maíz que han disminuido la resistencia a la roya tropical. Las siguientes definiciones se proporcionan como una ayuda para entender esta invención.
El término "resistencia mejorada", "resistencia aumentada" o "resistencia recientemente conferida" se usan indistintamente y se refieren a un nivel aumentado de la resistencia contra un patógeno en particular, un espectro amplio de patógenos, o una infección causada por el (los) patógeno (s) . Un nivel aumentado de resistencia contra un patógeno fúngico en particular, la roya tropical, por ejemplo, constituye resistencia fúngico acrecentada o "mejorada". Las modalidades de la invención mejorarán o aumentarán la resistencia al patógeno fúngico de la planta, de manera tal que la resistencia de la planta a un patógeno o patógenos fúngicos aumentará, la cual a su vez, aumentará la resistencia a la enfermedad causada por el patógeno fúngico. El término "mejorar" se refiere a acrecentar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, levantar, y similares. En la presente descripción, las plantas de la invención son descritas porque tienen "resistencia mejorada" a la infección de roya tropical, como resultado de alelos específicos en el locus de la invención.
Una planta de maíz que muestra resistencia mejorada a la roya tropical es una planta que está menos afectada con respecto al rendimiento y/o capacidad de supervivencia u otras medidas agronómicas relevantes, en virtud de la introducción de los agentes causativos de esa enfermedad. La resistencia es un término relativo, que indica que la planta infectada produce mejor rendimiento de maíz que otra planta más susceptible, tratada similarmente , Es decir, las condiciones causan una diminución reducida en la supervivencia y/o rendimiento del maíz en una planta de maíz resistente, en comparación con una planta de maíz susceptible. Una persona con experiencia en la técnica apreciará que la resistencia de la planta de maíz a la roya tropical varía ampliamente, puede representar un espectro de fenotipos más resistentes o menos resistentes, y puede variar según la infección. Sin embargo, mediante la simple observación, una persona con experiencia en la técnica puede determinar la resistencia relativa o la susceptibilidad de diferentes plantas, líneas de planta o familias de planta a la roya tropical, y reconocerá, además, las gradaciones fenotípicas de "resistente" . Como se usa en la técnica, "resistencia" se refiere algunas veces como "resistencia general", "resistencia de reducción de velocidad" o "resistencia parcial" .
"La resistencia de la enfermedad" es una característica de una planta, en donde la planta evita los síntomas de la enfermedad que son el resultado de las interacciones patógeno-planta, tales como, interacciones roya tropical del maíz. Es decir, se evita que los patógenos causen enfermedades a la planta y los síntomas asociados con la enfermedad, o alternativamente, los síntomas de la enfermedad causados por el patógeno se minimizan o se disminuyen. Una persona con experiencia en la técnica apreciará que las " composiciones y métodos descritos, en la presente descripción se pueden usar con otras composiciones y métodos disponibles en la técnica para proteger las plantas de los ataques del patógeno.
Como se usa en la presente descripción, la "resistencia fúngica" se refiere a resistencia o tolerancia mejoradas a un patógeno fúngico cuando se compara con aquella de una planta silvestre. Los efectos pueden variar de un aumento leve en tolerancia a los efectos de patógeno fúngico (por ejemplo, inhibición parcial) a una resistencia total de manera tal que la planta no se vea afectada por la presencia del patógeno fúngico.
Una planta referida en la presente descripción como "diploide" tiene dos conjuntos de cromosomas.
Una planta conocida en la presente descripción como "doble haploide" se desarrolló mediante duplicación del conjunto de cromosomas. Una planta haploide doblada se considera una planta homócigota.
Una "línea élite" es cualquier línea que resulta del cultivo y selección para un rendimiento agronómico superior.
El término "alelo" se refiere a uno de dos o más secuencias de nucleótidos que están en un locus específico.
La "frecuencia alelo" se refiere a la frecuencia (proporción o porcentaje) de un alelo dentro de una población, o una población de líneas. Uno puede estimar la frecuencia del alelo dentro de una población por el promedio de las frecuencias del alelo de una muestra de individuos de esa población.
Un "amplicón" es un ácido nucleico amplificado, por ejemplo, un ácido nucleico que se produce por la amplificación de un ácido nucleico de la plantilla por cualquier método de amplificación disponible (por ejemplo, PCR, LCR, transcripción, o similares) .
El término "amplificador" en el contexto de amplificación de ácido nucleico es todo proceso mediante el cual se producen copias adicionales de un ácido nucleico seleccionado (o una forma transcrita del mismo) . Los métodos típicos de amplificación incluyen varios métodos de replicación basada en polimerasa, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) , métodos mediados por la ligasa tales como los métodos de reacción en cadena de la ligasa (LCR por sus siglas en inglés) y métodos de amplificación basada en ARN- olimerasa, (por ejemplo, por transcripción.).
El término "ensamblar" se aplica a los BAC y sus propensidades para unirse y formar tramos contiguos de ADN. Un BAC "se ensambla" a un contigo basado en el alineamiento de secuencia, si el BAC es secuenciado, o por medio de la alineación de la huella dactilar del BAC a las huellas dactilares de otros BAC. Se pueden encontrar ensambles públicos por medio del uso del Navegador del Genoma de Maíz, que está disponible públicamente en internet.
Un alelo está "asociado con" un rasgo cuando es parte o está enlazado a una secuencia de ADN o alelo que afecta la expresión de un rasgo, y la presencia del alelo es un indicador que el rasgo o la forma de rasgo deseado sucederá en una planta que comprende el alelo.
Un "BAC", o cromosoma artificial bacteriano, es un vector de clonación derivado del factor F en estado natural de Escherichia coli. Los BAC pueden aceptar insertos grandes de secuencia ADN. En el maíz, una cantidad de BAC, o cromosomas artificiales bacterianos, cada uno contiene un inserto grande de ADN genómico de maíz, se han ensamblado en el interior de los cóntigos . (superposición de fragmentos genéticos contiguos o "ADN contiguo").
El "retrocruzamiento" se refiere al proceso por el cual la progenies híbridas se retrocruzan repetidamente a uno de los parentales . El "dador" parental se refiere a la planta parental con gen/genes, locus/loci deseados, o fenotipo específico para ser introgresados . El parental "receptor" (usado uno o más veces) o el parental "recurrente" (usado dos o más veces) se refiere a la planta parental en el cual el gen o locus se introgresa. Por ejemplo, ver Ragot, M. et al. (1995) Marker-assisted backcrossing : a practical example, in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol . 72, págs . 45-56, y Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, págs. 41-43. El cruzamiento inicial da lugar a la generación Fl; el término "BC1" se refiere, después, al segundo uso del parental recurrente, "BC2" se refiere al tercer uso del parental recurrente, y , así sucesivamente.
Un centimorgan ("cM") es una unidad de medida de frecuencia de recombinación. Un cM es igual a 1% de probabilidad que un marcador en un locus genético será separado de un marcador a un segundo locus debido a entrecruzamiento en una generación simple.
Como se usa en la presente descripción, el término "intervalo cromosomal" designa un tramo lineal contiguo de ADN genómico, que reside en la planta sobre un cromosoma simple. Los elementos genéticos o genes ubicados en un intervalo cromosomal simple están enlazados físicamente. El tamaño de un intervalo cromosomal no está limitado particularmente. En algunos aspectos, los elementos genéticos ubicados dentro del intervalo cromosomal simple están enlazados genéticamente, típicamente, con una distancia de recombinación genética de, por ejemplo, menor o igual que 20 cM( o alternativamente, menor o igual que 10 cM. Es decir, dos elementos genéticos dentro de un intervalo cromosomal simple se someten a la recombinación a una frecuencia menor o igual que 20% o 10% .
Como se usa en la presente descripción, el término "intervalo cromosomal" designa un tramo lineal contiguo de ADN genómico, que reside en la planta en un cromosoma simple. Los elementos genéticos o genes ubicados en un intervalo cromosomal simple están enlazados físicamente. El tamaño del intervalo cromosomal no está limitado particularmente. En algunos aspectos, los elementos genéticos ubicados dentro del intervalo cromosomal simple están enlazados genéticamente, típicamente, con una distancia de recombinación genética, por ejemplo, menor o igual que 20 cM, o alternativamente, menor o igual que 10 cM. Es decir, dos elementos genéticos dentro de un intervalo cromosomal simple se someten a la recombinación a una frecuencia menor o igual que 20% o 10% .
Un "cromosoma" es una pieza única de ADN enrollada que contiene muchos genes que actúan y se mueven como una unidad durante la división de célula y, por lo tanto, se puede decir que están enlazados, se puede referir, además, como un "grupo de enlace" .
La frase "estrechamente enlazado" , en la presente solicitud, significa que la recombinación entre dos loci enlazados ocurre con una frecuencia igual o menor que aproximadamente 10% (es decir, están separados en un mapa genético por no más de 10 cM) . En otras palabras, los loci estrechamente enlazados cosegregan al menos 90% del tiempo. Los loci marcadores son útiles, especialmente, en la presente invención cuando muestran una probabilidad significativa de cosegregación (enlace) con un rasgo deseado (por ejemplo, resistencia patogénica) . Los loci estrechamente unidos, tales como un locus marcador y un segundo locus puede mostrar una frecuencia de recombinación de inter-locus del 10% o menor, preferentemente aproximadamente 9% o menor, aún con mayor preferencia aproximadamente 8% o menor, incluso con mayor preferencia aproximadamente 7% o menor, aún con mayor preferencia aproximadamente 6% o menor, incluso con mayor preferencia aproximadamente 5% o menor, aun con mayor preferencia aproximadamente 4% o menor, incluso con mayor preferencia aproximadamente 3% o menor, y aún con mayor preferencia aproximadamente 2% o menor. En modalidades altamente preferidas, los loci relevantes muestran una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1% o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.75% o menor, con mayor preferencia aproximadamente 0.5% o menos, o incluso con mayor preferencia aproximadamente 0.25% o menos. Dos loci que están situados en el mismo cromosoma, y a tal distancia que la recombinación entre los dos loci ocurre a una frecuencia menor que 10% (por ejemplo, aproximadamente 9% , 8% , 7% , 6% , 5% , 4% , 3% , 2% , 1% , 0.75% , 0.5% , 0.25% , o menos) y se dice, además que están "próximos" entre sí. En algunos casos, dos marcadores diferentes pueden tener las mismas coordenadas del mapa genético. En ese caso, los dos marcadores están en tal cercana proximidad entre sí que la recombinación ocurre entre ellos con tal baja frecuencia que es no es detectable.
En Bioinformática, "agrupamiento" se refiere a la agrupación de las secuencias que están de alguna manera relacionadas y se usa, frecuentemente, para elaborar un conjunto no-redundante de secuencias representativas. Las secuencias pueden ser genómicas, "transcriptómica" (EST) o proteína en naturaleza.
El término "complemento" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un secuencia de nucleótidos determinada, es decir, las secuencias se relacionan por las reglas del apareamiento de base.
El término "ADN contiguo" se refiere a un tramo ininterrumpido de ADN genómico representado al superponer parcialmente las piezas o los cóntigos .
Cuando se hace referencia a la relación entre dos elementos genéticos, tales como un elemento genético que contribuye a la resistencia y a un marcador proximal, el enlace de fase de "acoplamiento" indica el estado donde el alelo "favorable" en el locus de resistencia está físicamente asociado en la misma cadena de cromosoma como el alelo "favorable" del respectivo locus marcador enlazado. En una fase de acoplamiento, ambos alelos se heredan en forma conjunta mediante la progenie que heredan esa cadena de cromosoma.
El término "cruzado" o "cruzamiento" significa la fusión de gametas por medio de la polinización para producir progenie (por ejemplo, células, semillas o plantas) . El término abarca ambos cruces sexuales (la polinización de una planta por, otra) y autofecundación (auto-polinización, por ejemplo, cuando el polen y el óvulo son de la misma planta) . El término "cruzamiento" se refiere al acto de fusionar las gametas por medio de la poliniación para producir la progenie .
En la presente descripción, una planta denominada "diploide" tiene dos grupos (genomas) de cromosomas.
Una planta referida en la presente descripción como "doble haploide" se desarrolla mediante la duplicación del conjunto haploides de cromosomas (es decir, la mitad del número normal de cromosomas) . Una planta doble haploide tiene dos conjuntos idénticos de cromosomas, y todos los loci se consideran homocigotas .
Una "línea élite" es cualquier línea que resulta del cultivo y selección para un rendimiento agronómico superior.
Una "cepa exótica de maíz" o un "germoplasma exótico de maíz" es una cepa o germoplasma derivado de un maíz que no pertenece a una línea élite de maíz disponible o cepa del germoplasma. En el contexto de un cruzamiento entre dos plantas de maíz o cepas de germoplasma, un germoplasma exótico no está relacionado estrechamente por medio del descenso al germoplasma élite con el cual se cruza. Más comúnmente, el germoplasma exótico no está derivado de cualquier línea de élite conocida de maíz, sino que se selecciona para introducir los elementos genéticos nuevos (típicamente alelos nuevos) en un programa de mejora genética.
Un "alelo favorable" es el alelo en un locus particular que confiere, o contribuye a un fenotipo agronómicamente preferible, por ejemplo, resistencia mejorada a la roya tropical, y que permite la identificación de plantas con fenotipo agronómicamente preferible. Un "alelo favorable" de un marcador es un alelo marcador que segrega con el fenotipo favorable .
"Fragmento" tiene por objeto significar una parte de una secuencia de Nucleotidos. Los fragmentos se pueden usar como sondas de hibridización o cebadores PCR mediante el uso de métodos descritos, en la presente descripción.
Un "mapa genético." es una descripción de relaciones de enlace genéticos entre Loci en uno o más cromosomas (o grupos de enlace) dentro de una especie dada, generalmente, descrita en una forma tabular o diagramática . Para cada mapa genético, las distancias entre Loci se miden por la frecuencia en que sus alelos aparecen juntos en una población (es decir, sus frecuencias de recombinación) . Los alelos se pueden detectar mediante el uso de ADN o marcadores de proteína, o fenotipos observables. Un mapa genético es un producto de la población de mapeo, tipos de marcadores usados, y potencial polimórfico de cada uno de los marcadores entre las poblaciones diferentes. Las distancias genéticas entre loci pueden diferir de una mapa genético a otro. No obstante, se puede correlacionar información a partir de un mapa a otro mediante el uso de marcadores comunes. Uno de los expertos comunes en la técnica puede usar posiciones de marcador común para identificar posiciones de marcadores y otros loci de interés en cada mapa genético individual. El orden del loci no debería cambiar entre mapas, aunque, frecuentemente, existe pequeños cambios en las órdenes de marcador debido a, por ejemplo; marcadores que detectan loci duplicado alternativo en poblaciones diferentes, diferencias en enfoques estadísticos usados para ordenar los marcadores, mutación nueva o error de laboratorio.
Un "sitio en el mapa genético" es un sitio en un mapa genético con relación a los marcadores genéticos alrededor del mismo grupo de unión, en donde se puede encontrar un marcador específico en una especie específica.
El "mapeo genético" es el proceso de definir la relación de enlace de los loci a través del uso de marcadores genéticos, poblaciones que se segregan para los marcadores, y principios genéticos estándares de la frecuencia de recombinación.
El término "Marcador Genético" se referirá a cualquier tipo de marcador basado en ácido nucleico que incluye, pero no se limita a, Polimorfismo de la Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , Repetición de Secuencia Simple (SSR, por sus siglas en inglés) , ADN Polimórfico Amplificado Aleatorio. (RAPD, por sus siglas en inglés) , Secuencias Polifórmicas Amplificadas Cortadas (CAPS, por sus siglas en inglés) (Rafalski y Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275-280), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (Vos et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407-4414), Single Nucleotide Polymorphism (SNP) (Brookes, 1999, Gen. 234:177-186), Sequence Characterized Amplified Región (SCAR) (Paran y Michelmore, 1993, Theor. Appl . Genet . 85:985-993), Sequence Tagged Site (STS) (Onozaki et al., 2004, Euphytica 138:255-262), Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP) (Orita et al., 1989, Proc Nati Acad Sci USA 86:2766-2770), Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) (Blair et al., 1999, Theor. Appl. Genet. 98:780-792), Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism (IRAP) , Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism (REMAP) (Kalendar et al., 1999, Theor.
Appl. Genet. 98:704-711), un producto de clivaje ARN (tal como una etiqueta Lynx) , y similares.
"La frecuencia de recombinación genética" es la frecuencia de evento de entrecruzamiento (recombinación) entre dos loci genéticos. La frecuencia de recombinación se puede observar por medio del seguimiento de la segregación de marcadores y/o rasgos seguida de meiosis.
"Genoma" se refiere al ADN total, o todo el conjunto de genes, portado por un cromosoma o conjunto de cromosomas.
El término "genotipo" es la constitución genética de un individuo (o grupo de individuos) en uno o más Loci genéticos, en contraste con el rasgo observable (el fenotipo.) . El Genotipo se define por el (los) alelo (s) de uno o más loci más conocidos . que el individuo ha heredado de sus padres. El término genotipo se puede usar para referirse a una constitución genética del individuo en un locus simple, en loci mútliples o, más, generalmente, el término genotipo se puede usar para referirse a una composición genética del individuo para todos los genes en su genoma .
El ' "germoplasma" se refiere al material genético de o a partir de un individuo (por ejemplo, una planta) , un grupo de individuos (por ejemplo, una línea, variedad o familia de planta), o un clon derivado de una línea, variedad, especie o cultivo. El germoplasma puede ser parte de un organismo o célula, o puede estar separado del organismo o célula.
Generalmente, el germoplasma proporciona material genético con una composición molecular específica que proporciona una base física para algunas o todas las calidades hereditarias de un organismo o cultivo celular. Como se usa en la presente descripción, el germoplasma incluye células, semilla o tejidos de los cuales pueden crecer nuevas plantas o partes de planta, tales como hojas, tallos, polen, o células que pueden ser cultivados en una planta entera.
Un "haplotipo" es el genotipo de un individuo en una pluralidad de loci genético, es decir una combinación de alelos . Típicamente, los loci genéticos descritos por haplotipo están enlazados física y genéticamente, es decir, en el mismo segmento de cromosoma. El término "haplotipo" puede referirse a una serie de poliformismos con una secuencia específica, tal como un locus marcador, o una serie de poliformismos a través de secuencias múltiples, por ejemplo, loci de marcadores múltiples.
Un "grupo heterótico" comprende un conjunto de genotipos que se desempeña bien cuando se cruza con genotipos de un grupo heterótico diferente (Hallauer et al. (1998) Corn breeding, págs . 463-564. en G.F. Sprague y J.W. Dudley (ed.) Corn and corn i provement) . Las líneas endogámicas se clasifican en grupos heteróticos y están subdivididos, más aun, en familias dentro de un grupo heterótico, basado en varios criterios, tales como asociaciones basadas en el marcador molecular, linaje y desempeño en combinaciones de híbrido. (Smith et al. (1990) Theor. Appl. Gen. 80:833-840).
Los dos grupos heteróticos más grandes en los Estados Unidos se refieren como "Iowa Stiff Stalk Synthetic" (BSSS) y "Lancaster" o "Lancaster Sure Crop" (a veces referido como NSS, o non-Stiff Stalk) .
El término "heterocigoto" significa una condición genética en donde alelos diferentes residen en el loci correspondiente en cromosomas homólogos.
El término "homocigoto" significa una condición genética, en donde alelos idénticos residen en el loci correspondiente en cromosomas homólogos.
El término "híbrido" se refiere a la progenie obtenida entre el cruce de al menos dos genitores genéticamente no similares.
"Hibridación" o "hibridación del ácido nucleico" se refiere al apareamiento de las cadenas de ARN y ADN complementarias así como el apareamiento de cadenas simples de ADN complementarias .
El término "hibridar" significa formar pares de base entre las regiones complementarias de las cadenas de ácido nucleico.
Un "Mapa genético IBM" se refiere a cualquiera de los siguientes mapas: IBM, IBM2 , vecinos IBM2 , IBM2 FPC0507, vecinos IBM2 2004, vecinos IBM2 2005, o IBM2 2005 vecinos marco. Los mapas genéticos IBM están basados en una población B73 x Mol7 en la cual la progenie a partir del cruzamiento inicial fue acoplado aleatoriamente para generaciones múltiples previo a construir líneas endogámicas recombinantes para mapeo. Versiones más nuevas reflejan la adición de los loci mapeados del BAC y genético así como el refinamiento del mapa mejorado debido a la incorporación de la información obtenida de otros mapas genéticos.
El término "endogámico" se refiere a una línea que se produjo para homogeneidad genética.
El término "indel" se refiere a una inserción o deleción, en donde una línea se puede referir con una inserción en relación con la segunda línea, o la segunda línea se puede referir con una deleción en relación con la primera línea.
El término "introgresión" se refiere a la transmisión de un alelo de un locus genético de un contexto genético a otro. Por ejemplo, la introgresión de un alelo deseado en un locus especificado se puede transmitir a, al menos, una progenie por medio de un cruce sexual entre dos progenitores de la misma especie, donde al menos uno de los progenitores tenga el alelo deseado en su genoma. Alternativamente, por ejemplo, la transmisión de un alelo puede ocurrir por la recombinación entre dos genomas dadores, por ejemplo, en un protoplasto fusionado, donde al menos uno de los protoplastos dadores tiene el alelo deseado en su genoma. El alelo deseado puede ser, por ejemplo, un alelo seleccionado de un marcador, un QTL, un transgen o similar. En cualquier caso, las crías que comprenden el alelo deseado puede ser retrocruzado repetidamente a una línea que tiene un contexto genético deseado y seleccionado para el alelo deseado, para resultar en el alelo que se fijarán en un contexto genético seleccionado .
El proceso de "introgresión" se refiere, frecuentemente, como "retrocruzamiento" cuando el proceso se repite dos o más veces. En la introgresión o retrocuzamiento, el "dador" parental se refiere a la planta parental con el gen o locus deseado para ser introgresado . El "receptor" parental (usado una o más veces) o parental "recurrente" (usado dos o más veces) se refiere a la planta parental en la cual el gen o el locus se está introgresando. Por ejemplo, ver Ragot, M. et al. (1995) Marker-assisted backcrossing : a practical example, en Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol . 72, págs . 45-56, y Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, págs. 41-43. El cruzamiento inicial da origen a la generación Fl ; el término "BC1" se refiere, después, al segundo uso del parental recurrente, "BC2" se refiere al tercer uso del parental recurrente y así sucesivamente.
Como se usa en la presente descripción, el término "enlace" se usa para describir el grado con el cual un locus marcador está asociado con otro locus marcador o algún otro locus (por ejemplo, un locus de la roya tropical) . La relación de enlace entre un marcador molecular y un fenotipo, (por ejemplo, resistencia mejorada a la roya tropical) se da como una "probabilidad" o "probabilidad ajustada". El enlace se puede expresar como un límite o intervalo. Por ejemplo, en algunas modalidades, todo marcador está enlazado (genética y físicamente) a cualquier otro marcador cuando los marcadores están separados menos de 50, 40, 30, 25, 20, o 15 unidades de mapa (o cM) . En algunos aspectos, es beneficioso definir un intervalo marcado de enlace, por ejemplo entre 10 y 20 cM, entre 10 y 30 cM entre 10 y 40 cM. Cuanto más cerca esté enlazado un marcador a un segundo locus, mejor resultará el indicador del marcador para el segundo locus. Así, los "loci estrechamente enlazados" tal como un locus marcador y un segundo locus muestran una frecuencia de recombinación inter-locus del 10% o menos, preferentemente aproximadamente 9% o menos, aún con mayor preferencia aproximadamente 8% o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 7% o menos, aún con mayor preferencia aproximadamente 6% o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 5% o menos, aún con mayor preferencia aproximadamente 4% o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 3% o menos, y aún con mayor preferencia aproximadamente 2% o menos. En modalidades altamente preferidas, los loci relevantes muestran una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1% o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.75% o menos, con mayor preferencia aproximadamente 0.5% o menos, o aún con mayor preferencia aproximadamente 0.25% o menos. Dos loci que están situados en el mismo cromosoma, y a tal distancia que la recombinación entre los dos loci ocurre a una frecuencia menor que 10% (por ejemplo, aproximadamente 9% , 8% , 7% , 6% , 5% , 4% , 3% , 2% , 1% , 0.75% , 0.5% , 0.25% , o menos) se dice, además, que están "próximas" la una con la otra. Dado que un cM es la distancia entre dos marcadores que muestran una frecuencia de recombinación del 1% , cualquier marcador que está enlazado estrechamente (genética y físicamente) a cualquier otro marcador que están en proximidad cercana, por ejemplo; en o menor que 10 cM de distancia. Dos marcadores enlazados estrechamente en el mismo cromosoma pueden posicionarse a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 0.75, 0.5 o 0.25 cM o menos el uno del otro.
El término "desequilibrio de enlace" se refiere a una segregación no aleatoria de loci genético o rasgos (o ambos) . En cualquiera de los casos, el desequilibrio de enlace implica que los loci relevantes están dentro de la proximidad física suficiente a lo largo de una longitud de un cromosoma, de manera tal que segregan juntos con una frecuencia mayor más que aleatoria (es decir no-aleatoria) (en el caso de rasgos de cosegregacion, los loci que son la base de los rasgos están en proximidad suficiente el uno con el otro) . Los marcadores que muestran desequilibrio de enlace se consideran enlazados. Los loci enlazados cosegregan más del 50% del tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 51% a aproximadamente 100% del tiempo. En otras palabras, dos marcadores que cosegregan tienen una frecuencia de recombinación menor que 50% (y por definición, están separados menor que 50 cM en el mismo Grupo de Enlace) . Como se usa, en la presente descripción, el enlace puede ser entre dos marcadores, o alternativamente, entre un marcador y un fenotipo. Un locus marcador se puede "asociar con" (enlazado a) un rasgo, por ejemplo, resistencia a la roya tropical. Se mide el grado de enlace de un marcador molecular a un rasgo de fenotipo, por ejemplo, como una probabilidad estadística de cosegregacion de ese marcador molecular con el fenotipo.
El desequilibrio de enlace se evalúa más comúnmente con el uso de la medida r2, que se calcula con la fórmula descrita por Hill, W.G. y Robertson, A, Theor. Appl . Genet . , 38:226-231(1968). Cuando r2 = 1, DL dosis letal completo existe entre dos loci marcadores, significa que los marcadores no han sido separados por la recombinación y tienen la misma frecuencia del alelo. Los valores para r2 por encima de 1/3 indican un DL suficientemente fuerte para ser útil para el mapeo (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)). De este modo, los alelos están en desequilibrio de enlace cuando los valores de r2 entre loci marcadores entre pares son mayores o igual que 0.33, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, O 1.0.
Como se usa en la presente descripción, el "equilibrio de enlace" describe una situación donde dos marcadores segregan en forma independiente, es decir, clasifican entre la progenie en forma aleatoria. Los marcadores que muestran equilibrio de enlace se consideran desunidos (tanto si yacen sobre el mismo cromosoma o no) .
Un "locus" es una posición en un cromosoma en donde se localiza un gen o marcador.
El "logaritmo del valor de probabilidades (LOD, por sus siglas en inglés) " o "puntuación . LOD" (Risch, Science 255:803-804 (1992)) se usó como un mapeo del intervalo para describir el grado de enlace entre dos loci marcadores. Una puntuación de LOD de tres entre dos marcadores indica que el enlace es 1000 veces más probables que ningún enlace, mientras que un puntuación de LOD de dos indica que el enlace es 100 veces más probables que ningún enlace. Las puntuaciones de LOD mayores o iguales que dos pueden ser usadas para detectar enlace.
"Maíz" se refiere a una planta de Zea mays L. sesp. mays y es conocida, además, como maíz.
El término "planta de maíz" incluye: plantas completas de maíz, células vegetales de maíz, protoplasto de plantas de maíz, cultivos de células o tejido de maíz de los cuales se puede regenerar plantas de maíz, callos de plantas de maíz y células vegetales de maíz que están intactas en las plantas de maíz o en partes de plantas de maíz, tales como semillas de maíz, mazorcas de maíz, flores de maíz, cotiledones de maíz, hojas de maíz, tallos de maíz, brotes de maíz, raíces de maíz, puntas de raíces de maíz y similares.
Un "marcador" es una secuencia de nucleótidos o producto codificado de esta (por ejemplo, una proteína) que se usa como un punto de referencia. Un marcador puede ser derivado de una secuencia de nucleótidos genómica o de secuencias nucleotidas expresadas (por ejemplo, de un AR o un ADNc empalmado) , o de un polipéptido codificado. El término se refiere, además, a secuencias complementarias de ácido nucleico o flanqueando las secuencias del marcador, tales como ácidos nucléicos usados como sondas o pares de cebador capaces de amplificar la secuencia del marcador.
Los marcadores correspondientes a polimorfismos genéticos entre los miembros de la población se pueden detectar mediante los métodos bien establecidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, secuenciación de ADN, métodos de amplificación específica de secuencia basada en PCR, detección de polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLP por sus siglas en inglés) , detección de marcadores de isozima, detección de polimorfismos polinucleótido por medio de hibrización específica del alelo (ASH por sus siglas en inglés) , detección de secuencias amplificadas variables del genoma de la planta, detección de replicación de secuencia auto-sostenida, detección de Repeticiones de secuencia simple (SSRs por sus siglas en inglés) , detección de polimorfismos nucleotídicos simples (SNPs por sus siglas en inglés) , o detección de polimorfismos de longitud de fragmento amplificado (AFLPs por sus siglas en inglés). Los métodos bien establecidos son conocidos, además, para la detección de etiquetas de secuencia expresada (ESTs, por sus siglas en inglés) y marcadores SSR derivados de secuencias EST y ADN polimórfico amplificado aleatoriamente.
Un "alelo marcador" , alternativamente un "alelo de un locus marcador" , se puede referir a uno de una pluralidad de secuencias de nucleótidos polimórficas que se encuentran en un locus marcador en una población que es polimórfica para el locus marcador.
La "selección asistida por marcadores" (MAS, por sus siglas en inglés) es un proceso mediante el cual se seleccionan plantas a partir de los genotipos marcadores.
La "contraselección asistida por marcadores" es un proceso en el cual se usa genotipos marcadores para identificar las plantas que no se seleccionarán, lo que permite retirarlas de un programa de cultivo o siembra.
Un "locus marcador" es un lugar del cromosoma específico en el genoma de una especie en donde se puede encontrar un marcador específico. Un locus marcador se puede usar para seguir la presencia de un segundo locus enlazado, por ejemplo, un locus enlazado que codifica o contribuye a la expresión de rasgo fenotípico. Por ejemplo, un Locus marcador se puede usar para monitorear la segregación de alelos en un locus, tal como un gen o QTL, que están genética o físicamente enlazados al locus marcador.
Una "sonda marcadora" es una secuencia o molécula de ácido nucleico que puede usarse para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de locus marcador, a través de la hibridación de ácido nucleico. Las sondas marcadoras que comprenden 30 o más nucleótidos contiguos del locus marcador ("todas o una porción" de la secuencia de locus marcador) pueden usarse para la hibridación de ácido nucleico. Alternativamente, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que pueda distinguir (es decir, genotipo) el alelo en particular que está presente en un locus marcador. Los ácidos nucléicos son "complementarios" cuando "hibridizan" específicamente o, emparejan en solución, por ejemplo, de acuerdo con las reglas de emparejamiento basadas en atson-Crick .
El término "marcador molecular" puede usarse para referirse a un marcador genético, como se definió anteriormente, o un producto codificado de este (por ejemplo, una proteína) usada como un punto de referencia cuando se identifica un locus enlazado. Un marcador se puede derivar de secuencias nucleotídicas genómicas o de secuencias nucleotídicas expresadas (por ejemplo, de un ARN, un ADNc empalmado, etc.), o de un polipéptido codificado. El término se refiere, además, a secuencias de ácido nucleico complementarias o flanqueando las secuencias del marcador, tales como ácidos nucléicos usados como sondas o pares de cebador capaces de amplificar la secuencia del marcador. Uná "sonda marcadora molecular" es una secuencia de ácido nucleico, o molécula que se puede usar para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de locus marcador. Alternativamente, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que puede distinguir (es decir, genotipo) el alelo en particular que está presente en un locus marcador. Los ácidos nucleicos son "complementarios" cuando se hibridizan específicamente en solución, por ejemplo, de acuerdo con las reglas de emparejamiento basado en Watson-Crick. Algunos de los marcadores descritos, en la presente descripción se refieren, además, como marcadores de hibridización cuando están situados en una región indel, tal como, la región no colineal descrita, en la presente descripción. Esto es porque la región de inserción es, por definición, un polimorfismo directamente a una planta sin la inserción. Así, el marcador necesita solamente indicar si la región indel está presente o ausente. Cualquier tecnología adecuada de detección de marcador se puede usar para identificar el marcador de hibridización, por ejemplo la tecnología SNP se usa en los ejemplos proporcionados en la presente descripción.
La "roya tropical" es la enfermedad causada por el patógeno Physopella zeae ( ains) Cummins & Ramachar (sin. Angiopsora zeae Mains) . La enfermedad está caracterizada por la formación de pústulas amarillas redondas pequeñas sobre la superficie superior de la hoja del maíz. Estas pústulas urediales se encuentran, frecuentemente, en pequeños grupos y la capa epidérmica de la hoja cubre los urediniosporos de desarrollo. Los urediniosporos con forma de obovoide a elipsoide son liberados a través de una pequeña hendidura o poro que se forma en la capa epidérmica. Mientras que los urediniosporos casi no tienen color sus urediniosporos liberados dan a las pústulas una apariencia de color crema o blanco. Algunos genotipos de maíz muestran pústulas con una coloración más oscura (rojizo a púrpura) que acentúa los urediniosporos blanco/crema versus uno más tradicional. Una etapa telial, con ampolla como apariencia puede desarrollar, además, una formación posterior de etapa uredial. Las teliosporas (marrón a negro en color) pueden desarrollar dentro de la telia que forma alrededor de las pústulas urediales existentes. (Donald G. White, ed. 1999. Compendiu of corn diseases . Tercera edición. APS Press, ISBN 0-89054-234-1) .
"La roya del sur" es la enfermedad causada por el patógeno Puccinia polysora Underw. La enfermedad se caracteriza por pústulas amarillas redondas pequeñas que se forman primariamente en la superficie superior de la hoja, pero ocasionalmente atraviesa la superficie inferior de la hoja con espurulación uredial, más frecuentemente, encontrada adyacente a la costilla media de la hoja. Estas pústulas urediales contienen urediniosporos con forma obovoides a elipsoide, que típicamente son naranjas a rojizas en coloración. Las pústulas, frecuentemente, son redondas a oval en forma y se vuelven muy numerosas sobre la hoja. Este patógeno puede formar, además, pústulas urediales sobre las cascarillas de la mazorca, varilla de la mazorca y vainas de la hoja. Se conoce la existencia de la etapa telial, con teliosporos marrones oscuro a negro que se forman en telial, el cual encontró en una uredia existente en semicírculo a círculo .
"Secuencia nucleótida" , "polinucleótido" , "secuencia de ácido nucleico" y "fragmento de ácido nucleico" se usan de manera intercambiable y se refieren a un polímero de ARN o ADN que es mono o bicatenario que opcionalmente contiene bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas. Un '"nucleótido" es una unidad monomérica de la cual se construyen los polímeros del ADN o ARN, y consiste de una base de purina o pirimidina, una pentosa y un grupo de ácido fosfórico. Los nucleotidos (usualmente encontrados en su forma monofosfato 51) se refieren por su designación de única letra como sigue a continuación: "A" para adenilato o deoxiadenilato (para ARN. o ADN., respectivamente), "C" para citidilato o deoxicitidilato, "G" para guanilata o deoxiguanilata, "U" para uridilato, "T" para deoxitymidilato, "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina, y "N" para cualquier nucleótido.
Un fenograma es un diagrama que describe relaciones taxonómicas entre organismos basados en la similitud total de muchas características sin considerar la historia de evolución o significado asumido de caracteres específicos, usualmente generados por una computadora .
Los términos "fenotipo.", o "rasgo fenotípico" o "rasgo" se refiere a uno o más rasgos de un organismo. El fenotipo puede ser observable a simple vista, o por cualquier otro medio de evaluación conocida en la técnica, por ejemplo, microscopía, análisis bioquímico, o un ensayo electromecánico. En algunos casos, un fenotipo está controlado directamente por un simple gen o locus genético, es decir, un "rasgo de gen simple". En otros casos, un fenotipo es el resultado de varios genes .
Los "árboles filogenéticos" son diagramas que muestran las relaciones de evolución inferidas entre varias especies biológicas u otras entidades basadas en similitudes y diferencias en sus características genéticas y/o físicas. Se pueden construir mediante el uso de una variedad de métodos que incluyen pero no se limitan a los métodos de distancia de matriz, tales como sistema de vecino de unión o UPGMA, que calculan la distancia genética de los alineamientos de secuencia múltiple.
Un "Mapa físico" del Genoma es un mapa que muestra la orden lineal de marcas identificables (que incluyen genes, marcadores, etc.) en el cromosoma del ADN. Sin embargo, en contraste con los mapas genéticos, las distancias entre las marcas son absolutas (por ejemplo, medidas basándose en pares o aisladas y la superposición de fragmentos genéticos contiguos) y no basado en la recombinación genética.
Una "planta" puede ser una planta entera, cualquier parte de esta, o una célula o cultivo de tejido derivado de una planta. Así, el término "planta" puede referirse a cualquiera de las siguientes: plantas enteras, componentes u órganos de la planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), tejidos de la planta, semillas, células de la planta, y/o progenie de esta. Una célula vegetal es una célula de una planta, tomada de una planta, o derivada a través del cultivo de una célula tomada de una planta.
Un "polimorfismo" es una variación en el ADN que es muy común para darse, simplemente, debido a una nueva mutación. Un polimorfismo debe tener una frecuencia de al menos 1% en una población. Un polimorfismo puede ser un solo polimorfismo de nucleótido, o SNP, o un polimorfismo de inserción/deleción, también mencionado en la presente como un "indel" .
El "valor de probabilidad" o "valor-p" es la probabilidad estadística que la combinación particular de un fenotipo y la presencia o ausencia de un alelo marcador en particular es aleatoria. Así, cuanto menor sea la puntuación de probabilidad, mayor la probabilidad que un Fenotipo y un marcador particular co-segregarán. En algunos aspectos, la puntuación de probabilidad se considera "significativa" o "no significativa". En algunas modalidades, una puntuación de probabilidad de 0.05 (p=0.05, o una probabilidad del 5% ) de distribución aleatoria se considera una indicáción significativa de co-segregación. Sin embargo, una probabilidad aceptable puede ser cualquier probabilidad menor que 50% (p=0.5). Por ejemplo, una probabilidad significativa puede ser menor que 0.25, menor que 0.20, menor que 0.15, menor que 0.1, menor que 0.05, menor que 0.01, o menor que 0.001.
Cada marcador "PHM" representa dos conjuntos de cebadores (externos e internos) que cuando se usa en una PCR anidada, amplifican una pieza específica de ADN. El conjunto externo se usa en la primera ronda de PCR, después de la cual las secuencias internas se usan para una segunda ronda de PCR en los productos de la primera ronda. Esto incrementa la especificidad de la reacción. Todos los marcadores de PHM descritos en la presente descripción se listan en la Tabla 2, y la temperatura de apareamiento para estos cebadores es 55 °c.
Un "marcador de producción" o "marcador SNP de producción" es un marcador que ha sido desarrollado para propósitos de gran productividad. Los marcadores SNP de producción se desarrollaron para polimorfimos específicos identificados mediante el uso de marcadores PHM y el análisis de la PCR anidada (ver, por ejemplo, PHM1192-26-U en Tabla 1) . Los marcadores SNP de producción se destinaron para el uso con la plataforma Invader Plus® (Third Wave Technologies) .
Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para la comparación de secuencia. La secuencia de referencia se obtiene por medio de la genotipificación de una cantidad de líneas en el locus, el alineamiento de las secuencias de nucleotidos en un programa de alineamiento de secuencia, (por ejemplo Sequencher) , y, después, la obtención de la secuencia consenso. del alineamiento. De ahí que una secuencia de referencia identifica los polimorfismos en los alelos en un locus. Una secuencia de referencia no puede ser una copia de una real secuencia de ADN; sin embargo, es útil para diseñar los cebadores y sondas para los polxmorfirnos reales en el locus .
El término "progenie" se refiere a las crías generadas de un cruce .
Una "planta progenie" se genera de un cruce entre dos plantas .
El término "locus de rasgo cuantitativo" o "QTL (por sus siglas en inglés") se refiere a una región de ADN que está asociada con la expresión diferencial de un rasgo fenotípico en al menos un antecedente genético, por ejemplo, en al menos una población de mejora genética. Los QTL están estrechamente enlazados al gen o genes que son la base del rasgo en cuestión.
Una "prueba de cruzamiento" es una prueba de progenie derivada al cruzar cada parental con el mismo probador, usualmente una línea homocigota. Por medio de la prueba, el parental puede resultar en una variedad abierta polinizada, un cruzamiento, o una línea endogámica.
La frase "bajo condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda o polinucleótido hibridizará a una secuencia de ácido nucleico, típicamente, en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero esencialmente a ninguna otra secuencia. Las condiciones rigurosas son secuencias dependientes y serán diferentes en circunstancias diferentes.
Un "alelo desfavorable" de un marcador es un alelo marcador que segrega con el fenotipo de planta desfavorable, lo que proporciona, por lo tanto, el beneficio de identificar plantas que pueden eliminarse de un programa de cultivo o plantación.
Las secuencias más largas hibridizan, específicamente, a temperaturas más altas. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas para que estén aproximadamente entre 3-5 °C menor que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica en un pH de resistencia iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo pH, resistencia iónica definida y concentración de ácido nucleico) a la cual el 50% de las sondas complementarias al objetivo hibridizan a la secuencia objetivo en equilibrio (como las secuencias objetivo están,, presentes en exceso, en Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Las condiciones rigurosas serán aquellas en la cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente ion sodio 1.0 M, típicamente, aproximadamente 0.01 a 1.0 M concentración de ion sodio (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para sondas pequeñas (por ejemplo, 10 a 50 nucleotidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas grandes (por ejemplo, mayor que 50 nucleotidos) . Las condiciones rigurosas se pueden lograr, además, con la adición de agentes desestabilizantes tal como, formamida. Para hibridización específica o selectiva, una señal positiva es al menos dos veces hibridización de fondo, preferentemente, 10 veces hibridización de fondo. Las condiciones de hibridización rigurosas de muestra son, frecuentemente, 50% formamida, 5x SSC, y 1% SDS, incubación a 42 °C, o, 5x SSC, 1% SDS, incubación a 65 °C, con lavado en 0.2x SSC, y 0.1% SDS a 65 °C. Para PCR, una temperatura de aproximadamente 36 °C es típica para la amplificación de bajo rigor, aunque las temperaturas de apareamiento pueden variar entre aproximadamente 50 °C y 65 °C, según la longitud del cebador Se proporcionan guías adicionales para determinar los parámetros de hibridización en numerosas referencias.
Los alineamientos de secuencia y los cálculos de identidad porcentual se pueden determinar mediante el uso de una variedad de métodos de comparación designados para detectar las secuencias homologas, que incluyen, pero no limitan, al programa de MEGALIGN® de la gama de computación bioinformática de LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI) . A menos que se estipule lo contrario, alineamientos múltiples de las secuencias proporcionadas, en la presente descripción, se realizaron mediante el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)) con los parámetros predeterminados (PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN =10, PENALIZACION DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos entre pares y el cálculo de identidad porcentual de secuencias de proteína mediante el uso del método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN3 , WINDOW=5 y DIAGONALS SAVED=5. Para los ácidos nucléicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN5 , WINDOW=4 y DIAGONALES SALVADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias, mediante el uso del programa Clustal V, es posible obtener "identidad porcentual" y valores de "divergencia" al ver la tabla de las "distancias de secuencia" en el mismo programa, a menos que se estipule lo contrario, las identidades porcentuales y las divergencias prorpocionadas y reivindicadas, en la presente descripción se calcularon de este modo.
El "método de alineamiento Clustal V" corresponde al método de alineamiento marcado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al. (1992) Comput. Appl . Biosci . 8:189-191) y encontrado en el programa de MegAlign™ de la gama de computación bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . Para alineamientos múltiples, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN =10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE PENALIZACIÓN=10. Los parámetros predeterminados para alineamientos entre pares y cálculo de identidad porcentual de secuencias de proteína mediante el uso del método Clustal son KTUPLE=I, PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS =5. Para ácidos nucléicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN5, VENTANA=4 y DIAGONALES SALVADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias mediante el uso del programa Clustal V, es posible obtener una "identidad porcentual" al observar la tabla de las "distancias de secuencia" en el mismo programa.
Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook").
Antes de describir la presente descripción, deberá entenderse que esta descripción no está limitada a modalidades en particular. Se deberá entender, además, que la terminología usada, en la presente descripción es a los efectos de describir modalidades en particular, y no están destinadas a ser limitantes. Como se usa, en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas, los términos en el singular y las formas singulares "un" , "una" y "el/la" , por ejemplo, incluyen referentes plurales, a menos que el contenido claramente dicte lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "planta", "la planta" o "una planta", además, incluye una pluralidad de plantas. Según el contexto, el uso del término "planta" puede incluir, además, progenie idéntica o genéticamente similar de esa planta. El uso del término "un ácido nucleico" incluye, opcionalmente, muchas copias de esa molécula de ácido nucleico.
Resistencia a la roya tropical La resistencia a la roya tropical es una enfermedad fúngica del maíz causada por el patógeno Physopella zeae . La identificación de los marcadores moleculares y alelos asociados con la resistencia de la roya tropical permite la selección para la resistencia basada únicamente en la composición genética de la progenie. Los métodos para identificar y seleccionar las plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical a través de la evaluación de la composición genética (según la evaluación realizada mediante el uso de marcadores moleculares y sus alelos) se muestran, en la presente invención.
Mapeo genético Se ha reconocido durante un tiempo considerable que los loci genéticos específicos en correlación con los fenotipos en particular, tal como, la resistencia a la roya tropical, se pueden mapear en un genoma de organismo. El reproductor de la planta puede usar en forma ventajosa los marcadores moleculares para identificar los individuos deseados al identificar los alelos marcadores que muestran una probabilidad estadísticamente significativa de cosegregación con un fenotipo deseado, manifestado como desequilibrio de enlace. Al identificar un marcador molecular o agrupamientos de marcadores moleculares que cosegregan con un rasgo de interés, el reproductor puede seleccionar rápidamente un fenotipo deseado mediante la selección del alelo del marcador molecular adecuado (un proceso denominado selección asistida por marcador, o MAS) . Los marcadores podrían ser usados, además, por los reproductores para diseñar genotipos en silicio y practicar la selección total del genoma.
Una variedad de métodos reconocidos en la técnica están disponibles para detectar marcadores moleculares o agrupamientos de los marcadores moleculares que cosegregan con un rasgo cuantitativo tal como, resistencia a la roya tropical. La idea básica que fundamenta estos métodos es la detección de marcadores, pará lo cual los genotipos alternativos (o alelos) tienen fenotipos promedios significativamente diferentes. Así, uno hace una comparación entre los loci marcadores de la magnitud de la diferencia entre los genotipos alternativos (o alelos) o el nivel de significado de esa diferencia. Se infiere que los genes de rasgo están ubicados lo más cerca al (a los) marcador (es) que tienen la mayor diferencia genotípica asociada.
Estos dos métodos que se pueden usar para detectar los loci de interés son: 1) Análisis de asociación basado en la población y 2) análisis de asociación basado en el linaje (o mapeo de enlace tradicional) . En un análisis de asociación basado en la población, se obtienen líneas poblaciones pre-existentes con fundadores múltiples, por ejemplo, líneas de mejora genética de élite. Los análisis de asociación basados en la población confían en la desintegración del desequilibrio de enlace (DL dosis letal) y la idea que en una población no estructurada, solo las correlaciones entre los genes que controlan un rasgo de interés y los marcadores enlazados estrechamente a aquellos genes permanecerán después de muchas generaciones de apareamiento aleatorio. En realidad, la mayoría de las poblaciones pre-existentes tienen una subestructura de población. Así, el uso de un enfoque de asociación estructurada ayuda a controlar la estructura de población al distribuir individuos en poblaciones mediante el uso de información obtenida de los marcadores distribuidos aleatoriamente a través del genoma, de ese modo minimiza el desequilibrio debido a la estructura de población dentro de las poblaciones individuales (además denominadas subpoblaciones) . Los valores fenotípicos se comparan a los genotipos (alelos) en cada locus marcador para cada línea en la subpoblación. Una asociación de rasgo marcador significativa indica la proximidad estrecha entre el locus marcador y uno o más loei genéticos que se involucran en la expresión de ese rasgo.
Los mismos principios fundamentan los análisis de asociación basado en el linaje (además, referido como análisis de enlace tradicional) ; sin embargo, se genera la dosis letal (DL, por sus siglas en inglés) mediante la creación de una población de un número pequeño de fundadores. Se seleccionan los fundadores para maximizar el nivel de polimorfismo dentro de la población construida, y se evalúan sitios .polimórficos para su nivel de cosegregación con un fenotipo dado. Se han usado una cantidad de métodos estadísticos para identificar asociaciones significativas de rasgo marcador. El método es un enfoque de mapeo por intervalos (Lander y Botstein, Genetics 121:185-199 (1989), en el cual se prueba cada una de las muchas posiciones a lo largo de un, mapa genético (digamos a intervalos de 1 cM) por la probabilidad que un gen que controla una rasgo de interés se ubica en esa posición. Los datos del Genotipo/Fenotipo se usa para calcular por cada una de las posiciones de prueba una puntuación del registro de relación de probabilidad (LOD por sus siglas en ingles) . Cuando la puntuación del LOD excede un valor del umbral, existe una evidencia significativa para la ubicación de un gen que controla el rasgo de interés en esa posición en el mapa genético (el cual será entre dos loci marcadores en particular) .
La presente descripción proporciona los loci marcadores moleculares que muestran la cosegregación con la resistencia a roya tropical como se determinó por el análisis de enlace tradicional (Figura 3) . La detección de estos loci marcadores o loci marcadores enlazados adicionales se pueden usar en programas de mejora genética de maíz asistidos por un marcador para producir plantas con resistencia mejorada a la roya tropical o para eliminar las plantas con un fenotipo de roya tropical de los programas de mejora genética o plantación .
Marcadores asociados con la resistencia a la roya tropical Los marcadores asociados con la resistencia a la roya tropical se identifican en la presente descripción, dado que son alelos marcadores asociados con resistencia tanto disminuida como aumentada (mejorada) a la roya tropical. Los métodos incluyen la detección de la presencia de uno o más alelos marcadores asociados con la resistencia mejorada en una planta de maíz o germoplasma. La planta de maíz puede ser un híbrido o una línea endogámica.
El locus marcador se puede seleccionar de cualquiera de los loci marcadores proporcionados en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, marcadores de producción SNP PHM1192-26-U, PHM1192 -4 -U, C00435-802-U, C00436-801-U, PHM187-7-U, C00423 -801-U, PHM5028 -24 -U, PHM13818-15-U, PHM15721-39-U, PHM15721- 180-U, C00441-801-U, C00441-802-U, PHM4370-19-U, PH 731-107-U, C00071-01-U, PHM8249-21-U, C00428-801-U, PHM18427-13 -U, PHM9535 -10 -U, PHM9535-6-U, PHM9535-7-U, y PHM4003-13 | -U; los marcadores PHM, PHM15590, PHM13818, PHM1192, PHM187, PHM5028, PH 4370, PHM731, y PHM15721; Sub2e, Sub9d, Subl9c, Sub23m, C06621-1-K2, y C06621-1-K4, así como cualquier otro marcador enlazado a estos marcadores.
Ubicación del mapa físico del intervalo que comprende el gen de resistencia de la roya tropical Los elementos genéticos o genes que se localizan en un tramo lineal contiguo del ADN genómico en un solo cromosoma están físicamente enlazados.
La presente descripción proporciona los loci marcadores moleculares en un área de cromosoma 10 definido y que incluye PHM15590 y PHM15721, así se delinea una región que comprende un gen que confiere resistencia a la roya tropical. El PHM15590 se ubica en BAC C0497L12, y el PHM15721 se ubica en b0191E02. Cualquier polinucleótido que pueda hibridarse o ensamblarse al ADN contiguo entre e incluso la sec. con núm. de ident . : 89 (la secuencia de referencia para PHM15590) , o una secuencia de nucleótidos que es 95% idéntica a la sec. con núm. de ident.: 89 basada en el método de alineamiento Clustal V, y la sec . con núm. de ident.: 96 (la secuencia de referencia para PHM15721 o una secuencia de nucleótidos que es el 95% idéntica a la sec. con núm. de ident.: 96 basada en el método de alineamiento Clustal V, y que está asociado con la resistencia a la roya tropical se puede usar como marcador para la roya tropical. Esta región física abarca los loci marcadores que se muestran en la presente descripción, que se asocian con el rasgo de resistencia de la roya tropical.
La Figura 1 muestra la disposición del mapa físico de los B73 BAC secuenciados que componen el tramo contiguo del ADN entre e incluso el BAC C0497L12 y el BAC C0352E09. Las distancias (representadas por espacios abiertos) no son distancias en el tramo contiguo del ADN por sí, sino que son áreas donde la información de la secuenciación del genoma es incompleta .
Relaciones de enlace Una medida común de enlace es la frecuencia con la cual los rasgos se cosegregan. Esto se puede expresar como un porcentaje de cosegregación (frecuencia de recombinación) o en centiMorgans (cM) . cM es una unidad de medida de frecuencia de recombinación genética. Un cM es igual a 1% de probabilidad de que un rasgo en un locus genético será separado de un rasgo en otro locus debido al entrecruzamiento en una generación simple (significa que los rasgos segregan juntos el 99% del tiempo) . Dado que la distancia cromosomal es aproximadamente proporcional a la frecuencia de los casos entrecruzamiento entre rasgos, existe una distancia física aproximada que se correlaciona con la frecuencia de recombinación.
Los loci marcadores son rasgos por sí mismos y se pueden evaluar de conformidad con el análisis estándar de enlace por medio del seguimiento del loci marcador durante la segregación. Así, un cM es igual a 1% de probabilidad de que un locus marcador será separado de otro locus, debido al entrecruzamiento en una generación simple.
Cuanto más cercano se encuentre un marcador del gen, que controla un rasgo de interés, más eficaz y ventajoso es ese marcador como un indicador para el rasgo deseado. Los loci cercanamente enlazados muestran una frecuencia de entrecruzamiento entre el locus de aproximadamente 10% o menor, preferentemente, aproximadamente 9% o menor, aun, con mayor preferencia, aproximadamente 8% o menor, aun, con mayor preferencia aproximadamente 7% o menor, aun con preferencia aproximadamente 6% o . menor, aun con preferencia aproximadamente 5% o menor, aun con preferencia aproximadamente 4% o menor, aun con preferencia aproximadamente 3% o menor, y aun con preferencia aproximadamente 2% o menor . En modal. altamente preferidas, los loci relevantes (por ejemplo, locus marcador y un locus objetivo) muestran una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1% o menor, por ejemplo, aproximadamente 0.75% o menor, con mayor preferencia aproximadamente 0.5% o menor, o aun con mayor preferencia aproximadamente 0.25% o menor. Así, los loci son de aproximadamente 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0.75 cM, 0.5 cM o 0.25 cM o separadamente menor. En otras palabras, dos loci que están ubicados en el mismo cromosoma, y tal distancia que la recombinación entro dos loci ocurre a una frecuencia menor que 10% (por ejemplo, aproximadamente 9% , 8% , 7% , 6% , 5% , 4% , 3% , 2% , 1% , 0.75% , 0.5% , 0.25% , o menor) se consideran que están "próximos" el uno con el otro.
Aunque los alelos marcadores en particular pueden mostrar cosegregación con el fenotipo de la resistencia a la roya tropical, es importante observa que el locus marcador no es necesariamente parte de un gen o locus. QTL, responsable de • la expresión del fenotipo de la resistencia a la roya tropical. Por ejemplo, no es un requerimiento que la secuencia del polinucleótido marcador sea parte de un gen que imparte la resistencia a la roya tropical (por ejemplo, ser parte de una marco de lectura abierto del gen) . La asociación entre un alelo marcador específico con un fenotipo de la resistencia a la roya tropical tanto favorable como desfavorable se debe a la fase del enlace "acoplamiento" original entre el alelo marcador y el alelo fundador en la línea de maíz ancestral. Eventualmente, con recombinación repetida, los casos entrecruzamiento entre el locus marcado genético y el marcador pueden cambiar esta orientación, por esta razón, el alelo marcador favorable puede cambiar según la fase de enlace que existe dentro del parental resistente usada para crear las poblaciones de segregación. Esto no cambia el hecho que el marcador se puede usar para monitorear la segregación del fenotipo. Solamente cambia qué alelo marcador se considera favorable en una población de segregación dada.
Los marcadores proporcionados en la presente descripción, se pueden usar para predecir el estado del rasgo de resistencia a la roya tropical en una planta de maíz. Esto incluye cualquier marcador dentro de 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5,. 0.4, 0.3, 0.2, o 0.1 cM de cualquiera de los marcadores de producción SNP PHM1192-26-U, PHM1192-4-U, C00435-802-U, C00436- 801-U, PHM187-7-U, C00423-801-U, PHM5028 -24 -U, PH 13818 -15 -U, PHM15721-39-U, PHM15721-180-U, C00441-801-U, C00441-802-U, PHM4370-19-U, PHM731-107-U, C00071-01-U, PHM8249-21-U, C00428-801-U, PHM18427-13-U, PHM9535-10-U, PHM9535-6-U, PHM9535 -7-U, y PHM4003-13-U; los marcadores PHM, PHM15590, PHM13818, PHM1192, PHM187, PHM5028, PHM4370, PHM731, y PHM15721; y los otros marcadores identificados en la presente descripción, Sub2e, Sub9d, Subl9c, Sub23m, C06621-1-K2, y C06621-1-K4.
Intervalos cromosómicos Una variedad de métodos conocidos en la técnica están disponibles para identificar los intervalos cromosomales . Los límites de los intervalos cromosomales están delineados para abarcar los marcadores que estarán unidos al gen que controla el rasgo de interés. En otras palabras, el intervalo cromosomal está delineado de manera tal que cualquier marcador que yace dentro del intervalo (incluyen los marcadores terminales que definen los límites del intervalo) se puede usar como marcadores para la resistencia a la roya tropical .
Se proporcionan los intervalos cromosomales que abarcan los marcadores que cosegregan con la resistencia a la roya tropical. Estos intervalos se ubican en el cromosoma 10 y se pueden definir e incluir: (i) PHM15590 y PHM9535; (ii) PHM15590 y PHM15721; (iii) C00441 y C00428; (iv) PHM731 y PHM15721; O (v) C00071 y PHM731.
Cualquier marcador ubicado dentro de cualquiera de estos intervalos puede ser útil como un marcador para resistencia a la roya tropical .
Los intervalos cromosomales se pueden definir, además, por los marcadores que están enlazados a un marcador QTL (muestra el desequilibrio del enlace) , y r2 es una medida común del desequilibrio del enlace (LD por sus siglas en inglés) en el contexto de estudios de asociación. Si el valor de r2 de LD entre un locus marcador del cromosoma 10 que se sitúa dentro del intervalo del PHM15590 y PHM9535, por ejemplo, y otro locus marcador del cromosoma 10 en una proximidad cercana es mayor que 1/3 (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)), los loci están" en desequilibrio de enlace con otro.
Alelos marcadores y combinaciones haplotípicas Un marcador de la invención puede ser, además, una combinación de alelos en uno o más loci marcadores (es decir un haplotipo) . Los alelos descritos más abajo se podrían usar solos o en combinación para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical.
Los alelos favorables asociados con la resistencia mejorada a la roya tropical se han identificado en la presente descripción. El alelo es una deleción. "T" en la posición 16 de PHMTR (sec. con núm. de ident . : 155) . La Figura 7 muestra una parte de la secuencia de referencia (Parte superior) obtenida por la genotipificación de las líneas de maíz resistentes y susceptibles a la roya tropical mediante el uso de cebadores PCR (sec. con núm. de ident. : 133 y 134) diseñados para el clon ID Ct9050c064Gllc (Tabla 9). sec. con núm. de ident . : 137-142 que representan araplicones obtenidos de las líneas susceptibles mientras que la sec. con núm. de ident.: 143-154 representa amplicones obtenidos de las líneas susceptibles. El área resaltada en gris representa una región 21 bp de la secuencia de referencia (referida como PHMTR; sec. con núm. de ident.: 155) . Las líneas de maíz que tienen una delecion T en bpl6 de PHMTR (indicada por la flecha) todas muestran una resistencia a la roya tropical. Todas las líneas de maíz que tienen una región PHMTR intacta mostraron sensibilidad a la roya tropical.
Las Tablas 7 y 8 muestran, además, los marcadores del cromosoma 10 que se han usado exitosamente en combinación para convertir las líneas endogámicas susceptibles en líneas endogámicas resistentes por medio del uso de PHS6Y como la fuente. PHS6Y posee alelos en cada uno de los marcadores que se pueden usar en combinación (como un haplotipo) para identificar y seleccionar plantas con resistencia a la roya tropical .
En tanto que un haplotipo asociado con una resistencia mejorada a la roya tropical puede comprender cualquiera de los alelos favorables descritos en la presente descripción, (incluso la delecion "T" en la posición 16 de PHMTR y cualquiera de los alelos marcadores que tiene la línea resistente PHS6Y en las Tablas 7 y 8) , el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia sec. con núm. de ident.: 167 se mostró que está asociada con la resistencia mejorada a la roya tropical y se puede usar en un programa de selección asistido por un marcador para seleccionar plantas de maíz con la resistencia mejorada a la roya tropical.
El especialista calificado desearía que hubiera sitios polimórficos adicionales en los loci marcadores en y alrededor de los marcadores del cromosoma 10 en la presente descripción, en donde uno o más sitios polimórficos están en desequilibrio de enlace (LD, por sus siglas en inglés) con un alelo en uno o más de los sitios polimórficos en el polimórficos en el haplotipo. Se consideran que dos alelos en particular en diferentes sitios polimórficos diferentes están en LD, si la presencia del alelo en uno de los sitios tiende a predecir la presencia del alelo en el otro sitio en el mismo cromosoma (Stevens, Mol. Diag. 4:309-17 (1999) ) .
El especialista calificado entendería que la frecuencia alélica (y de este modo, la frecuencia del haplotipo) puede diferir de un acervo de germoplasma a otro. Los acervos de germoplasma varían debido a las diferencias de madurez, agrupamientos heteróticos, distribución geográfica, etc. Como resultado, SNP y otros polimorfismos no pueden ser informativos en algunos acervos de germoplasmas .
Selección asistida por marcadores Los marcadores moleculares se pueden usar en una gran variedad de aplicaciones de mejora genética de plantas (por ejemplo, véase Staub et al., (1996) Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Repórter. 1: 3-8). Una de las principales áreas de interés es aumentar la eficiencia de genes de introgresión y retrocruzamiento por medio del uso de la selección asistida por marcador (MAS, por sus siglas en inglés) . Un marcador molecular que muestra el enlace con un locus que afecta un rasgo fenotípico deseado proporciona una herramienta útil para la selección del rasgo en una población de planta. Esto es, particularmente, verdadero donde el fenotipo es difícil para estudio de ensayo, por ejemplo muchos rasgos de resistencia a enfermedades, o, sucede en la última etapa en el desarrollo de la planta, por ejemplo las características del grano. Dado que los ensayos del marcador del ADN son menos trabajosos y ocupan menos espacio físico que el fenotipado de campo, se pueden ensayar poblaciones mucho más grandes, al incrementar las probabilidades de encontrar un recombinante , con el segmento objetivo de la línea del dador desplazado a la línea del receptor, cuanto más cercano es el enlace, más útil es el marcador, porque la recombinación es menos probable que ocurra entre el marcador y el gen que ocasiona el rasgo, el cual puede resultar en falsos positivos. Los marcadores flanqueantes han disminuido las probabilidades que una selección de falso positivo suceda dado que se requeriría un caso de recombinación doble. La situación ideal es tener un marcador en el gen propiamente el, de manera tal que la recombinación no pueda suceder entre el marcador y el gen. El marcador se denomina "marcador perfecto" .
Cuando un gen se introgresa por MAS, no es solamente el gen que se introduce sino que además las regiones de flanqueo (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790). Esto es conocido como "arrastre de enlace." En el caso que la planta dadora no esté altamente relacionado a la planta receptora, estas regiones flanqueantes llevan genes adicionales que puede codificar los rasgos. agronómicamente indeseables. Este "arrastre de enlace" puede resultar, además, en rendimiento reducido u otras características agronómicas negativas aun, después, de ciclos múltiples de retrocruzamiento en la línea élite de maíz. Estos se refiere a veces, además, como "arrastre de rendimiento" . El tamaño de la región de flanqueo se puede disminuir por medio del retrocruzamiento adicional aunque no siempre es exitoso, dado que los productores no tienen control sobre el tamaño de la región o los puntos de ruptura de la recombinación (Young et al. (1998) Genetics 120:579-585). En la mejora genética clásica, usualmente, es solo por casualidad que las recombinaciones se seleccionan y que contribuyen a una reducción en el tamaño del segmento del dador (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257-264). Aún después de 20 retrocruzamientos en retrocruzamientos de este tipo, uno puede esperar encontrar un elemento considerable del cromosoma dador aún enlazado al gen que se selecciona. Con los marcadores, sin embargo, es posible seleccionar aquellos raros individuos que han experimentado la recombinación cerca del gen de interés. En 150 plantas con retrocruzamiento, existe un 95% de probabilidad que al menos una planta habrá experimentado un entrecruzamiento dentro 1 cM del gen, basado en la distancia del mapa de meiosis simple. Los marcadores darán lugar a una identificación inequívoca de esos individuos . con retrocruzamiento adicional de 300 plantas, habría un 95% de probabilidad de un entrecruzamiento dentro de la distancia de 1 cM del mapa de meiosis simple del otro lado del gen, así se genera un segmento alrededor del gen objetivo menor que 2 cM basado en una distancia en el mapa de meiosis simple. Esto se puede llevar a cabo en dos generaciones con marcadores, mientras que se habría requerido en promedio 100 generaciones sin marcadores. (Ver Tanksley et al., supra) . Cuando la ubicación exacta de un gen es conocida, una serie de marcadores flanqueantes que rodean el gen se puede usar para seleccionar las recombinaciones en tamaños de población diferente. Por ejemplo, en tamaños de población más pequeñas, se puede esperar que las recombinaciones estén más aun lejos del gen, por lo tanto más marcadores flanqueantes distales se requerirían para detectar la recombinación.
La disponibilidad de mapas de enlace integrados del genoma del maíz que contienen densidades aumentadas de marcadores públicos del maíz ha facilitado el mapeo genético del maíz y MAS. Ver, por ejemplo, los mapas IBM2 vecinos, que están disponibles en línea en el sitio web MaizeGDB.
Los componentes claves para la implementación de MAS son: (i) definir la población dentro de la cual se determinará la asociación rasgo marcador, la cual puede ser una población segregante, o una población aleatoria o estructurada; (ii) monitorear la segregación o asociación de marcadores polimórficos en relación al rasgo, y determinar el enlace o asociación por medio del uso de métodos estadísticos; (iii) definir un conjunto de marcadores deseables en base a los resultados del análisis estadístico, y (iv) el uso y/o extrapolación de esta información al conjunto corriente del germoplasma de la mejora genética para permitir que se tomen decisiones de selección basadas en el marcador. Los marcadores descritos en esta descripción, así como otros tipos de marcadores tales como SSR y FLP, se pueden usar en los protocolos de selección asistida por marcador .
Los SSR se pueden definir como corridas cortas relativamente repetidas de ADN en tándem con longitudes de 6 bp o menor (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; ang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6) Los polimorfismos surgen debido a la variación en la cantidad de unidades de repetición, probablemente causada por el deslizamiento durante la replicación de ADN (Levinson y Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221). La variación en la longitud de repetición se puede seleccionar por medio del diseño de cebadores PCR a las regiones flanqueantes no repetitivas conservadas (Weber y May (1989) Am J Hum Genet. 44:388-396). Los SSR son altamente adecuados para el mapeo y MAS dado que son codominantes multialélicos , reproducibles y susceptibles a la alta automatización de productividad. (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants . En: Non-marañalian genomic analysis: a practical guide. Academic press . págs . 75-135).
Varios tipos de marcadores SSR se pueden generar, y los perfiles SSR de las líneas resistentes se pueden obtener por medio de electroforesis en gel de los productos de amplificación. El puntaje del genotipo marcador está basado en el tamaño del fragmento amplificado. Un servicio SSR para maíz está disponible al público en función a bases contractuales por medio de puntos de referencia del ADN en Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá.
Además, varios tipos de marcadores FLP se pueden generar. Los cebadores de amplificación más comunes se usan para generar polimorfismos de longitud del fragmento. Los marcadores FLP son en muchos modos similares a los marcadores SSR, excepto que la región amplificada por los cebadores no sea, típicamente, una región altamente repetitiva. Aun, la región amplificada, o amplicón, tendrá variabilidad suficiente entre los germoplasmas , frecuentemente, debido a las inserciones o deleciones, de manera tal que los fragmentos generados por los cebadores de amplificación se puedan distinguir entre los individuos polimórficos , y se conoce que los indels ocurren, frecuentemente, en maíz (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002b) , más arriba) .
Los marcadores detectan sustituciones de un solo par de nucleótidos. De todos los tipos de marcador molecular, los SNP son los más abundantes, así tienen el potencial de proporcionar la resolución más alta del mapa genético (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539-547) . Se puede realizar ensayos a los SNP en un nivel aun más altos de productividad que los SSR, en un modo así denominado "productividad ultra-rápida" , dado que no requieren grandes cantidades de ADN y la automatización del ensayo puede ser directa. Los SNP prometen ser, además, sistemas de costos relativamente bajos. Estos tres factores en conjunto hacen que los SNP sean altamente atractivos para el uso en MAS.
Varios métodos están disponibles para la genotipificación de SNP, que incluyen, pero no se limitan a, hibridización, extensión del cebador, ligación de oligonucleótido, clivaje de nucleasa, esferas codificadas y de minisecuencia . Se han revisado los métodos en Gut (2001) Hum Mutat 17 págs . 475-492; Shi (2001) Clin Chem 47, págs. 164-172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, págs. 95-100; Bhattramakki y Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants . En: R. J. Henry, Ed, Plant Genotypingr; The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford. Una amplia variedad de tecnologías comercialmente disponibles usan estos y otros métodos para interrogar los SNP que incluyen Masscode.TM. (Qiagen) , Invader.RTM. (Third Wave Technologies), SnapShot . RTM . (Applied Biosystems) , Taqman.RTM. (Applied Biosystems) , KASPar assays by Kbioscience, and Beadarrays . TM . (Illumina) .
Una cantidad de SNP en conjunto dentro de una secuencia, o a través de secuencias enlazadas, se puede usar para describir un haplotipo para cualquier genotipo en particular (Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 págs. Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329-333). Los haplotipos pueden ser más informativos que los SNP simples y puede ser más descriptivos que cualquier genotipo en particular. Por ejemplo un SNP simple puede ser un alelo "T" para una línea específica o variedad con resistencia mejorada a la roya tropical, pero el alelo "T" podría ocurrir, además, en la población de mejora genética del maíz, usado para parentales recurrentes. En este caso un haplotipo, por ejemplo una serie de alelos en marcadores SNP enlazados pueden ser más informativos. Una vez que un haplotipo único se ha asignado a una región cromosomal dadora, ese haplotipo se puede usar en esa población o cualquier subconjunto de esta para determinar si un individuo tiene un gen en particular. Ver, por ejemplo WO2003054229. El uso de plataformas automatizadas conocidas de detección de marcador de alta productividad para personas con conocimiento ordinario en la técnica hace que este proceso sea altamente eficiente y eficaz.
Muchos de los cebadores listados en la Tabla 2 se pueden usar, rápidamente, como marcadores FLP para seleccionar el locus del gen o QTL en el cromosoma 10 que controla la resistencia a la roya tropical, debido a la presencia de polimorfismos de inserciones/deleción. Estos cebadores se pueden usar, además, para convertir estos marcadores a SNP u otros marcadores equivalentes funcional o estructuralmente similar (SSR, CAP, indels, etc) , en las mismas regiones. Un enfoque muy productivo para la conversión para SNP se describe en Rafalski (2002a) Current opinión in plant biology 5 (2) : 94-100 y, además, en Rafalski (2002b) Plant Science 162: 329-333. Mediante el uso de PCR, los cebadores se usan para amplificar los segmentos de ADN de los individuos (preferentemente línea endogámica) que representan la diversidad en la población de interés. Los productos de PCR se secuencian directamente en una o ambas direcciones. Las secuencias resultantes están alineadas y se identifican los polimorfismos. Los polimorfismos no están limitados a polimorfismos de nucleótido simple (SNP, por sus siglas en inglés) , pero, además, incluyen indels, CAPS, SSR y TR (número variable de repeticiones en tándem.). Específicamente con respecto a la.- información de la cartografía fina descrita en la presente descripción, uno puede usar, rápidamente, la información proporcionada en la presente descripción para obtener SNP polifórmicos adicionales (y otros marcadores) dentro de la región amplificada por los cebadores listados en esta descripción. Los marcadores dentro de la región del mapa descrito se pueden hibridizar a los BAC u otras genotecas genómicas, o alineadas electrónicamente con las secuencias del genoma para encontrar nuevas secuencias en la misma ubicación aproximada como los marcadores descritos.
Además de los SSR, FLP y SNP, como se describió anteriormente, otros tipos de marcadores moleculares son ampliamente usados, además, que incluyen pero no se limitan a, las etiquetas de secuencias expresadas (EST, por sus siglas en inglés) , marcadores SSR que derivan de las secuencias EST, ADN polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD, por sus siglas en inglés) , y otros marcadores basados en el ácido nucleico.
Los perfiles de isoenzima y las características morfológicas enlazadas se pueden, en algunos casos, usar indirectamente, además como marcadores. Aun aunque no detectan directamente diferencias en el ADN son influenciados, frecuentemente, por diferencias específicas genéticas. Sin embargo, los marcadores que detectan la variación de ADN son mucho más numerosos y polimórficos que la isoenzima o marcadores morfológicos (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Repórter 1:3-8) .
Los alineamientos de secuencia o cóntigos, se pueden usar, además, para encontrar secuencias corriente arriba o corriente abajo de los marcadores específicos listados en la presente descripción. Estas nuevas secuencias, próximas a los marcadores descritos en la presente descripción, se usan, por lo tanto, para descubrir y desarrollar marcadores funciohalmente equivalentes. Por ejemplo, los mapas diferentes genéticos y/o físicos se alinean para localizar los marcadores equivalentes no descritos dentro de la presente descripción pero ' están dentro de las regiones similares. Estos mapas pueden estar dentro de las especies de maíz, o aun a través de otras especies que se han alineado física o genéticamente con el maíz, tales como arroz, trigo, cebada o sorgo.
Generalmente, MAS usa marcadores polimórficos que se han identificado al tener una probabilidad significativa de cosegregación con la resistencia a la roya tropical. Se supone que los marcadores mapean cerca de un gen o genes que dan a la planta su fenotipo de resistencia a la roya tropical, y se consideran indicadores para el rasgo deseado, o marcadores. Se realizan pruebas a las plantas por la presencia de un alelo deseado en el marcador, y se espera que las plantas que contienen un genotipo deseado en uno o más loci transfieran el genotipo, junto con un fenotipo deseado, a su progenie .
Los marcadores e intervalos presentados en la presente descripción encuentran un uso en MAS para seleccionar las plantas que muestran la resistencia mejorada a la roya tropical.
Los métodos para la selección pueden incluir la detección de la presencia (o ausencia) de tanto un alelo marcador identificado o un alelo marcador desconocido que está enlazado y asociado con un alelo marcador identificado en una planta de maíz o germoplasma y después, la selección de la planta de maíz o germoplasma en el alelo detectado. Los alelos favorables identificados en la presente descripción, que se podrían detectar en MAS incluyen: la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR y cualquiera de los alelos marcadores que tiene PHS6Y en las Tablas 7 y 8. Adicionalmente , los haplotipos favorables, tal como, el haplotipo "GAG" en la posiciones 337-339 de la secuencia de referencia de la sec . con núm. de ident.: 167, pueden ser usados, además, en MAS para introducir la resistencia mejorada a la roya tropical en las líneas de maíz susceptibles o en las variedades.
Utilidad de MAS para la Resistencia Mejorada a la Roya Tropical en el Maíz Los productores de la planta de maíz prefieren las combinaciones de los loci genéticos deseados, tales como aquellos alelos marcadores asociados con la resistencia mejorada de la roya tropical, con genes para el alto rendimiento y otros rasgos deseables para desarrollar las variedades de maíz incrementadas. El análisis de grandes números de muestras por medio de métodos no moleculares (por ejemplo, la evaluación de rasgo en las plantas de maíz) pueden ser costosos, consumen tiempo y resultan no confiables. El uso de marcadores polimórficos descritos en la presente descripción, cuando están enlazados genéticamente a la resistencia a los loci de la roya tropical, proporcionan un método eficaz para seleccionar las variedades con resistencia mejorada a la roya tropical en programas de mejora genética. Por ejemplo, una ventaja de la selección asistida por marcador en las evaluaciones de campo para la selección de plantas que han mejorado la resistencia a la roya tropical es que MAS se puede realizar en cualquier momento del año, sin considerar la estación de crecimiento. Además, los efectos ambientales son ampliamente irrelevantes para la selección asistida por marcador.
Otro uso de MAS en la mejora genética de la planta es asistir a la recuperación del genotipo parental recurrente por medio de la mejora genética mediante el retrocruzamiento . La mejora genética mediante el retrocruzamiento es el proceso de volver a cruzar la progenie a uno de su(s) línea (s) parental o parentales . El retrocruzamiento se efectúa, usualmente, con el propósito de introgresar uno o unos pocos loci del parental dador (por ejemplo, un parental que comprende una resistencia mejorada al loci marcador de la roya tropical) en un contexto genético deseable del parental recurrente de otro modo (por ejemplo, una línea de maíz de alto rendimiento de otro modo) . Cuanto más ciclos de retrocruzamientos se hagan, habrá mayor contribución genética del parental recurrente a la variedad introgresada resultante. Esto es necesario, frecuentemente, porque las plantas pueden ser, de otra manera, indeseables, por ejemplo, debido al bajo rendimiento, baja fecundidad, o similar. En oposición, las cepas que son el resultado de los programas intensivos de mejora genética pueden tener un rendimiento y fecundidad excelente o similar, simplemente al ser deficiente en un rasgo deseado tal como la resistencia a la roya tropical.
El MAS · puede aumentar la eficiencia de una introgresión o esfuerzo de retrocruzamiento destinado a introducir la resistencia mejorada a la roya tropical en un contexto deseado (rendimiento típicamente alto) . En un retrocruzamiento asistido por marcador de marcadores específicos de una fuente dadora, por ejemplo, un contexto genético exótico o élite, uno selecciona entre la progenie del retrocruzamiento para el rasgo del dador y, después, usa retrocruzamiento repetido a la línea exótica o élite parea reconstituir el máximo genóma de contexto exótico/elite posible.
Metodología de agrupamiento en etapas múltiples Una metodología de agrupamiento en etapas múltiples se puede usar para dirigir el diseño del cebador en una variación no aleatoria. Este método usa los árboles filogenéticos y un proceso de alineamiento secuencial para identificar las regiones únicas que contienen variaciones alélicas exclusivas de las líneas con un rasgo deseado. Si cualquiera de las secuencias dadas en una colección de BAC contiene una variación en el ADN que se relaciona a un rasgo, esta variación se puede ocultar/confundir por otras variaciones aleatorias e independientes dentro del mismo BAC, por lo tanto, una alineamiento simple no puede ser eficaz para detectar la(s) variación (es ) focalizadas. La primera etapa de este proceso incluye un alineamiento de secuencias crudas con una relación de costo extensión abierta mayor que 10. La segunda etapa consiste en cortar las colas (ruido) y de realinear la secuencia original, cuyo agrupamiento ya indicará el potencial BAC para tener una región de interés. Las etapas subsiguientes consisten en recorte corriente arriba o corriente abajo de variación alélica aleatoria, es decir, alelos dentro de la secuencia que mostraron diversidad a través de cualquier fenotipo. El UPGMA, por sus siglas en inglés (Método de Grupo Par no Ponderado con Media Aritmética) se puede aplicar, después, al alineamiento resultante hasta que un fenograma identifica un agrupamiento único exclusivo de la líneas que tienen un fenotipo o rasgo deseado. El agrupamiento final se puede usar, después, para identificar la variación específica que será usada para el diseño del cebador para generar un marcador específico de rasgo.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no se limitan a, las reivindicaciones anexas. Se entiende qué los ejemplos y las modalidades descritas en la presente descripción, son solo para propósitos ilustrativos y que las personas idóneas en la técnica reconocerán varios reactivos o parámetros que se pueden alterar sin apartarse del espíritu de la invención o el alcance de las reivindicaciones anexas.
Ejemplo 1 Evaluación Fenotípica de Resistencia Mejorada a la Roya Tropical y del Sur Las plantas de maíz se inocularon en el campo con Physopella zeae para promover los síntomas de la roya tropical. Se iniciaron tres inoculaciones en la etapa VIO (cada una de las inoculaciones con -500,000 esporas por mi a un volumen total of 200 litros por hectárea) .
Se evaluaron las plantas de maíz por resistencia mejorada a la roya del sur (patógeno Puccinia polysora) basadas en las condiciones de infección natural en un campo ubicado en Itumbiara, Brasil La roya tropical desarrolla desde la parte superior de la planta a la parte inferior de esta, mientras que la roya del sur se desplaza desde la parte inferior de la planta a la parte superior. Así, en la misma planta, es posible observar los síntomas de ambas enfermedades roya tropical y del sur.
Se usaron dos sistemas para puntuar las plantas en el campo en la etapa R2 (alrededor de 20 días después del tiempo de polinización) . El primer sistema está en una escala de 1 a 9, donde l = más susceptible y 9 = más resistente, mientras que el segundo sistema corresponde a la Escala Estándar Internacional Modificada para la Roya (Tabla 4) .
Tabla 4 : Escalas de Puntuación para la Roya Tropical y del Ejemplo 2 Desarrollo de la población de la línea endogámica PHS6Y.
El PHS6Y se desarrolló por medio del uso de un esquema de reacción de selección de linaje en el Centro de Investigación de Itumbiara en Brasil. Se seleccionaron las mazorcas en la generación F2 de un cruce entre PH7W3 y CML339. El CML339 (Makurabi et al. Combining Ability and Heterosis in Tropical Maize Inbreds under Stress and Optimal Conditions. The ASA-CSSA-SSSA International Annual Meetings (6-10 noviembre de 2005), Salt Lake City, UT.2005) es una línea con resistencia mejorada a la roya tropical que se obtuvo del Centro Internacional de Mejora de Trigo y Maíz (CIMMYT por sus siglas en inglés) . Cada mazorca F2 seleccionada se plantó como una hilera F3 en la siguiente generación. Tres mazorcas de cada hilera seleccionada F3 se plantaron, después, en la próxima generación, y la mejor hilera F4 se seleccionó y la semilla designada como semilla de línea endogámica PHS6Y. Todas las selecciones se llevaron a cabo en función al fenotipo de la resistencia a la roya tropical .
Ejemplo 3 La segregación para la Resistencia a la Roya Tropical indica que un Gen Simple Dominante es responsable de Conferir la Resistencia a la Roya Tropical.
Una población F2 se desarrolló de un cruzamiento entre PH468, una línea endogámica susceptible a la roya tropical, y PHS6Y , la línea endogámica identificada en el EJEMPLO 2. Se muestra en las Figuras 2A y 2B, respectivamente, las distribuciones de frecuencia que demuestran las puntuaciones de la roya tropical y del sur para individuos en la población F2 PH468 x PHS6Y. Cada distribución indica un coeficiente de segregación de 3 resistentes (puntajes = 5 en la escala de 1-9) : i susceptible (puntaje < 5 en la escala de 1-9) para la roya tropical (Figura 2A) y para la roya del sur (Figura 2B) .
La Tabla 5 muestra una prueba chi-cuadrado que proporciona evidencia que justifica la presencia de un gen simple dominante que confiere resistencia a la roya tropical, en donde el genotipo favorable está presente en la línea endogámica de PHS6Y. Los resultados muestran, además, que un gen simple dominante confiere resistencia a la roya del sur. Sin embargo, basado en las frecuencias de recombinación genética entre la resistencia tropical y del sur en dos poblaciones F2 en la cual PHS6Y es un parental, los genes que confieren resistencia parecen ser diferentes para la roya tropical y del sur (Tabla 6) .
Tabla 5 Resultados de Prueba Chi-cuadrado para la Población F2 PH468XPHS6Y.
Población PH468/PHS6Y Puntaje de la roya tropical .
# Plantas Valor P CHI-Cuadrado <5 >5 Observado 305 84 0.128 2.321 Esperado 292 97 Puntaje de la Roya del Sur # Plantas Valor P CHI-Cuadrado <5 >5 Observado 298 91 0.482 0.494 Esperado 292 97 La Tabla 6 muestra las frecuencias de recombinación genética entre la resistencia tropical y del sur en dos poblaciones F2 con PHS6Y. El control es otra población F2 donde ambos rasgos de la roya tropical y del sur se están segregando, además, pero de un modo independiente .
Tabla 6.
Recombinación genética Entre la Resistencia Tropical y Del Sur en dos Poblaciones F2 con PHS6Y como un Parental rH 4-> A 0 ñ B 4-> B 0 0 ? w u rH 1) Pi Cu Población F2 =8= 3t o\o 468/S6Y 13 389 3 467/S6Y 18 341 5 Control (7513/26N) 126 342 37 468 = PH468; S6Y = PHS6Y; 467 = PH467 Ejemplo 4 Mapeo por intervalo Compuesto Se realizó un enfoque de mapeo por intervalos compuesto que combina un mapeo por intervalo con regresión lineal para identificar los intervalos cromosomales de maíz y los marcadores asociados con la resistencia a la roya tropical. En un enfoque de mapeo por intervalo (Lander y Botstein, Genetics 121:185-199 (1989)), se prueba cada una de las muchas posiciones a lo largo del mapa genético (digamos a intervalos de 1 cM) por la probabilidad de que un gen o QTL que controla un rasgo de interés esté ubicado en esa posición. Los datos- de genotipo/fenotipo se usan para calcular por cada posición de prueba un puntaje de LOD (por sus siglas en inglés) (registro de relación de probabilidad) . Cuando el puntaje de LOD excede el valor del umbral (en la presente descripción, el valor umbral es 2.5), existe una evidencia significativa para la ubicación de un gen o QTL en esa posición en el mapa genético (el cual estará entre dos loci marcadores en particular) .
Se usó el Windows QTL Cartógrafo (se usó la versión más actualizada de este software en la fecha del mapeo QTL) para llevar a cabo el mapeo por intervalo compuesto. Se estimaron los puntajes de LOD (logaritmo del cociente de probabilidades) a través del genoma de conformidad con los procedimientos estándares de mapeo QTL.
Se muestra en la Figura 3 los resultados del mapeo por intervalo compuesto para la resistencia a la roya tropical por medio del uso de la población F2 PH468 x PHS6Y. El análisis de mapeo por intervalo compuesto detectó un gran efecto QTL en el cromosoma 10 (Figura 3) ubicada entre los marcadores C00441-801 y C00428-801. El mapa de enlace usado para el mapeo por intervalo compuesto era un mapa genético propio derivado internamente (identificado en la presente descripción, como "PHB") para lo cual las distancias genéticas corresponden a fracción de recombinación meiosis single. Las posiciones del marcador en el eje-x corresponden al mapa genético PHB. El eje-y representa el puntaje LOD.
Ejemplo 5 El retrocruzamiento de la resistencia al locus de la roya tropical de PHS6Y en las Líneas Endogámicas Susceptibles.
Se seleccionó la línea endogámica resistente a la roya tropical PHS6Y como el parental dador para el programa de retrocruzamiento. Esta línea endogámica lleva una alelo favorable dentro del segmento de cromosoma 10 que alberga el gen de la roya tropical. En el programa inicial de retrocruzamiento, se eligieron cuatro líneas endogámicas (PH9VF, PHDGA, PH467 y PHOTJ) para convertirlas con el locus de resistencia de la roya "tropical del PHS6Y.
Se cruzó cada línea endogámica ( PH9VF, PHDGA, PH467 y PHOTJ) a PHS6Y. Después de obtener una semilla Fl de cada cruzamiento, se realizaron cinco retrocruzamientos subsiguientes en los cuales se usó el parental susceptible como parental recurrente. Se evaluaron dos generaciones al año para acelerar el proceso, uno en el Norte de Brasil en la localidad Balsas Winter Nursery y la otra en el Centro de Investigación Itumbiara. En el primer retrocruzamiento, se realizó solo la selección fenotípica en el centro de Itumbiara. En los retrocruzamientos subsiguientes, se realizó la selección asistida por marcador. Dos generaciones de autofecundación siguieron al proceso de retrocruzamiento para fijar el alelo resistente en cada línea endogámica.
Se usaron tres de seis marcadores en el proceso de convertir cada línea endogámica (Tabla 7) . Se usaron los marcadores en el Retrocruzamiento 2 generación (BC2) hasta la generación BC4 así como la identificación de plantas homocigotas que llevan los alelos de resistencia al BC4F2.
La Tabla 7 muestra los marcadores en el cromosoma 10 que se usaron para introgresar el locus de resistencia de PHS6Y en las líneas endogámicas de PH9VF, PHDGA, PH467, y PHOTJ, y los polimorfismos entre cada línea endogámica susceptible y el PHS6Y.
Se convirtieron otras líneas endogámicas para tener el locus de resistencia a la roya tropical del PHS6Y. Las conversiones se realizaron en forma similar como se describió anteriormente excepto que se usaron más marcadores para la conversión. La Tabla 8 muestra los marcadores en el cromosoma 10 que se usaron para introgresar el locus de resistencia del PHS6Y en 18 líneas endogámicas y los polimorfismos entre cada línea endogámica susceptible y el PHS6Y.
Tabla 7 Marcadores del cromosoma 10 usados para la Conversión de Cuatro Líneas Endogámicas . 1 = "A" , 2 = = "C", 3 = "G" , 4 "T" , 5 = o Inserción, 6 = "D" o Deleción.
Tabla 8 Marcadores del cromosoma 10 usados para la Conversión de Dieciocho Líneas Endogámicas.
C00071-01 PHM1192-26 PH 1192-4 PHM13818-15 PHM15721-180 PHS6Y- 6,6 1,1 5,5 2,2 2,2 -19 PHBNF 6,6 6,6 1,1 2,2 3,3 PHD18 6,6 6,6 1,1 2,2 3,3 PHR33 6,6 6,6 3,3 2,2 3,3 PH9VC 5,5 5,5 1,1 2,2 1,1 PHK C 5,5 6,6 1,1 2,2 3,3 PH819 5,5 5,5 1,1 2,2 1,1 PHKNF 5,5 6,6 1,1 2,2 3,3 PH9V7 6,6 6,6 1,1 n/a 3,3 PHD V 6,6 6,6 1,1 2,2 3,3 PHM3M 6,6 6,6 n/a 4,4 3,3 PHM5028-24 PHM731-107 PHM9535-10 PHM9535-6 PHM9535-7 PHS6Y 4,4 2,2 3,3 1,1 3,3 PH92E 4,4 2,2 3,3 1,1 3,3 PHBNF 4,4 4,4 4,4 4,4 1,1 PHD18 4,4 4,4 3,3 1,1 3,3 PHR33 2,2 4,4 3,3 1,1 3,3 PH9VC 2,2 4,4 4,4 1,1 3,3 PHK C 4,4 4,4 3,3 4,4 1,1 PH819 2,2 2,2 4,4 1,1 3,3 PHK F 4,4 4,4 3,3 4,4 1,1 PH9V7 4,4 2,2 3,3 4,4 3,3 PHD V 2,2 n/a 3,3 1,1 3,3 PHM3M 4,4 n/a 3,3 4,4 n/a C00435- 802-U C00436-801 C00423-801 C00441-801 C00441-802 PHS6Y 4,4 3,3 4,4 3,3 4,4 PHS7S 4,4 3,3 4,4 3,3 4,4 PH9TJ 4,4 3,3 G 2,2 4,4 2,2 PHBNF n/a n/a n/a n/a n/a PHD18 n/a n/a n/a n/a n/a PHR33 1,1 1,1 2,2 4,4 2,2 PH9VC 1,1 1,1 n/a 4,4 n/a PHK C n/a n/a n/a n/a n/a PH819 1,1 3,3 n/a 4,4 n/a PHKNF 4,4 n/a 4,4 n/a n/a PH9V7 n/a n/a n/a n/a n/a PHD V 1,1 n/a 2,2 4,4 2,2 PHM3M n/a 1,1 n/a n/a n/a C00428-801 PHS6Y 1,1 PH92E 1,1 PH0R8 3,3 PHOTJ 3,3 PH1BC 1,1 PHS6M 1,1 PHKTE 3,3 PHS7S 3,3 PH9TJ 1,1 PHBNF n/a PHD18 n/a PHR33 3,3 PH9VC 3,3 PHK C n/a PHDNV 1,1 PHM3M 1,1 1 = "A" , 2 = "C", 3 = "G" , 4 = "T" , 5 = "I" o inserción, 6 = "D" o Deleción.
Ejemplo 6 Producción de híbrido con Resistencia Mejorada a la Roya Tropical Se usaron las líneas endogámicas convertidas para elaborar híbridos, y los resultados del ensayo de campo han mostrado que el nivel excelente de resistencia visto en las lineas endogámicas convertidas (por ejemplo, Figura 4) se mantienen en híbridos elaborados con las líneas endogámicas de conversión (Figura 5; por ejemplo híbrido GEID6170295) . Ejemplo 7 La Genotipificación de las Líneas de Maíz para las Resistencia de la Roya Tropical y la Identificación de polimorfismos Asociados con la Resistencia Mejorada a la Roya Tropical Genotipificación de las líneas de maíz para la resistencia a la roya tropical Las líneas susceptibles y resistentes se genotipificaron por medio de la resecuenciación de Sanger de los objetivos genómicos . Los objetivos fueron productos PCT amplificados de las secciones genómicas de copia simple de la región QTL de la roya tropical mapeado en el brazo corto del cromosoma 10.
Se usó la secuencia genómica pública disponible para el diseño del cebador. La secuencia pública corresponde a la línea endogámica B73 y se obtuvo por medio de la estrategia de mínimo solapamiento del BAC (disponible en el Navegador Genóma del Maíz, el cual está públicamente disponible en internet) . Se han mapeado los siguientes clones del BAC secuenciados a la región de interés: C0497112, c0284b01, C0446110, c0340ml4, c0178k23, c0332el0, c0009kll, c0281ell, c0230k24, b0286cl2, c0044b04, c0149n21, c0064gll, c0118o03, b0191e02, c0462j05, mientras que el orden y la orientación de los BAC en el solapamiento se ha determinado por medio de huellas dactilares (Nelson et al, 2005. Whole-Genome Validation of High-Information-Content Fingerprinting . Plant Physiology. 139:27-38), el orden y la orientación de los cóntigos de secuencia dentro de cada clon no ha sido totalmente determinado. Para este trabajo, se usó la superposición de la información interna del BAC para reducir más aun el orden de la secuencia de la región 2-2.5 Mb en las subregiones 24 (Figura 6) .
La secuencia incluye grandes porciones de ADN altamente repetitivo, mayormente secuencias del tipo retrotransposon . Los trayectos de secuencia de copia múltiple se identificaron y se eliminaron de la secuencia por medio del enmascaramiento de repeticiones mediante el uso de compatibilidad cruzada (http://www.phrap.org). Se identificaron secuencias de copia baja y se eliminaron mediante el análisis BLAST.
Los cebadores PCR se diseñaron inicialmente para amplificar 270 a 720-bp amplicones en los tractos de copia simple que abarca las 24 subregiones en la región objetivo del cromosoma 10. (Tabla 9) . Los conjuntos de cebadores se diseñaron mediante el uso de herramientas propias en el Primer3 (Rozen, S. y Skaletsky, 2000, Primer3 en la WWW para usuarios generales y para programadores biologistas, Methods Mol Biol. 132:365-386.). Se agregaron los Cebadores de Secuenciación M13R (5-GGAAACAGCTATGACCATG) y M13F (5-TGTAAAACGACGGCCAGT) a los cebadores L y R, respectivamente, como colas para facilitar la secuenciación. Se validaron la calidad y singularidad de los ensayos de PCR al llevar a cabo y analizar el PCR preliminar y la secuenciación en las muestras testigo de ADN de las líneas B73 y Mol7. La amplificación de la línea de adición maíz avena se usó para validar más aun los ensayos. Se descartaron los cebadores de PCR que produjeron productos amplificados en líneas de adición múltiples o no produjeron un producto amplificado exclusivamente en la línea de adición maíz avena en el cromosoma 10.
Tabla 9 Los cebadores de PCR diseñados para Amplificar los Productos en la Región Objetivo de cromosoma 10. 5 10 15 Se llevó a cabo el PCR en el ADN 10-30 ng por medio del uso de HotStar Taq Polimerasa. Mezcla Maestra (Qiagen) , de conformidad con las recomendaciones por parte de los fabricantes con algunas modificaciones. El volumen total de la reacción fue 10 µ? y contenía 5U HotStar Taq polimerasa del ADN, 1.5 mM de MgC12, 200 µ? de dNTPs y 5 pM de cada cebador de cola. La amplificación de PCR se llevo a cabo del siguiente modo: 1) etapa inicial de 15 minutos a 95 °C; 2) 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C, 1 minuto a 72 °C; y 3) etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C. Los productos PCR se confirmaron mediante electroforesis en gel. Un quinto (2 µ?) de la reacción de PCR se diluyó en 17 µ? de agua destilada estéril y se limpió con 0.5 a 0.75 µ? ExoSAP-IT (USB Corporation) , incubación a 37 °C durante 25 minutos, después, 80 °C durante 25 minutos.
La secuenciación del ciclo bidireccional de los amplicones PCR se llevó a cabo por medio del uso de los protocolos de secuenciación del ciclo Gran Tinte Terminador y secuenciación capilar en Analizadores del ADN de Biosistemas Aplicados 3730 XL. 3-5 µ? del ADN limpio se secuenció por medio del uso de oligonucleótidos M13F y M13R y el conjunto de secuenciación Gran Tinte Prism (ABI; versión 3.1), de conformidad con las condiciones del fabricante. Después de la secuenciación del ciclo, los productos de reacción se limpiaron con precipitación de etanol y procesaron en los secuenciadores automatizados ABI3730xl (ABI) , de conformidad con los protocolos estándares.
Las secuencias se ensamblaron mediante el uso de herramientas internas basadas en el software Phrap, Phred, (Ewing et al, 1998, Basecalling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8:175-185; Ewing and Green, 1998, Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities . Genome Research. 8:186-194). Se identificaron y se etiquetaron los polimorfismos (nucléotido simple e inserciones-deleciones) mediante el uso del visor Consed de secuencia (Gordon, 2003, Visión y Corrección de Secuencias Ensambladas por medio del uso de Consed, en los Protocolos Corrientes en Bioinformática . , A. D. Baxevanis y D. B. Davison (eds) , New York: John Wiley & Co . , 2004, 11.2.1-11.2.43). Se usaron tablas SNP generadas, conjuntos de ensamble y secuencias de consenso para seleccionar los polimorfismos apropiados para el desarrollo del marcador.
Identificación de polimorfismos asociados con resistencia mejorada a la roya tropical Los fragmentos de ADN que tienen un alto' nivel de diversidad interna tienen más probabilidades de contener genes de interés. Sin embargo, el diseño de los cebadores en estas regiones puede ser difícil porque las aplicaciones del diseño de cebadores tienen una tendencia para seleccionar áreas de variación aleatoria para el diseño del cebador. Se probó una metodología de agrupamiento de etapas múltiples para dirigir el diseño del cebador en una variación no aleatoria. Este método usa los arboles filognéticos y un proceso de alineamiento secuencial para identificar regiones únicas que contienen variaciones alélicas exclusivas de líneas con resistencia mejorada a la roya tropical. La primera etapa del presente proceso incluye un alineamiento de secuencias crudas con una. relación costo extensión abierta mayor que 10. La segunda etapa consiste en cortar las colas (ruido) . Las etapas subsiguientes consisten en cortar la variación alélica aleatoria, es decir, alelos dentro de la secuencia que mostró diversidad a través de cualquier fenotipo. UPGMA, por sus siglas en inglés (Método de Grupo Par no Ponderado con Media Aritmética) se aplica, después, al alineamiento resultante hasta que un fenograma identifique un agrupamiento único exclusivo de las líneas resistentes.
Un par del cebador (sec. con núm. de ident.: 133 y sec. con núm. de ident.: 134) produjo un amplicón con la secuencia de referencia (sec. con núm. de ident.: 155) referida en la presente descripción, como PHMTR. Todas las líneas que mostraron resistencia a la roya tropical contenían una deleción T- de bp 16 del PHMTR (la secuencia de la región T PHMTR es la sec. con núm. de ident.: 156) mientras que todas las líneas de maíz susceptibles a la roya tropical contenían una región intacta PHMTR (sec. con núm. de ident . : 155).
La Figura 7 muestra parte de la secuencia de referencia (Parte superior) obtenida por la genotipificación de las líneas de maíz resistentes y susceptibles a la roya tropical, mediante el uso de cebadores PCR (sec. con núm. de ident.: 133 y 134) diseñados para el clon ID Ct9050c064Gllc (Tabla 9). La sec. con núm. de ident.: 137-142 representan amplicones obtenidos de las líneas susceptibles. El área resaltada en gris representa una región 21 bp- de la secuencia de referencia (sec. con núm. de ident.: 155).
Las secuencias de amplicón se obtuvieron, además, por medio del uso de cebadores sec. con núm. de ident.: 135 y sec. con núm. de ident.: 136 (sec. con núm. de ident.: 167 es la secuencia de referencia para esta región) y ocho agrupamientos independientes. La Tabla 10 muestra 21 líneas evaluadas para el análisis de agrupamiento . Se consideró que un haplotipo GAG (en posiciones 337-339 de secuencia de referencia la sec. con núm. de ident.: 167; ver Figura 8) es único a todas las líneas con resistencia mejorada a la roya tropical (Tabla 10 y Figura 8) . Se desarrollaron dos nuevos marcadores de ausencia/presencia para ensayar este haplotipo, C06621-1-K2 y C06621-1-K4 (Tabla 3; sec. con núm. de ident.: 157-164), mediante el uso de técnicas de ensayo KASPar descritas en el sitio web kbioscience. Los C06621-1-K2 y C06621-1-K4 son marcadores tipo X/P, donde X indica ausencia y P indica presencia. El marcador P detecta el polimorfismo GAG y el marcador X detecta ADH, un gen de control interno, el cual se usó para mostrar que la reacción funcionó. Dieciocho líneas se evaluaron con marcadores C06621-1-K2 y C06621-1-K4. Todo, cumple con la expectativa para ambos marcadores (excepto una muestra que carecía de datos) dado su análisis de agrupamiento .
Tabla 10 El haplotipo exclusivo en líneas con la Resistencia Mejorada a la Roya Tropical .
Grupo Línea Haplotipo Rasgo A PHS6Y GAG Roya del Sur y Tropical A PH1FT71 GAG Roya del Sur y Tropical A PH1JG22 GAG Roya Tropical y Del Sur A PH1G3H1 GAG Roya Tropical y Del Sur A PH1JG01 GAG Roya del Sur y Tropical B PH9VF ACA Ninguno C A63 ACG Ninguno C PH9PR ACG Ninguno C PH7WC •ACG Ninguno C PH48F ACG Ninguno C PHDGA ACG Ninguno C A63-1 ACG Ninguno C PH7W3 ACG Ninguno C PHOTJ ACG Ninguno D PHBNA GCG Ninguno D Mol7 GCG Ninguno D PH467 GCG Ninguno D PH147G5 GCG Roya común D PHP3P1 GCG Roya común D PH1AGK1 GCG Roya común D PHY7M2 GCG Roya común La metodología de agrupamiento en etapas múltiples mostró ser un método eficiente para identificar las regiones únicas que contienen variaciones alélicas exclusivas de las líneas con resistencia mejorada a la roya tropical, y esta metodología se puede aplicar a cualquier rasgo de interés. Ejemplo 8 Los marcadores y/o haplotipos para uso en la Selección Asistida por Marcador de las Plantas de Maíz con Resistencia Mejorada a la Roya Tropical Un conjunto de marcadores comunes se puede usar para ayudar en la identificación de otros marcadores que se pueden usar para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical. La Tabla 11 muestra marcadores identificados en la presente descripción, que definen el intervalo que comprende un gen que confiere resistencia a la roya tropical. Los marcadores están en orden del mapa físico (como se describe en la Figura 1) . Se muestran, además, las posiciones de los marcadores en el mapa derivado internamente de PHB (basado en meiosis simple) y en el mapa genético IBM2 vecinos (alta resolución B73/Mol7 Mapa genético.).
Tabla 11 Posiciones de Marcador molecular, en el mapa PHB y en el mapa de IBM 2 Vecinos na = no disponible Los marcadores estrechamente enlazados que flanquean el locus de interés que tienen alelos en el desequilibrio de enlace con un alelo de resistencia a ese locus se puede usar eficazmente para seleccionar las plantas de la progenie con resistencia mejorada a la roya tropical. Así, los marcadores descritos en la presente descripción, tales como aquellos listados en la Tabla 11, así como otros marcadores mapeados física o genéticamente al mismo segmento cromosomal, se puede usar para seleccionar las plantas de maíz con resistencia mejorada a la roya tropical. Típicamente, un conjunto de estos marcadores se usarán (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más) en la región flanqueante por encima del gen y un conjunto similar en la región flanqueante por debajo del gen. Opcionalmente, se puede usar, además, un marcador dentro del gen real y/o locus. Los parentales y su progenie se analizan para estos conjuntos de marcadores y los marcadores que son polimórficos entre los dos parentales se usa para la selección. Los marcadores polimórficos más proximales al gen o locus se usan para seleccionar el gen o locus, y los marcadores polimórficos más distales se usan para seleccionar contra el gen o locus. En un programa de introgresión, esto permite la selección del gen o del genotipo del locus en los marcadores polimórficos más proximales y la selección para el genotipo parental recurrente en los marcadores polimórficos más distales.
Un haplotipo, o una combinación de alelos, se puede usar, además, para seleccionar plantas en un programa de mejora genética. Los haplotipos pueden ser más informativos que los polimorfismos simples y pueden ser más descriptivos que cualquier genotipo en particular. Una vez que el haplotipo se ha asignado a una región cromosomal dadora, tal como un haplotipo para PHS6Y en el brazo corto del cromosoma 10, ese haplotipo se puede usar en esa población o cualquier subconjunto de esta para determinar si un individuo tiene un gen en particular. Mediante el uso de plataformas conocidas automatizada de detección de marcador de alta productividad para personas con conocimiento ordinario en la técnica hace que este proceso sea altamente eficiente y eficaz. Los alelos marcadores descritos en la presente descripción, se pueden usar solos o en combinación para seleccionar plantas con resistencia mejorada a la roya tropical a través del uso de la selección asistida por marcador.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para seleccionar una planta de maíz que muestra resistencia aumentada a la roya tropical, caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz un primer alelo marcador que está enlazado y asociado con: i. una deleción "T" en la posición 16 de PHMTR; o ii. un haplotipo "GAG" en posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, la sec. con núm. de ident . : 167 ; y b. seleccionar la planta de maíz que tiene el primer alelo marcador.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además el primer alelo marcador está enlazado a la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, la sec. con núm. de ident.: 167 mediante 20 cM en un mapa de meiosis simple.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además el primer alelo marcador está enlazado a la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, la sec . con núm. de ident . : 167 mediante 2 cM en un mapa de meiosis simple.
4. Un método para seleccionar una planta de maíz que muestra resistencia mejorada a la roya tropical, caracterizado porque comprende: a. detectar la planta de maíz i. una deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o ii. un haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, la sec. con núm. de ident.: 167; y b. seleccionar la planta de maíz que tiene la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia secuencia la sec. con núm. de ident.: 167.
5. Un método para identificar una planta de maíz que muestra resistencia mejorada a la roya tropical, caracterizado porque comprende detectar en una planta de maíz un locus marcador, en donde: a . una sonda marcadora que comprende todo o una porción del locus marcador o complemento de este se hibridiza bajo condiciones rigurosas para el ADN contiguo entre y que incluye la sec. con núm. de ident . : 89 o una secuencia de nucleótidos que es 95% idéntica a la sec. con núm. de ident. : 89 en base al método de alineamiento Clustal V y la sec. con núm. de ident. : 96 o una secuencia de nucleótidos que es 95% idéntica a la sec. con núm. de ident.: 96 basada en el método de alineamiento Clustal V; y b. el locus marcador comprende al menos un alelo que está asociado con la resistencia mejorada a la roya tropical .
6. Un método para identificar una planta de maíz que presenta resistencia mejorada a la roya tropical, caracterizada porque comprende detectar en el germoplasma de la planta de maíz un alelo de un locus marcador, en donde: a. el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y PHM15590 que está PHM9535 flanqueado por y; y b. el alelo está asociado con la resistencia mejorada a la roya tropical.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PHM15590 y PHM15721.
8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por C0041 y C00428.
9. Un método para identificar una planta de maíz que presenta resistencia mejorada a la roya tropical, caracterizado porque comprende detectar en el germoplasma de la planta de maíz un haplotipo que comprende alelos en uno o más loci marcadores, en donde: a. el locus o loci marcadores se localizan dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PHM15590 y PHM9535; y b. el haplotipo está asociado con la resistencia mejorada a la roya tropical.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además uno o más loci marcadores se localizan dentro de un intervalo cromosómico, que comprende y está flanqueado por PHM15590 y PHM15721.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además uno o más loci marcadores se localizan dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por C0041 y C00428.
12. El método de la reivindicación 9, 10, u 11, caracterizado porque además el haplotipo comprende una deleción "T" en la posición 1 de PHMTR o una "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, la sec . con núm. de ident . : 167.
13. Un método para seleccionar una planta de maíz que muestra resistencia mejorada a la roya tropical, caracterizado porque comprende: a. obtener una primera planta de maíz que tiene al menos un alelo de un locus marcador, en donde el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por PHM15590 y PHM9535 y el alelo está asociado con la resistencia mejorada a la roya tropical; b. cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz; c . evaluar las plantas progenie para detectar el alelo de la primera planta de maíz; y d. seleccionar las plantas progenie que tengan el alelo de la primera planta de maíz.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque además el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y que está flanqueado por PHM15590 y PHM15721.
15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque además el locus marcador se localiza dentro de un intervalo cromosómico que comprende y está flanqueado por C0041 y C00428.
16. Un método para seleccionar una planta de maíz que muestra resistencia mejorada a la roya tropical, caracterizado porque comprende: a. obtener una primera planta de maíz que comprende dentro de su genoma: i. una deleción "T" en la posición 16 de PHMTR; o ii. a un haplotipo que comprende un "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia, la sec. con núm. de ident . : 167; b. cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz; c. evaluar las plantas progenie para la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo que comprende un "GAG" en las posiciones 337-339 de la secuencia de referencia sec. con núm. de ident . : 167 ; y d. seleccionar las plantas progenie que poseen la deleción "T" en la posición 16 de PHMTR o el haplotipo que comprende un "GAG" en las posiciones 337-339. de la secuencia de referencia secuencia sec. con núm. de ident.: 167.
17. Una planta de maíz identificada por cualquiera de los métodos de la reivindicación 5 y 6-12, caracterizada porque además la planta no es CML339.
18. Una planta de maíz seleccionada por cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1-4 yl3-16, caracterizada porque además la planta no es CML339.
19. Un método para identificar una o más variaciones alélicas asociadas con una forma deseable de un rasgo, caracterizado porque comprende: a. alinear las secuencias crudas con una relación costo extensión abierta mayor que 10; b. recortar las colas de la secuenciación (ruido) ; c. recortar la variación alélica aleatoria; d. aplicar UPGMA (Método de Agrupamiento en Pares No Ponderados con Media No Aritmética) al alineamiento resultante; e. etapas repetitivas c-d hasta que el fenograma identifique un agrupamiento único de líneas con la forma deseable del rasgo, y f. identificar una o más variaciones alélicas asociadas con la forma deseable de un rasgo.
MX2012005252A 2009-11-04 2010-11-03 Loci genetico asociado con la resistencia a la roya tropical (physopella zeae) en el maiz. MX341421B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25797709P 2009-11-04 2009-11-04
PCT/US2010/055242 WO2011056836A2 (en) 2009-11-04 2010-11-03 Genetic loci associated with resistance to tropical rust in maize

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2012005252A true MX2012005252A (es) 2012-06-19
MX341421B MX341421B (es) 2016-08-19

Family

ID=43480878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2012005252A MX341421B (es) 2009-11-04 2010-11-03 Loci genetico asociado con la resistencia a la roya tropical (physopella zeae) en el maiz.

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8809623B2 (es)
EP (1) EP2496072A2 (es)
CN (2) CN105063195A (es)
AR (1) AR078912A1 (es)
BR (1) BR112012010479A2 (es)
CA (1) CA2778828A1 (es)
IN (1) IN2012DN03427A (es)
MX (1) MX341421B (es)
WO (1) WO2011056836A2 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201343661A (zh) * 2012-02-09 2013-11-01 Agrigenetics Inc 穀層皮ｄｎａ萃取及母系族系測定技術
CN105861647B (zh) * 2016-01-26 2019-03-22 河南农业大学 与玉米南方锈病基因紧密连锁的分子标记组合及其应用
CN106350601A (zh) * 2016-10-28 2017-01-25 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司 高通量检测玉米轴色基因分型的方法及其试剂盒
MX2020013154A (es) * 2018-06-06 2021-07-16 Univ Huazhong Agricultural Ñmétodos para identificar, seleccionar y producir cultivos resistentes a la roya sureña del maíz.
CN113631722A (zh) * 2019-03-11 2021-11-09 先锋国际良种公司 鉴定、选择和生产南方玉米锈病抗性作物的方法
CN110468226B (zh) * 2019-08-15 2020-07-31 华中农业大学 杨树抗叶锈病的分子标记及其应用
CN113897352B (zh) * 2020-06-22 2023-06-23 北京市农林科学院 玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5763746A (en) * 1996-03-05 1998-06-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred maize line PH20A
US6025547A (en) * 1998-03-10 2000-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred maize line PH1CA
FR2833615A1 (fr) 2001-12-14 2003-06-20 Genoplante Valor POLYMORPHISMES DU GENE CCoAOMT2 DE MAIS, ET LEURS UTILISATIONS POUR AMELIORER LA DIGESTIBILITE DES PLANTES
US20060141495A1 (en) * 2004-09-01 2006-06-29 Kunsheng Wu Polymorphic markers and methods of genotyping corn
ATE554096T1 (de) * 2006-08-10 2012-05-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zum erhöhen der resistenz gegen sojabohnenrost in transgenen pflanzen
CN101743827B (zh) * 2009-09-16 2011-05-04 河南农业大学 生态控制南方锈病的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103108541B (zh) 2015-08-12
CN105063195A (zh) 2015-11-18
WO2011056836A3 (en) 2011-07-28
US8809623B2 (en) 2014-08-19
CA2778828A1 (en) 2011-05-12
WO2011056836A2 (en) 2011-05-12
AR078912A1 (es) 2011-12-14
BR112012010479A2 (pt) 2017-08-29
MX341421B (es) 2016-08-19
EP2496072A2 (en) 2012-09-12
US20110107453A1 (en) 2011-05-05
CN103108541A (zh) 2013-05-15
IN2012DN03427A (es) 2015-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016270918B2 (en) Genetic locus associated with phytophthora root and stem rot in soybean
US8809623B2 (en) Genetic loci associated with resistance to tropical rust in maize
EP2355651B1 (en) Genetic loci associated with northern leaf blight resistance in maize
US9551041B2 (en) Genetic loci associated with fusarium ear mold resistance in maize
US9179613B2 (en) Genetic loci on maize chromosomes 3 and 4 that are associated with fusarium ear mold resistance
US9702015B2 (en) Molecular markers associated with Mal de Rio Cuarto Virus in maize
US9273363B2 (en) Genetic loci associated with resistance of corn to fijivirus
US10066271B2 (en) Genetic loci associated with Mal de Rio Cuarto virus in maize

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration