CN111961742B

CN111961742B - 重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2及其检测引物与应用

Info

Publication number: CN111961742B
Application number: CN202010807640.9A
Authority: CN
Inventors: 米甲明; 李广伟; 黄建燕; 喻辉辉; 周发松; 张启发; 欧阳亦聃; 牟同敏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2040-08-12
Also published as: CN111961742A

Abstract

本发明实施例涉及分子育种领域，具体涉及重组核苷酸片段RecS5‑1和RecS5‑2及其检测引物与应用。本发明实施例提供的重组核苷酸片段，其选自：包含SEQ ID NO.1所示序列38‑573位核苷酸的序列，或其互补序列；包含SEQ ID NO.1所示序列，或其互补序列；包含SEQ ID NO.2所示序列255‑282位核苷酸的序列，或其互补序列；包含SEQ ID NO.2所示序列，或其互补序列；以及以上片段的组合。所述重组核苷酸片段可以作为主效基因的特异识别标记，运用于分子标记选择育种；并可作为特异分子识别标记，用于鉴定广亲和水稻材料。

Description

重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2及其检测引物与应用

技术领域

本发明涉及分子育种领域，具体涉及重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2及其检测引物与应用。

背景技术

传统的水稻育种依赖于育种家对具体水稻材料在田间的表型的观察与评价，受到自然环境和个人经验的影响，其育种周期长，效率低。分子标记技术的发展为提高育种效率提供了新的手段，使得育种家可以通过检测与主效基因紧密连锁的特定核苷酸序列，即分子标记来实现对目标基因的选择，大幅度提高育种的准确度及缩短育种年限。

亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)分为两个主要亚种，即籼稻(Oryza sativaL.ssp.indica)和粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)，亚种间杂种具有强大的杂种优势，利用籼粳亚种间杂种优势培育新型杂交水稻，是我国水稻高产育种的主攻方向之一。籼粳亚种间由于生殖隔离，其杂种往往表现为花粉不育或半不育、胚囊不育或半不育、花药不开裂、雌雄不同步发育等现象，直接影响籼粳杂交稻的结实率。广亲和品种Dular可以克服籼粳杂种不育从而提高籼粳亚种间杂交稻结实率，同时携带S5-n、f5-n、Sa-n、S7-n、S8-n、S9-n、S16-n、S17-n、S29-n、S31-n、S32-n等广亲和基因(Qiu et al.,2005；Wang et al.,2005；Zhao et al.,2006；Zhu et al.,2005；Li et al.,2007；Wang et al.,2010；Yu etal.,2016)，其中位于第6号染色体的S5-n基因已经被成功克隆。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2及其检测引物与应用。所述重组核苷酸片段是利用分子标记辅助选择育种技术培育广亲和水稻植株时获得的。重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2分别位于广亲和基因S5-n上下游，并与S5-n紧密连锁。水稻杂交过程中，不同来源的基因组在减数分裂过程中会发生同源重组，从而产生新的DNA序列组合。由于基因组重组是随机的，所以理论上不同来源的基因组重组产生的任何一个新的核苷酸序列都是不同的，具有极高的特异性。位于主效基因附近的重组DNA序列与其紧密连锁，只存在于选育得到的后代重组单株中，具有唯一性。因此，一方面，由于重组DNA序列与特定主效基因连锁紧密，因此可以作为该主效基因的特异识别标记，运用于分子标记选择育种；另一方面，由于该重组DNA只存在于选育得到的后代重组单株材料中，因此也可作为该材料的特异分子识别标记，通过检测待测水稻材料中是否含有该重组DNA序列，即可判断待测水稻材料是否为选育得到的重组水稻植株，或是否是利用含有该重组DNA序列的水稻植株为亲本选育而来。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种重组核苷酸片段，其选自：

I)包含SEQ ID NO.1所示序列38-573位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；

II)包含SEQ ID NO.1所示序列，或其变体，或其互补序列；

III)包含SEQ ID NO.2所示序列255-282位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；

IV)包含SEQ ID NO.2所示序列，或其变体，或其互补序列；

V)I)-IV)中任意片段的组合。

上述重组核苷酸片段来源于水稻材料9311和Dular杂交后代中基因组发生同源重组的重组单株NIL-(S5-n)。

本发明实施例还提供了用于扩增或检测所述重组核苷酸片段的引物，所述引物包括本领域技术人员针对该扩增目标可设计得到的所有引物。

上述引物在一种可能的实施方式中，当扩增目标为包含SEQ ID NO.1所示38-573位序列或SEQ ID NO.1所示序列时，所述引物可选自以下I-V的任一组引物组合：

I)特异性识别SEQ ID NO.1所示1-38位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQID NO.1所示573-933位核苷酸序列的反向引物；

II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含：

a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO.1所示1-38位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO.1所示39-572位核苷酸序列的反向引物；

b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO.1所示39-572位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO.1所示573-933位核苷酸序列的反向引物；

III)特异性识别SEQ ID NO.1所示第38位核苷酸的正向引物和特异性识别SEQ IDNO.1所示第573位核苷酸的反向引物；

IV)特异性识别SEQ ID NO.1所示序列第38位核苷酸的正向引物和特异性识别SEQID NO.1所示573-933位核苷酸序列的反向引物；

V)特异性识别SEQ ID NO.1所示1-38位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQID NO.1所示序列第573位核苷酸的反向引物。

上述引物在一种可能的实施方式中，当扩增目标为包含SEQ ID NO.2所示255-282位序列或SEQ ID NO.2所示序列时，所述引物可选自以下VI-X的任一组引物组合：

VI)特异性识别SEQ ID NO.2所示1-255位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO.2所示282-489位核苷酸序列的反向引物；

VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含：

a)第三组引物对：特异性识别SEQ ID NO.2所示1-255位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO.2所示256-281位核苷酸的序列的反向引物；

b)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO.2所示256-281位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO.2所示282-489位核苷酸序列的反向引物；

VIII)特异性识别SEQ ID NO.2所示第255位核苷酸的正向引物和特异性识别SEQID NO.2所示第282位核苷酸的反向引物；

IX)特异性识别SEQ ID NO.2所示第255位核苷酸的正向引物和特异性识别SEQ IDNO.2所示282-489位核苷酸的序列的反向引物；

X)特异性识别SEQ ID NO.2所示序列第1-255位核苷酸序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO.2所示第282位核苷酸的反向引物。

本发明实施例还提供了用于扩增或检测所述重组核苷酸片段的试剂盒，其包括如前所述的引物。

本发明实施例还提供了检测所述重组核苷酸片段的方法，包括下述步骤：

根据所述的重组核苷酸片段设计特异性引物，以待测样品基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR扩增产物。

上述检测所述重组核苷酸片段的方法在一种可能的实现方式中，所述引物如前所述。即以待测样品基因组为模板，利用上述引物进行PCR扩增，然后对获得的扩增片段进行测序。若测序结果显示其包括与SEQ ID NO.1所示38-573位核苷酸的序列或SEQ ID NO.2所示255-282位核苷酸的序列一致或互补的序列，则待测样品中含有所述重组核苷酸片段。通过检测确定了待测样品中含有所述重组核苷酸片段，即可确定待测样品中含有与重组核苷酸片段紧密连锁的广亲和基因。

上述检测所述重组核苷酸片段的方法在一种可能的实现方式中，采用Sanger测序法分析PCR扩增产物。

本发明实施例还提供了上述重组核苷酸片段作为分子标记在水稻育种中的应用；可选地，所述水稻育种指广亲和水稻的培育。

本发明实施例还提供了上述重组核苷酸片段作为分子识别标记在鉴定广亲和水稻材料中的应用；可选地，所述应用包括下述步骤：鉴定水稻材料是否含有上述重组核苷酸片段。

本发明实施例还提供了含有所述重组核苷酸片段的水稻植株或种子。

本发明实施例还提供了含有所述重组核苷酸片段的植物部分。所述植物部分指来源于含有所述重组核苷酸片段的水稻植株的材料组成的植物的任何部分，包括颖壳、花药、子房、胚乳、穗轴、叶片、叶鞘、根、茎。所述植物部分可以是活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。

本发明实施例还提供了含有所述重组核苷酸片段的商品。所述商品是指由含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子或植物部分衍生的材料组成的任何组合物或产品，包括：大米、大米淀粉、米糠油、胚芽油、米酒及利用大米制作的相关食品。包含所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子或植物部分可用于制造通常从水稻植株、种子或植物部分中获得的任何商品。如果来源于所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子或植物部分的商品中，存在任何可检测量的包含SEQ ID NO.1所示38-573位核苷酸序列、SEQ ID NO.1所示序列、SEQID NO.2所示255-282位核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示序列或其互补序列的核苷酸片段，那么商品在本发明的范围内。

本发明实施例还提供了鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法，包括如下步骤：检测待测水稻植株、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。

上述鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法在一种可能的实施方式中，采用前述引物来检测待测水稻植株、种子、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。

上述鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法在一种可能的实施方式中，采用前述检测所述重组核苷酸片段的方法来检测待测水稻植株、种子、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。

上述鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法在一种可能的实施方式中，采用前述试剂盒来检测待测水稻植株、种子、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。

本发明实施例还提供了一种广亲和水稻的选育方法，包括下述步骤：

以9311为轮回亲本，以含广亲和基因的水稻材料为供体亲本进行杂交，将得到的杂交种与轮回亲本进行回交，再将所得到的回交种进行自交，获得含有所述重组核苷酸片段的水稻植株；其中，所述杂交种、回交种和自交种需分别利用分子标记和水稻全基因组育种芯片进行前景选择和背景选择。

上述选育方法在一种可能的实现方式中，供体亲本为携带S5-n基因的水稻材料；可选地，供体亲本为Dular。

含有所述重组核苷酸片段的水稻植株是通过上述选育方法获得的。

上述选育方法在一种可能的实现方式中，所述分子标记包括S5F70、S5ORF3、S5ORF5、S5R240、f5F46、f5R43、C1F79、C1R79中的一种或多种；

其中，扩增分子标记的引物选自：

I)扩增分子标记S5F70的引物对，其包括：

正向引物：5’-TGTAGCCAACAGCCACAGTG-3’，如SEQ ID NO.3所示，

反向引物：5’-ACATCAGTAGCAGCACAAGG-3’，如SEQ ID NO.4所示；

II)扩增分子标记S5ORF3的引物对，其包括：

正向引物：5’-ACCCACCTTGGTTCATCG-3’，如SEQ ID NO.5所示，

反向引物：5’-CGCTTCTTTCCCGTCCT-3’，如SEQ ID NO.6所示；

III)扩增分子标记S5ORF5的引物对，其包括：

正向引物：5’-GAGGGAGACTGGCAGGCAGATC-3’，如SEQ ID NO.7所示，

反向引物：5’-ACAAACTCAGAGGAATACGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；

IV)扩增分子标记S5R240的引物对，其包括：

正向引物：5’-AGGTGGTCTTCGAAATAAAGGA-3’，如SEQ ID NO.9所示，

反向引物：5’-AGCCACTGAATGACTCAAGAGCA-3’，如SEQ ID NO.10所示；

V)扩增分子标记f5F46的引物对，其包括：

正向引物：5’-TTAGGACCTTGTATTTCGCA-3’，如SEQ ID NO.11所示，

反向引物：5’-TTGTAACTAACGCACAATCA-3’；如SEQ ID NO.12所示；

VI)扩增分子标记f5R43的引物对，其包括：

正向引物：5’-CAGTTGTTAACAGATGATGC-3’，如SEQ ID NO.13所示，

反向引物：5’-ACTGCTCCAGTCGCCACATT-3’，如SEQ ID NO.14所示；

VII)扩增分子标记C1F79的引物对，其包括：

正向引物：5’-GTTGTCAAATGATTGGTAGGCA-3’，如SEQ ID NO.15所示，

反向引物：5’-CTGTCAACATGAATACTCCA-3’，如SEQ ID NO.16所示；

VIII)扩增分子标记C1R79的引物对，其包括：

正向引物：5’-ACTTAGGACTGATCAGTTTGTC-3’，如SEQ ID NO.17所示，

反向引物：5’-TCTGTACCGTAGCTACTAGCT-3’，如SEQ ID NO.18所示。

上述选育方法在一种可能的实现方式中，包括下述步骤：

(1)以9311为轮回亲本，Dular为供体亲本进行杂交和回交一代，获得BC₁F₁种子，成苗后利用正向选择标记S5ORF3、S5ORF5对BC₁F₁全部单株进行检测，获得携带目标基因的单株后，筛选出1个与受体亲本表型最相似的单株；

以上述单株为父本与9311进行回交，收获BC₂F₁种子，成苗后利用S5ORF3、S5ORF5对群体所有单株进行检测，获得携带目标基因的单株后，混合授粉与9311进行回交，收获BC₃F₁种子，成苗后利用S5ORF3、S5ORF5对群体所有单株进行检测，同时利用S5-n上下游负向选择标记S5F70和S5R240进行同源重组检测，从中选择1个S5ORF3和S5F70发生重组的单株；

以上述单株为父本与受体亲本9311再次回交，获得BC₄F₁种子；成苗后，利用正向选择标记S5ORF3、S5ORF5对BC₄F₁全部单株进行检测，获得携带目标基因的单株后继续与受体亲本9311回交，获得BC₅F₁种子；成苗后，利用正向选择标记S5ORF3、S5ORF5对BC₅F₁全部单株进行检测，同时利用S5-n下游负向选择标记S5R240进行同源重组检测；

筛选获得携带S5-n基因，且S5-n的上下游两个标记S5F70和S5R240均发生同源重组的单株；利用水稻全基因组育种芯片Rice6K芯片对上述单株进行背景分析，从中选择背景回复率为99.39％的单株，收获BC₅F₂种子；该单株在1号染色体上和5号染色体各存在一个背景片段；

利用负向选择标记C1F79、C1R79、f5F46和f5R43对BC₅F₂群体进行检测，得到携带S5-n基因片段，遗传背景与9311一致的单株；利用二代测序技术进行前景和背景的确认；最终获得目标基因纯合，背景与9311相同的株系。

本发明实施例还提供了上述选育方法获得的广亲和水稻作为广亲和材料在其他水稻品种培育中的应用。

有益效果

本发明通过实施目标基因的正向分子标记选择及全基因组背景选择，选育得到并提供了两个重组核酸片段，本发明所提供的重组核酸片段与已知的广亲和基因紧密连锁，可以作为广亲和资源或分子标记应用于其他品种的培育。

本发明所提供的两个重组片段仅存在于所获得的重组单株NIL-(S5-n)中，具有极高的特异性，且易于被检测和确定，因此可以利用这两个重组片段作为分子识别标记，鉴定待测水稻材料是否为含有所述重组核苷酸片段的水稻材料(NIL-(S5-n))。通过检测待测水稻材料中是否含有该重组DNA序列，即可判断待测水稻材料是否为选育得到的NIL-(S5-n)，或是否是利用水稻材料NIL-(S5-n)为亲本选育而来。并可用于追踪该材料NIL-(S5-n)在育种中的使用去向。

本发明可以实现水稻品种特定性状的定向改良，在不改变品种原有优良农艺特性的情况下，显著提高特定性状，且能显著缩短育种周期，提高育种的效率。就本发明而言，将广亲和基因S5-n所在片段导入了受体亲本9311中，获得的NIL-(S5-n)水稻材料，保持了9311的原有优良农艺性状，同时显著提高了9311的亲和性，提高籼粳杂交稻的结实率。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1中NIL-(S5-n)水稻材料的GSR40K全基因组育种芯片的检测结果。

图2本发明实施例2中重组核苷酸片段RecS5-1测序比对结果；图中NIL-(S5-n)为获得的新品系，Dular为供体，9311为受体。

图3为本发明实施例2中重组核苷酸片段RecS5-2同源重组片段测序的比对结果；图中NIL-(S5-n)为获得的新品系，Dular为供体，9311为受体。

图4为本发明实施例3中9311及近等基因系NIL-(S5-n)的广亲和性鉴定结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

本发明中所提到的水稻基因组物理位置均参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第7.0版(http://rice.plantbiology.msu.edu)。

实施例1选育导入广亲和基因S5-n片段的单株

本实施例中使用的水稻材料为9311和Dular；9311和Dular均来自并可从华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室(553份微核心种质，RiceVarMap数据库公布)获得。

将Dular中的S5-n基因所在的基因组DNA片段导入到9311中，具体过程如下：

(1)前景选择标记的筛选：通过检索S5-n基因相关SCI文献，获取了S5-n的两个功能型分子标记S5ORF3和S5ORF5。基于公共数据库(RiceVarMap)设计了S5-n的上游负向选择标记S5F70和下游负向选择标记S5R240。上述分子标记的具体引物信息见表1。

表1正向及负向选择标记信息

(2)以9311为轮回亲本，Dular为供体亲本进行杂交和回交一代，获得BC₁F₁种子，成苗后利用正向选择标记S5ORF3、S5ORF5对BC₁F₁全部单株进行检测，获得携带目标基因的单株后，筛选出1个与受体亲本表型最相似的单株；

最终，筛选获得了5株携带S5-n基因，且S5-n的上下游两个标记S5F70和S5R240均发生同源重组的单株；利用水稻全基因组育种芯片Rice6K芯片(ZL 201210055775.X)对上述5个单株进行了背景分析，从中选择1个背景回复率为99.39％的单株，收获BC₅F₂种子，该单株在1号染色体上和5号染色体各存在一个背景片段；

(3)针对上述背景片段，基于公共数据(RiceVarMap)设计负向选择标记C1F79、C1R79、f5F46和f5R43，其具体引物信息见表1；

利用负向选择标记C1F79、C1R79、f5F46和f5R43对BC₅F₂群体进行检测，得到20株携带S5-n基因片段，遗传背景与9311一致的单株，利用二代测序技术进行前景和背景的确认；

最终获得目标基因纯合，背景与9311相同的株系1个，命名为NIL-(S5-n)，其二代测序的检测结果见图1。图1中，横坐标所指示方框表示水稻的12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位置[以兆碱基(Mb)为单位]，灰色区域代表受体亲本9311基因型，黑色线条表示供体亲本Dular基因型。图中第6号染色体上黑色线条显示区段即分别为导入的S5-n上游重组核苷酸片段RecS5-1和S5-n下游重组核苷酸片段RecS5-2。

实施例2导入S5-n基因片段后同源重组片段的确定

为了确定导入的广亲和基因片段的大小，对导入9311背景中的广亲和基因片段两侧的同源重组区域进行了定位和测序。

首先，根据二代测序技术检测结果，S5-n上游同源重组区间被定位于SNP标记Vg0605694805和Vg0605696333之间约1.5kb区间；S5-n下游同源重组区间被定位于SNP标记Vg0605886035和Vg0605886653之间约619bp区间。

为了进一步缩小S5-n上游和下游同源重组区间，在二代测序的基础上参照水稻参考基因组日本晴(MSU/TIG 7.0)下载对应区段的DNA序列并设计引物；以受体亲本9311和供体亲本Dular为对照，对NIL-(S5-n)的S5-n的上游和下游同源重组区域进行扩增，对PCR产物进行Sanger测序，最终将S5-n上游区域的同源重组确定在第6号染色体的5694906-5695441之间，S5-n下游区域的同源重组确定在第6号染色体的5886418-5886445之间，扩增引物及测序引物见表2，测序结果见图2和图3。

NIL-(S5-n)中S5-n上游同源重组片段RecS5-1的测序长度为933bp(其序列如SEQID NO.1所示)，其中，1-38bp为受体9311的基因组片段，与供体Dular相比，存在1个InDel；39-572bp为同源重组区段；573-933bp为供体Dular的基因组片段，与9311相比，存在2个InDel。

NIL-(S5-n)中S5-n下游同源重组片段RecS5-2的测序长度为489bp(其序列如SEQID NO.2所示)。1-255bp为供体Dular的基因组片段，与受体9311相比，存在1个InDel；256-281bp为同源重组区段；282-489bp为受体9311的基因组片段，与供体Dular相比，存在2个SNP。

表2重组DNA片段同源重组区域扩增和测序引物信息

实施例3 NIL-(S5-n)的广亲和性鉴定

为了鉴定携带S5-n的同源重组片段RecS5-1和RecS5-2的广亲和遗传效应，对9311和NIL-(S5-n)进行广亲和性鉴定，具体方法如下：

将9311和NIL-(S5-n)分别与选定的籼稻测验种IR64、南京11、广陆矮4号，粳测验种老光头83、安农晚粳B-2、巴利拉、日本晴、台中65进行人工去雄杂交，收获杂交F1种子，用于后续的育性相关性状考察。

分两期播种杂种F₁，播种日期分别为5月15日和5月25日(分别简称为S1和S2，用于评价杂交组合是否受到温度等不利环境因素的影响)。秧龄25-30天移栽，每个杂交组合种植30苗，正常的大田管理以保证水稻植株正常生长。

待抽穗扬花期，在每个杂种F1群体考察三个真杂种单株的胚囊育性，从植株三个正常的小穗上采集开花前1-2天小花，收集200个左右的小花用于考察花粉育性和胚囊育性。将取好的新鲜小花立即置于固定液FAA(甲醛：乙酸：50％乙醇＝5:6:89)中固定至少24小时，用50％的乙醇清洗2-3遍后，浸泡在70％的乙醇中保存在4℃。将水稻子房从小花中剥出，每个植株收集150个子房用于胚囊育性观察，使用的爱氏苏木精整体染色-透明法考察培养育性。

结果如图4所示；由图4可知，与亲本9311相比，NIL-(S5-n)具有更好的亲和性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2及其检测引物与应用

<130> 200419F

<141> 2020-08-09

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 933

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(38)

<223> 来源于9311基因组区域

<220>

<221> gene

<222> (39)..(572)

<223> 同源重组区段

<220>

<221> gene

<222> (573)..(933)

<223> 来源于Dular基因组区域

<400> 1

tcgttcctga ttaggatctc aaccatgtga aaaaaaaagt ttttcattta aaccccttcc 60

atattgcgat tgcctcgccg accagcggcg gaggcggccg gggatcgccg cggttgaggt 120

cgccatggcg gcgctgcccc acaccagggc cccagtttcg ggccactccc acctcgtcct 180

cgcctccctc cgccgcccgc ctggcccgtc tccgatctcc cagatgagat tgggtgcggc 240

ggagaaacgg gaggcgaggg aaagcgggtt cctcctccgg cagccacgcc ggttgcctcc 300

ccgtcgatcg cctccgcgtg ggtctctctc ccaattcccc agcatatgca ttcactaatc 360

gaggattcga atcgttgagc cgctcgcgtg taggtgatgt atctgccctg cttgccccgc 420

tctcctgcct gcggccattg ttgcctccac gagatcatgt ggtagtttaa ttaagcctga 480

ttggtgttgg tattttggtg gtaaaacatt ggtgttgctg ctgcagttac agaagtgtgt 540

cgaatggtga atgcatgctt gggaattggg atgtccactt cgagagtgtg ggttaatggg 600

tttgttgatc cgagcttgat ttgaaggcca tagatcgtga aattcctgaa gaactgcggt 660

ctaatcgctg aaatgaggta agcaacgata agcatttatt ttatgtcatt ttacatgctc 720

attactgctt cttttttgag gatttatttg tctagccttc gtgcagaata tatcattatc 780

gttactgcac ataatgggat atatatggaa gcaaatgtca ttaaaaaaac agtaatgaga 840

acatatattt acaaacaaga catacatata tccttgaaac agaaggaaaa ttaaatcgat 900

caatctacac tgttatactc tgtccgtccc agc 933

<210> 2

<211> 489

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(255)

<223> 来源于Dular基因组区段

<220>

<221> gene

<222> (256)..(281)

<223> 同源重组区段

<220>

<221> gene

<222> (282)..(489)

<223> 来源于9311基因组区段

<400> 2

tatttatagg tgtccgtgct tgaagtggga ccggcggctc ggcgcacttt gtcattgacc 60

aatcatgcaa ccaatcatcc atgtgcatgc agagtttccc attttcaatg gttccctgca 120

cgatatttct gaccccgttc tcatgtcact ttcttcgtct cacgtagcag ccactgtctc 180

tctgacgaat ggaaatacgt ctattattac tttatcgact attaccatat ccagaggcgt 240

ttcttttttt tttttcatat aataacaaac aatacacgag gtgtggtttg aggagtctcc 300

agcagcatga ccaagcaatg acgcgagcat aagaaaggtg cgtgagtgat caacagctga 360

tcatagagat tctgattgtc aaacatcccc cactgtggcg gtttgtaatt tatttgtatt 420

aatcgtgcgc caagtgtttt attgataacc attttaattt gctgcaaaag ctacgggtat 480

ggattatgt 489

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tgtagccaac agccacagtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

acatcagtag cagcacaagg 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

acccaccttg gttcatcg 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cgcttctttc ccgtcct 17

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gagggagact ggcaggcaga tc 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

acaaactcag aggaatacgc 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

aggtggtctt cgaaataaag ga 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

agccactgaa tgactcaaga gca 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ttaggacctt gtatttcgca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

ttgtaactaa cgcacaatca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

cagttgttaa cagatgatgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

actgctccag tcgccacatt 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

gttgtcaaat gattggtagg ca 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ctgtcaacat gaatactcca 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

acttaggact gatcagtttg tc 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

tctgtaccgt agctactagc t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

tgaagaactg cggtctaatc g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

ggagggagta ataagctggg a 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

cgtacgatta cgatcgttcc t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

cgattagacc gcagttcttc a 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

aacgcttctg cctctctctt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

gcgatattca ccccactgac 20

Claims

1.一种重组核苷酸片段组合，其特征在于，所述重组核苷酸片段组合由以下I）和II）组成：

I）如SEQ ID NO.1所示序列，或其互补序列；和

II）如SEQ ID NO.2所示序列，或其互补序列。

2.用于扩增或检测权利要求1所述的重组核苷酸片段组合的特异性引物。

3.用于扩增或检测权利要求1所述的重组核苷酸片段组合的试剂盒，其包括权利要求2所述的特异性引物。

4.检测权利要求1所述的重组核苷酸片段组合的方法，包括下述步骤：根据权利要求1所述的重组核苷酸片段组合设计特异性引物，以待测样品基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR扩增产物。

5.权利要求1所述的重组核苷酸片段组合作为分子标记在广亲和水稻育种中的应用。

6.权利要求1所述的重组核苷酸片段组合作为分子识别标记在鉴定广亲和水稻材料中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括下述步骤：鉴定水稻材料是否含有权利要求1所述的重组核苷酸片段组合。