CN110468226B - 杨树抗叶锈病的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了杨树抗叶锈病的分子标记及其应用。本发明利用本研究团队前期构建的杨树高密度遗传图谱，结合遗传图谱所对应的杂交F1子代进行3个环境叶锈病的抗性鉴定，开展杨树抗叶锈病QTL定位。通过QTL定位信息和杂交子代群体亲本的重测序数据，挖掘到了一个与抗叶锈病主效QTL紧密连锁的分子标记。该分子标记其由核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物经PCR扩增杨树基因组DNA得到。该分子标记在子代群体中能够有效区分杨树叶锈病的抗性，可用于后续抗叶锈病分子育种。

Description

杨树抗叶锈病的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，尤其涉及杨树抗叶锈病的分子标记及其应用。

背景技术

杨树因其速生、用途广、适应能力强等特点在世界范围内广泛栽培种植。在我国，杨树种植也十分广泛。然而，在林业生产实践过程中，杨树的病虫害是降低其经济效益的重要因素。在诸多病虫害中，叶锈病是最重要的一种病害。感染上叶锈病的杨树，不仅自身的光合效率显著下降、生长速度大幅降低，抵抗其他病虫害的能力也大幅减弱。根据相关研究预测，严重感染上叶锈病的杨树人工林，其木材材积和总生物量损失均超过50％。因此，选育出具有较强叶锈病抗性的品种是当今杨树遗传育种的重要任务。由于杨树属多年生木本植物，其生长周期长，由幼苗到达生殖生长往往需要5-10年。因此，通过有性杂交选育并经过田间鉴定后代抗性的传统育种手段已经不能满足现代林业抗病育种的需要；而通过数量遗传学系统研究，获取与抗病位点紧密连锁的分子标记，再将其与传统林木育种技术相结合进行转基因或者分子标记辅助育种，将对快速培育高杨树叶锈病抗性育种品种起到极大的促进作用。

近年来，基于连锁遗传原理QTL(Quantitative trait Locus，简写为QTL)定位是开发与目的性状紧密连锁分子标记的最为有效方法之一。QTL定位的基本原理为以遗传图谱为基础，借助QTL与分子标记之间的连锁关系，从而定位控制数量性状的基因在染色体上的位置。QTL策略的使用为有效的植物育种、亲本选择甚至培育更好的改良表型提供思路。虽然在过去几十年中，生物学无论在技术和理论上都取得了突飞猛进的发展，然而针对杨树叶锈病抗性分子标记的开发和利用开展了即为有限的工作。其中代表性的工作有，有学者利用美洲黑杨种内杂交群体发现F1单株对叶锈病抗性呈现1：1的分离，利用BSA(混库分析法)发现两个分子标记OPG10340和OPZ191800与抗叶锈病位点紧密连锁，其遗传距离分别为2.6和7.4个cM；同时还有学者在2004年对毛果杨抗叶锈病能力进行了详细解析，在QTL初步定位确定两个抗性位点MXC3和MER后，对这两个位点的连锁不平衡进行了详细分析并提出了抗病基因。对这些研究对比分析发现，杨树叶锈病抗性受多遗传位点控制，且这些代表性研究仅仅公布了部分杨树叶锈病的抗性QTL信息，但并未提供有效可以用于分子育种的杨树叶锈病遗传标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了杨树抗叶锈病的分子标记及其应用，本发明利用本研究团队前期构建的杨树高密度遗传图谱，结合遗传图谱所对应的杂交F1子代进行3个环境叶锈病的抗性鉴定，开展杨树抗叶锈病QTL定位。通过QTL定位信息和杂交子代群体亲本的重测序数据，挖掘到了一个与抗叶锈病主效QTL紧密连锁的分子标记。该标记在子代群体中能够有效区分杨树叶锈病的抗性，加快杨树叶锈病抗性育种品种的选育进度。

本发明的目的之一在于提供杨树抗叶锈病的分子标记，其由核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物经PCR扩增杨树基因组DNA得到。

具体地，所述分子标记与杨树叶锈病抗性QTL主效区间紧密连锁，杨树叶锈病抗性QTL位点定位于17号染色体，17号染色体QTL区间对应的物理位置为11.27Mb-12.35Mb。

本发明的目的之二在于提供于选育叶锈病抗性杨树的标记引物，其特征在于，其为核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。

本发明的目的之三在于提供所述分子标记在选育杨树叶锈病抗性育种中的应用。

具体地，用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对待检测的杨树叶片基因组DNA进行PCR扩增，获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，判断原则如下：

若电泳条带只出现800bp特异性条带，且没有出现300bp特异性条带，则待测样品为低抗叶锈病nn基因型；

若电泳条带出现800bp特异性条带的同时，还出现300bp特异性条带，则待测样品为高抗叶锈病np基因型。

本发明的有益效果：

1、本发明基于杨树叶锈病抗性分子标记缺失的现状，利用本研究团队前期构建的杨树高密度遗传图谱，结合遗传图谱所对应的杂交F1子代进行3个环境叶锈病的抗性鉴定，开展杨树抗叶锈病QTL定位。通过QTL定位信息和杂交子代群体亲本的重测序数据，挖掘到了一个与抗叶锈病主效QTL紧密连锁的分子标记。该标记在子代群体中能够有效区分杨树叶锈病的抗性，同时，该标记属国内外首次报道。

2、通过检测与主效基因位点紧密连锁的所述分子标记，即可以预测杨树植株对叶锈病抗性，用于杨树品种或品种的基因型检测，以判断该品种或品种是否具有叶锈病抗性或抗性等级，进而快速筛选抗叶锈病品种或品种用于杨树育种。其检测方便快速，不受环境影响。

附图说明

图1为位于杨树17号染色体上的叶锈病抗性QTL图；

图2为位于17号染色体叶锈病抗性QTL位点区间内R基因多态性结果；

图3为I-69杨×小叶杨的F1子代群体中部分子代基因组缺失多态性验证的PCR跑胶结果；

图4为利用R基因开发的分子标记与I-69杨×小叶杨F1子代群体2019年7月叶锈病抗性相关性分析结果；

图5为利用R基因开发的分子标记检测12份收集的杨树材料多态性验证的PCR跑胶结果。

具体实施方式

实施例1分子标记的获取

1、杨树I-69杨×小叶杨F1子代SNP分子标记的开发

在2017年春季，取I-69杨×小叶杨F1子代和其两个亲本I-69杨、小叶杨的幼叶样品，将样品立即储存在液氮中并转移至-70℃冰箱中。各样品均称量0.5g在液氮中研磨，并使用DNeasy植物制备试剂盒(Qiagen)提取它们的DNA。测量DNA浓度并调节至相同水平，共获得300份DNA样品。DNA样品送测序公司进行GBS简化基因组测序，构建了共300个GBS文库，同时还构建了两个亲本I-69杨和小叶杨的重测序DNA文库。通过HiSeq 2500平台将300个GBS和两个重测序文库用于随后的高通量测序，获得200G的二代测序数据。使用Trimmomatic过滤所有原始数据(默认参数)，然后对每个子代和亲本的测序数据根据测序前添加特有的标签进行分离。SNP数据过滤和分子标记开发过程包括以下5个步骤，(1)：获得每个子代SNP信息。利用GATK软件包，以默认参数进行数据分析，将200G二代数据比对到毛果杨参考基因组上。根据比对结果，获得每个子代及亲本的SNP信息。(2)对获得的所有SNP位点进行质控筛选。对于纯合位点，在单个子代或亲本上，至少有5个二代测序片段支持的SNP才被确定为有效SNP，支持杂合基因型的SNP每个等位基因至少需要3个测序片段。如果基因型数据不符合这两个要求，则相应后代或亲本的SNP被认为是缺失数据；(3)利用小概率SNP筛选SNP位点。由于测序错误在NGS中以高频率发生，因此在分析期间采用“MinorSNP”的概念。即对于某个SNP位点，如果基因型频率小于0.05，则该SNP的相应后代或亲本被认为是缺失数据。(4)利用SNP信息推测每个SNP位点的子代分离模式。根据每个SNP位点在子代和两个亲本中的碱基形式，推测其分离模式。如亲本碱基为AA和AG，而每个子代的碱基也为AA和AG，则该SNP位点在I-69杨×小叶杨F1子代群体中分离模式为“lm×ll”。仅保留在子代群体中满足分离模式“lm×ll”，“nn×np”，“ab×ab”，“ab×cd”和“ef×eg”类型的SNP用于进一步分析。对于具有一个亲本缺失数据的SNP位点，根据子代SNP类型，预测另一个亲本的SNP类型。(5)根据缺失率筛选高质量SNP位点信息。筛选去除缺失率>15％或父母双方缺失数据的SNP位点(即有45个以上子代在该SNP位点上没有信息)。

2、I-69杨×小叶杨高密度遗传图谱的构建

对于符合分离模式“lm×ll”，“nn×np”，“ab×ab”，“ab×cd”和“ef×eg”的所有SNP标记以“CP”格式导入Joinmap 4.1软件进行作图。“创建母本和父本群体交点”的功能被用来产生I-69杨和小叶杨的基因型数据。由于可能存在相同或高度相似的标记，因此计算标记之间的相似性，并且去除相似性大于0.90的冗余标记。将独立LOD值设置为0-30，步长值为1.0。对于父母本图谱，选择LOD>8.0以形成不同的连锁群。连锁群和染色体之间的对应关系由参考基因组上SNP标记的位置确定。例如，如果连锁群在杨树1号染色体上具有大部分SNP标记，那么该连锁群被指定为Chr.1。在构建初步图谱后，通过参数“The nearestneighbor fit(N.N.Fit)”校正所构建的连锁组，低质量SNP标记被除去，以确保剩余标记的N.N.Fit<0.80。在此过程中，还考虑每个SNP标记的卡方值是否满足其对应的分离比，卡方值由Joinmap 4.1直接计算获得。

3、I-69杨×小叶杨F1子代群体叶锈病抗性鉴定

本研究主要采用野外自然感病的方式鉴定I-69杨×小叶杨子代的叶锈病抗性，根据子代发病情况，叶锈病抗性鉴定试验分别在2017年7月、2017年9月及2018年9月开展。

具体操作方法为：当田间出现感染叶锈病的叶片时，便需经常观察，当叶锈病大面积爆发时，则需进行统计。按照田间编号，观察每一个单株的所有叶片的感病情况，取感染最严重的一片来统计。当黄色病斑数目在80以下时，则采用人工记数法，当数目过多，则拍下清晰照片，并记录好编号，用Image-Pro Plus图像处理软件，统计黄色病斑总面积占叶片总面积的百分比。

对所获得的数据进行抗性等级分类，具体分类标准如下：

感病1级：在整株中未发现叶锈孢子；

感病2级：最感病叶片上平均出现1-10个叶锈孢子；

感病3级：最感病叶片上平均出现11-50个叶锈孢子；

感病4级：最感病叶片上平均出现51个叶锈孢子至叶锈孢子占叶片面积2％；

感病5级：最感病叶片上平均出现叶锈孢子占叶片面积2％-5％；

感病6级：最感病叶片上平均出现叶锈孢子占叶片面积大于5％。因杂交群体中每个子代有重复2-3个单株，因此每个子代最终叶锈病的抗性等级取每个子代所有单株抗性等级数据的平均值(但最终分级中，2及2.5定为2，依此类推)。

2017年7月、2017年9月及2018年9月抗病等级观测整理数据见表1。

表1 I-69杨×小叶杨F1子代群体叶锈病抗性鉴定结果

注：表中为每抗病等级对应的子代单株数。

4、杨树叶锈病抗性QTL定位

使用R/qtl软件进行相关性状的QTL分析。首先采用单QTL模型(SQM)对每个性状进行QTL检测，将LOD>2.5的QTL视为候选QTL；然后采用多QTL模型(MQM)的函数“stepwiseqtl”进行第2轮QTL定位，其主要参数“max.qtl”依据上一轮SQM模型中LOD>2.5的候选QTL的数量设置，且计算QTL之间的相互作用，其参数“permutation”设置为1000次，其参数P设置为0.05；最后，获得QTL的置信区间由函数“lodint”确定，其区间可信度设置为1.5-LOD(相当于95％置信区间)。

通过QTL整合分析，获得了一个位于杨树17号染色体上的一个杨树抗叶锈病主效QTL。如图1的结果显示，杨树叶锈病抗性定位到以上11个QTL位点。在所有QTL中，最高LOD值为8.61，QTL提供了最高12.84％的表型贡献率。其中有1个QTL区间可在不同环境中重复，分别为1709p2与1809p2重复定位的17号染色体，其对应的区间分别为64.00-68.00cM。同时对主效QTL位点进行遗传位置和物理位置的对应分析，发现17号染色体QTL区间对应的物理位置为11.27Mb-12.35Mb。

5、位于17号染色体的杨树叶锈病抗性主效QTL紧密连锁分子标记开发

(1)利用二代测序技术对亲本I-69杨和小叶杨进行深度重测序，对位于17号染色体QTL区间所对应的物理位置11.27Mb-12.35Mb，进行SNP和插入缺失多态性分析，发现在此区间内，存在一个特异的R基因出现多态性，R基因对应的基因组编号为Potri.017G104100。而R基因往往与植物抗病密切相关。

(2)该R基因多态性多态性出现在亲本小叶杨基因组上，在该位置该特异基因存在611bp缺失，缺失发生在491-1102bp处(如图2所示)。对缺失效果进行功能预测，发现该缺失造成移码突变，而I-69杨基因组在此区域无缺失。在该特异基因上设计引物，因缺失发生在491-1102bp处，所以引物设计在该缺失位置的两端。在该R基因的100-300bp位置处设计左引物，1100-1300bp位置处设计右引物。引物序列分别为：CAACTGCCAGCATCCGTTTT(F引物，如SEQ ID NO.1所示)，AAGGCAGAAGATGGTCGTGG(R引物，如SEQ ID NO.2所示)。

(3)用设计的两对引物扩增小叶杨、I-69杨及I-69杨×小叶杨F1子代群体中部分子代的gDNA。因为小叶杨基因组中存在缺失多态性，因此，利用该引物扩增子代gDNA，预计会出现大小为800和300bp的两个片段。

表2-PCR扩增反应体系

PCR反应条件为：95℃变性5min；35个循环扩增(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s)；72℃延伸5min；12℃保存。

(4)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳(100V电压)后在荧光染料(溴化乙锭)下染色。在凝胶成像体统下观测PCR扩增情况，部分子代PCR凝胶电泳图如图3所示。

(5)未检验所开发的R基因分子标记是否定位在杨树第17号染色体QTL区间内，我们将R分子标记在300个子代中的基因型信息整合进遗传图谱中，对17号染色体重新遗传作图。结果发现我们所获得的R基因分子标记刚好被定位在QTL区间中(如图4所示)。

经过图3和图4结果可以获知，我所开发的分子标记在子代中出现多态性，且该标记与杨树叶锈病抗性QTL主效区间紧密连锁。因此该标记可用于后续抗叶锈病分子育种。

6、分子标记与杨树对叶锈病抗性的相关性

为检测上述开发分的杨树抗叶锈病分子标记的可用性。我们在2019年7月份重新开展了I-69杨×小叶杨300个子代叶锈病再次鉴定。利用上述开发的分子标记检测I-69杨×小叶杨300个子代基因型数据和2019年7月份开展了I-69杨×小叶杨300个子代叶锈病抗性检测数据，检测所开发的R分子标记是否能与杨树叶锈病抗性相关。

(1)杨树I-69杨×小叶杨F1子代R分子标记检测

根据上面已经获得的R基因在300个子代中的基因型数据，将300个子代在R基因上的基因型分为nn和np两种基因型。其中nn为R基因扩增只有一条条带(800bp的两条特异性条带)的基因型，而np为两条条带(800bp和300bp的两条特异性条带)的基因型(图3)。

(2)I-69杨×小叶杨F1子代在2019年夏季抗叶锈病表型鉴定叶锈病抗性鉴定方法采用上述QTL定位时所采用的抗性鉴定方法。2019年7月抗病等级观测整理数据见表3。

表3 I-69杨×小叶杨F1子代群体2019年7月叶锈病抗性鉴定结果

(3)杨树I-69杨×小叶杨F1子代R分子标记基因型与叶锈病抗性表型关联性分析

利用R基因的nn和np基因性，将300个子代分为两组。联合分组数据和在QTL定位过程中获得的I-69杨×小叶杨3个环境叶锈病抗性数据，对nn/np两种类型的子代在2019年7月抗叶锈病抗性等级求平均值。结果如图4和表4所示。

表4

由表4可知，nn基因型子代叶锈病抗性等级为2.95±0.11，而np基因型子代抗性平均等级为2.56±0.08。对两组抗叶锈病平均值进行统计分析，根据t检验结果显示，np基因型抗病等级明显高于nn基因型(P＝0.0095)。这一结果说明，R分子标记与杨树对叶锈病抗性显著相关。其中R基因在杂合状态下表现出更加抗病。该结果证明了我们所开发的抗叶锈病紧密连锁分析标记有效。

实施例2分子标记的验证

1、材料和方法

1.1材料

在湖北省不同县市野外收集的12个遗传背景不明确的杨树栽培单株

分子标记引物：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。

1.2方法

CTAB抽提法提取杨树叶片基因组DNA，用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对扩增样品DNA，扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳(100V电压)后通过溴化乙锭染色显色记录扩增的DNA条带。(具体方法同实施例1)。

对这12份材料在2019年7月份开展了野外叶锈病抗性等级鉴定。

2、结果：

用上述方法，分别对阳性样品的基因组DNA进行PCR扩增。图5结果表明，在12份样本中电泳出现nn条带的单株为8个，而出现np条带的单株为4个。

这12份材料叶锈病抗性等级鉴定结果分别为3，2，5，3，4，3，4，4,4，2，6，1。4份np基因型抗病等级为2.0±0.8；而8份nn基因型抗病等级为4.1±1.0。经过统计分析t检验得知，nn基因型感病指数明显高于np基因型(p＝0.0042)。因此在12份湖北省野外收集的杨树栽培材料中，本研究所开发的抗病分子标记np基因型对叶锈病抗病性明显高于nn基因型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 杨树抗叶锈病的分子标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caactgccag catccgtttt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggcagaag atggtcgtgg 20

Claims (5)

1.一种杨树抗叶锈病的分子标记，其特征在于，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物经PCR扩增杨树基因组DNA得到。

2.权利要求1所述分子标记在选育杨树叶锈病抗性育种中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对待检测的杨树叶片基因组DNA进行PCR扩增，获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，判断原则如下：

若电泳条带只出现800bp特异性条带，且没有出现300bp特异性条带，则待测样品为低抗叶锈病nn基因型；

若电泳条带出现800bp特异性条带的同时，还出现300bp特异性条带，则待测样品为高抗叶锈病np基因型。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系，10×扩增缓冲液5μL，4种dNTP混合物各200μmoL/L；引物对各10pmoL；模板DNA50ng；Taq DNA聚合酶2.5μL；加双蒸水至50μL。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。

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