CN109486996A - 重组核苷酸片段Rec78801和Rec78802及其检测引物与应用 - Google Patents

重组核苷酸片段Rec78801和Rec78802及其检测引物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及分子育种领域，具体涉及利用分子育种技术选育含抗褐飞虱基因的水稻植株时获得的重组核苷酸片段Rec78801和Rec78802及其检测引物与应用。本发明实施例提供的重组核苷酸片段，其选自：包含SEQ ID NO：1所示序列430‑603位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；包含SEQ ID NO：1所示序列的序列，或其变体，或其互补序列；包含SEQ ID NO：2所示序列678‑895位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；包含SEQ ID NO：2所示序列的序列，或其变体，或其互补序列；以及以上片段的组合。所述重组核苷酸片段可以作为主效基因的特异识别标记，运用于分子标记选择育种；并可作为特异分子识别标记，用于鉴定水稻材料。

Description

重组核苷酸片段Rec78801和Rec78802及其检测引物与应用
技术领域
本发明涉及分子育种领域，具体涉及利用分子育种技术选育含抗褐飞虱基因的水稻植株时获得的重组核苷酸片段Rec78801和Rec78802及其检测引物与应用。
背景技术
传统的水稻育种依赖于育种家对具体水稻材料在田间的表型的观察与评价，受到自然环境和个人经验的影响，其育种周期长，效率低。分子标记技术的发展为提高育种效率提供了新的手段，使得育种家可以通过检测与主效基因紧密连锁的特定核苷酸序列，即分子标记来实现对目标基因的选择，大幅度提高育种的准确度及缩短育种年限。
褐飞虱是水稻最严重的虫害之一，能使水稻严重减产甚至绝收，培育抗褐飞虱水稻新品种是防治褐飞虱最经济有效的方法。随着褐飞虱抗性基因定位及克隆工作的不断深入，目前已有30多个主效基因被定位，其中12个被成功克隆。药用野生稻是重要的褐飞虱抗性基因资源材料，其位于第3号染色体长臂末端和第4号染色体短臂仅着丝粒区域的Bph14和Bph15基因已经分别被成功克隆和精细定位。已有研究表明，聚合这两个基因可以显著提高受体水稻对褐飞虱的抗性。
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种重组核苷酸片段Rec78801和Rec78802，以及检测上述两个重组核苷酸片段的PCR引物与方法，该重组核苷酸片段是利用分子标记辅助选择育种技术培育含抗褐飞虱基因的水稻植株时获得的。其中，重组核酸片段Rec78801的核苷酸序列包含SEQ ID No.1所示430-603bp的序列，其位于水稻植株中Bph14基因上游且与该主效基因紧密连锁；重组核酸片段Rec78802的核苷酸序列包含SEQ ID No.2所示的678-895bp的序列，其位于水稻植株中Bph15基因下游并与其紧密连锁。水稻杂交过程中，不同来源的基因组在减数分裂过程中会发生同源重组，从而产生新的DNA序列组合。由于基因组重组是随机的，所以理论上不同来源的基因组重组产生的任何一个新的核苷酸序列都是不同的，具有极高的特异性。发生在主效基因附近的重组DNA序列与其紧密连锁，只存在于选育得到的后代重组单株中，具有唯一性。因此，一方面，由于重组DNA序列与特定主效基因连锁紧密，因此可以作为该主效基因的特异识别标记，运用于分子标记选择育种；另一方面，由于该重组DNA只存在于选育得到的后代重组单株材料中，因此也可作为该材料的特异分子识别标记，通过检测待测水稻材料中是否含有该重组DNA序列，即可判断待测水稻材料是否为选育得到的重组水稻植株，或是否是利用含有该重组DNA序列的水稻植株为亲本选育而来。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了重组核苷酸片段，其选自：
I)包含SEQ ID NO：1所示序列430-603位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；
II)包含SEQ ID NO：1所示序列，或其变体，或其互补序列；
III)包含SEQ ID NO：2所示序列678-895位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；
IV)包含SEQ ID NO：2所示序列，或其变体，或其互补序列；
V)I)-IV)中任意片段的组合。
上述重组核苷酸片段在一种可能的实施方式中，重组核苷酸片段来源于“五山丝苗”和“HB13001-14-5”杂交后代中基因组发生同源重组的重组单株；可选地，所述重组单株的遗传背景与“五山丝苗”完全相同，仅第3号染色体第35664621-36093075bp之间的核苷酸序列和第4号染色体第6587356-7000448bp之间的核苷酸序列来源于供体亲本“HB13001-14-5”，其余基因组成分与“五山丝苗”相同。
本发明实施例还提供了用于扩增或检测所述重组核苷酸片段的引物，所述引物包括本领域技术人员针对该扩增目标可设计得到的所有引物。
上述引物在一种可能的实施方式中，当扩增目标为SEQ ID No.1所示序列时，所述引物可选自以下I-V的任一组引物组合：
I)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列1-430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列603-833位核苷酸的序列的反向引物；
II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含：
a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第1-430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第431-602位核苷酸的序列的反向引物；
b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第431-602位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603-833位核苷酸的序列的反向引物；
III)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603位核苷酸的序列的反向引物；
IV)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603-833位核苷酸的序列的反向引物；
V)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第1-430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603位核苷酸的序列的反向引物。
上述引物在一种可能的实施方式中，当扩增目标为SEQ ID No.2所示序列时，所述引物可选自以下VI-X的任一组引物组合：
VI)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第1-678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895-1063位核苷酸的序列的反向引物；
VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含：
a)第三组引物对：特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第1-678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第679-894位核苷酸的序列的反向引物；
b)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第679-894位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895-1063位核苷酸的序列的反向引物；
VIII)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895位核苷酸的序列的反向引物；
IX)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895-1063位核苷酸的序列的反向引物；
X)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第1-678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895位核苷酸的序列的反向引物。
上述引物在一种可能的实施方式中，所述引物选自：
I)扩增或检测SEQ ID No：1所示序列的引物对为：
5’-AGAGATCACATACGGTGTACT-3’，如SEQ ID NO：3所示，
5’-TTTCTTGTTACGACCACGAGAT-3’，如SEQ ID NO：4所示；
和/或，任选地，
II)扩增或检测SEQ ID No：2所示序列的引物对为：
5’-CCACACCTTTTTTGTGTAATTGACTA-3’，如SEQ ID NO：5所示，
5’-AGGAACACCGCCACATTGGG-3’，如SEQ ID NO：6所示。
本发明实施例还提供了用于扩增或检测所述重组核苷酸片段的试剂盒，其包括如前所述的引物。
本发明实施例还提供了检测所述重组核苷酸片段的方法，包括下述步骤：
根据所述的重组核苷酸片段设计特异性引物，以待测样品基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR扩增产物。
上述检测所述重组核苷酸片段的方法在一种可能的实现方式中，所述引物如前所述。即以待测样品基因组为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增引物进行测序，若测序结果与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列一致或互补，则待测样品中含有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的重组核苷酸片段。通过检测确定了待测样品中含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的重组核苷酸片段，即可确定待测样品中含有与重组核苷酸片段紧密连锁的对应抗性基因。
上述检测所述重组核苷酸片段的方法在一种可能的实现方式中，采用Sanger测序法分析PCR扩增产物。
本发明实施例还提供了上述重组核苷酸片段作为分子标记在水稻育种中的应用；可选地，所述水稻育种指抗褐飞虱水稻的培育。
本发明实施例还提供了上述重组核苷酸片段作为分子识别标记在鉴定水稻材料中的应用。
本发明实施例还提供了含有所述重组核苷酸片段的水稻植株或种子。
本发明实施例还提供了含有所述重组核苷酸片段的植物部分。所述植物部分指来源于含有所述重组核苷酸片段的水稻植株的材料组成的植物的任何部分，包括颖壳、花药、子房、胚乳、穗轴、叶片、叶鞘、根、茎。所述植物部分可以是活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。
本发明实施例还提供了含有所述重组核苷酸片段的商品。所述商品是指由含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子或植物部分衍生的材料组成的任何组合物或产品，包括：大米、大米淀粉、米糠油、胚芽油、米酒及利用大米制作的相关食品。包含所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子或植物部分可用于制造通常从水稻植株、种子或植物部分中获得的任何商品。如果来源于所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子或植物部分的商品中，存在任何可检测量的包含SEQ ID NO：1所示序列430-603位核苷酸的序列、SEQ ID NO：1所示序列的序列、SEQ ID NO：2所示序列678-895位核苷酸的序列或SEQ ID NO：2所示序列的序列或其互补序列的核苷酸片段，那么商品在本发明的范围内。
本发明实施例还提供了鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法，包括如下步骤：检测待测水稻植株、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。
上述鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法在一种可能的实施方式中，采用前述引物来检测待测水稻植株、种子、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。
上述鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法在一种可能的实施方式中，采用前述检测所述重组核苷酸片段的方法来检测待测水稻植株、种子、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。
上述鉴定含有所述重组核苷酸片段的水稻植株、种子、植物部分或商品的方法在一种可能的实施方式中，采用前述试剂盒来检测待测水稻植株、种子、植物部分或商品的基因组中是否含有所述重组核苷酸片段。
本发明实施例还提供了一种抗褐飞虱水稻的选育方法，包括下述步骤：
以“五山丝苗”为轮回亲本，以含褐飞虱抗性基因的水稻材料为供体亲本进行杂交，将得到的杂交种与轮回亲本进行回交，再将所得到的回交种进行自交，获得含有所述重组核苷酸片段的水稻植株；其中，所述杂交种、回交种和自交种需分别利用分子标记和水稻全基因组育种芯片进行前景选择和背景选择。
上述选育方法在一种可能的实现方式中，供体亲本为同时含Bph14和Bph15基因的水稻材料；可选地，供体亲本为“HB13001-14-5”。
含有所述重组核苷酸片段的水稻植株是通过上述选育方法获得的。
上述选育方法在一种可能的实现方式中，所述分子标记包括76-2、InD4、RM570、RM114、RM261、15-6中的一种或多种；所述水稻全基因组育种芯片包括但不限于Rice6K。
上述选育方法在一种可能的实现方式中，包括下述步骤：
(1)以“五山丝苗”为轮回亲本，以同时含Bph14和Bph15基因的水稻材料为供体亲本进行杂交和回交，在BC1F1-BC4F1世代利用正向选择标记76-2和InD4对全部单株进行检测，获得携带2个目标基因的单株后，针对Bph14利用上下游负向选择标记RM570和RM114进行两侧同源重组筛选，针对Bph15利用上下游负向选择标记RM261和15-6进行两侧同源重组筛选；在BC4F1世代，获得仅携带Bph14和仅携带Bph15且上下游发生同源重组的单株；
可选地，供体亲本为“HB13001-14-5”；
(2)获得重组单株后，对其进行相互杂交产生MF1代，实现两个基因在同一水稻中的聚合，并利用水稻全基因组育种芯片Rice6K(ZL 201210055775.X)对聚合单株进行背景选择；随后选择背景回复率最高的1个单株自交收种，获得MF2代；
(3)MF2代种植后成苗，再次利用76-2和InD4对目标基因进行检测，选种目标基因型为纯合的单株分别利用Rice6K和GSR40K芯片进行前景和背景的确认；最终获得目标基因纯合，遗传背景与“五山丝苗”完全相同的株系。
上述选育方法在一种可能的实现方式中，扩增分子标记的引物选自：
I)扩增分子标记76-2的引物对，其包括：
正向引物：5’-CTGCTGCTGCTCTCGTATTG-3’，如SEQ ID NO：7所示，
反向引物：5’-CAGGGAAGCTCCAAGAACAG-3’，如SEQ ID NO：8所示；
II)扩增分子标记RM570的引物对，其包括：
正向引物：5’-AGAAATGGTGAAAGATGGTGCTACCG-3’，如SEQ ID NO：9所示，
反向引物：5’-CTGAATGTTCTTCAACTCCCAGTGC-3’，如SEQ ID NO：10所示；
III)扩增分子标记RM114的引物对，其包括：
正向引物：5’-CAGGGACGAATCGTCGCCGGAG-3’，如SEQ ID NO：11所示，
反向引物：5’-TTGGCCCCCTTGAGGTTGTCGG-3’，如SEQ ID NO：12所示；
IV)扩增分子标记InD4的引物对，其包括：
正向引物：5’-AGAATGCTAAAGATGACTGAA-3’，如SEQ ID NO：13所示，
反向引物：5’-AACGGTATTGTTCTTGTCTAA-3’，如SEQ ID NO：14所示；
V)扩增分子标记RM261的引物对，其包括：
正向引物：5’-CTACTTCTCCCCTTGTGTCG-3’，如SEQ ID NO：15所示，
反向引物：5’-TGTACCATCGCCAAATCTCC-3’；如SEQ ID NO：16所示；
VI)扩增分子标记15-6的引物对，其包括：
正向引物：5’-AGGTGAAGCTGATGTGCTTG-3’，如SEQ ID NO：17所示，
反向引物：5’-CGATACTTATTGCAACACAC-3’，如SEQ ID NO：18所示。
本发明实施例还提供了上述选育方法获得的抗褐飞虱水稻作为抗褐飞虱材料在其他水稻品种培育中的应用。
有益效果
本发明通过实施目标基因的正向分子标记选择及全基因组背景选择，选育得到并提供了两个重组核酸片段，本发明所提供的重组核酸片段与两个已知的褐飞虱抗性基因紧密相关，可以作为抗性资源或分子标记应用于其他品种的培育。
本发明所提供的两个重组片段仅存在于所获得的重组单株HB17004-7-88中，具有极高的特异性，无法被轻易去除或掩盖，且易于被检测和确定，因此可以利用这两个重组片段作为分子识别标记，鉴定待测水稻材料是否为含有所述重组核苷酸片段的水稻材料(HB17004-7-88)。通过检测待测水稻材料中是否含有该重组DNA序列，即可判断待测水稻材料是否为选育得到的HB17004-7-88，或是否是利用含有该重组DNA序列的水稻材料(HB17004-7-88)为亲本选育而来。并可用于追踪该材料(HB17004-7-88)在育种中的使用去向。
本发明可以实现水稻品种特定性状的定向改良，在不改变品种原有优良农艺特性的情况下，显著提高特定性状，且能显著缩短育种周期，提高育种的效率。就本发明而言，其通过七个世代的转育及基因聚合，将两个褐飞虱抗性基因所在片段同时导入了受体亲本“五山丝苗”中，显著提高了品种“五山丝苗”的褐飞虱抗性，能减少其在种植过程中因遭受褐飞虱危害而造成的严重减产问题。
本发明所提供的重组水稻材料HB17004-7-88保持了品种“五山丝苗”的原有优良农艺性状且褐飞虱抗性显著提高，可以代替“五山丝苗”在生产中直接进行推广应用，也可以替代“五山丝苗”作为杂交水稻的父本进行杂交水稻种子的生产和推广。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例1中HB17004-7-88水稻的GSR40K全基因组育种芯片的检测结果；其中，横坐标所指示方框一次表示水稻的12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位置[以兆碱基(Mb)为单位]，空白区域代表受体亲本‘五山丝苗’基因型，黑色线条表示供体亲本‘HB13001-14-5’基因型。图中第3号染色体的黑色线条显示区段最上部即为导入的重组核苷酸片段Rec78801所在位置，第4号染色体的黑色线条显示区段最下部即为导入的重组核苷酸片段Rec78802所在位置。
图2本发明实施例2中Rec78801同源重组片段测序的比对结果；图中所示的无差别长方形块代表比对结果中相同碱基，图中HB17004-7-88为获得的新品系，‘HB13001-14-5’为供体，‘五山丝苗’为受体。
图3为本发明实施例2中Rec78802同源重组片段测序的比对结果；图中所示的无差别长方形块代表比对结果中相同碱基，图中HB17004-7-88为获得的新品系，‘HB13001-14-5’为供体，‘五山丝苗’为受体。
图4为本发明实施例3中HB17004-7-88及近等基因系人工接种褐飞虱鉴定的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
本发明中所提到的水稻基因组物理位置均参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu)。
实施例1
选育导入抗褐飞虱基因Bph14和Bph15片段的单株
本实施例中使用的水稻材料为“五山丝苗”和“HB13001-14-5”。
其中，“五山丝苗”为合肥荃银高科种业有限公司提供；
“HB13001-14-5”为华中农业大学自主选育得到的携带抗褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15的水稻材料，已被证实具有良好的褐飞虱抗性，可从华中农业大学植物科学技术学院获得。
将“HB13001-14-5”中的Bph14和Bph15基因所在的基因组DNA片段导入到“五山丝苗”中，具体过程如下：
(1)前景选择标记的筛选：通过检索本发明涉及的两个褐飞虱抗性基因相关SCI文献，获取了与目标基因紧密连锁的分子标记，并从中筛选获得在两个亲本间具有良好多态性的分子标记76-2和InD4。负向选择标记则是在公共数据库Gramene及其他文献已报道的目标基因上下游范围内的SSR标记或InDel标记，通过在两个亲本检测是否具有良好多态性后确定的标记，其中Bph14上游负向标记确定为RM570，下游负向标记确定为RM114；Bph15上游负向标记确定为RM261，下游负向标记确定为15-6。上述分子标记的具体引物信息见表1。
表1正向及负向选择标记信息
(2)以“五山丝苗”为轮回亲本，“HB13001-14-5”为供体亲本进行杂交和回交一代，获得BC1F1种子，成苗后利用正向选择标记76-2和InD4对BC1F1全部单株进行检测，获得携带2个目标基因的单株后，筛选出4个与受体亲本表型最相似的单株；
以上述4个单株为父本，混合授粉与“五山丝苗”进行回交，收获BC2F1种子，成苗后再次利用76-2和InD4对群体所有单株进行检测，获得同时携带两个目标基因的单株后，一方面利用Bph14上下游负向选择标记RM570和RM114进行一侧同源重组检测，另一方面利用剩余的SSR标记进行背景检测，最后利用水稻全基因组育种芯片Rice6K(ZL201210055775.X)进行背景检测；
根据检测结果，从中选择了1株RM114发生重组，背景回复率最高的单株为父本，与受体亲本“五山丝苗”再次回交，获得BC3F1种子。成苗后，利用正向选择标记76-2和InD4对BC3F1全部单株进行检测；同时，利用RM570对Bph14上游的同源重组进行筛选，利用RM261和15-6对Bph15上下游进行同源重组检测，筛选获得1株携带Bph14基因，且RM570发生同源重组的单株；也筛选获得了另1株Bph15下游负向标记15-6发生同源重组的单株；利用Rice6K芯片，对这两株单株进行背景分析；
以上述分别携带Bph14和Bph15基因的两个单株为父本，继续与“五山丝苗”进行回交，分别收获两个BC4F1代种子。成苗后，分别利用76-2和InD4对两个群体的单株进行检测，同时利用RM261对携带Bph15基因的单株上游同源重组进行检测。经过检测，获得了若干株携带Bph14单基因的单株，筛选获得了1株RM261发生同源重组的单株；并用Rice6K芯片对筛选获得的Bph14单基因和Bph15单基因单株进行检测；
经过检测，筛选得到了2株仅携带Bph14基因片段，背景与“五山丝苗”完全相关的单株，以及1株仅携带Bph15且上下游均发生同源重组的单株；为了聚合Bph14和Bph15基因，选择1株携带Bph14基因的单株为父本，以携带Bph15基因、上下游均发生同源重组的单株为母本进行杂交，获得了聚合这两个基因的MF1代种子。再次利用76-2和InD4对Bph14和Bph15进行检测，获得了32株双基因杂合单株，随后利用Rice6K芯片从中筛选获得了1株背景与“五山丝苗”完全相同，仅携带杂合Bph14和Bph15的单株。
(3)选种的单株经过1次自交，获得了MF2代，成苗后，再次利用76-2和InD4对目标基因进行检测，选种目标基因型为纯合的单株，分别利用Rice6K和GSR40K芯片进行前景和背景的确认。最终获得1个目标基因纯合，背景与‘五山丝苗’完全相同的株系，命名为HB17004-7-88，其GSR40K芯片检测结果见图1。图中第3号染色体的黑色线条显示区段最上部即为导入的重组核苷酸片段Rec78801所在位置，第4号染色体的黑色线条显示区段最下部即为导入的重组核苷酸片段Rec78802所在位置。
实施例2
导入褐飞虱抗性基因片段后同源重组片段的确定
为了确定导入的褐飞虱抗性基因片段的大小，对导入‘五山丝苗’背景中的这两个褐飞虱抗性基因片段两侧的同源重组区域进行了定位和测序。首先，根据GSR40K芯片检测结果，Bph14上游同源重组区间被定位于SNP标记F0335655549TG和F0335664621CT之间约9.1kb区域(第3号染色体35655549bp-35664621bp)；Bph15下游同源重组区间被定位于SNP标记F0407000448AG和F0407001318GC之间约870bp区域(7000448bp-7001318bp)。
为了进一步缩小Bph14上游同源重组区间，在芯片结果的基础上参照水稻参考基因组日本晴(MSU/TIG 6.1)下载对应区段的DNA序列，人工设计引物；以受体亲本‘五山丝苗’和供体亲本‘HB13001-14-5’为对照，对HB17004-7-88的Bph14上游同源重组区域进行测序检测，并最终将该Bph14上游区域的同源重组确定在第3号染色体的35660772-35661210bp之间。
为了获得Bph14上游和Bph15下游同源重组片段的具体序列，同样参考日本晴基因序列，分别在第3号染色体的第35660772-35661210bp和第4号染色体第7000448bp-7001318bp区域两段设计引物，对其进行PCR扩增，并以扩增产物为模板，利用Sanger测序法进行测序，扩增引物及测序引物见表2，测序结果见图2和图3。图中所示的无差别长方形块代表比对结果中相同碱基，图中HB17004-7-88为获得的新品系，‘HB13001-14-5’为供体，‘五山丝苗’为受体。
‘HB17004-7-88’中Rec78801同源重组片段测序长度为833bp(其序列如SEQ IDNo.1所示)，其中，1-430bp为受体‘五山丝苗’的基因组区段，与供体‘HB13001-14-5’相比，存在18个SNP和1个InDel；431-602bp这一172bp区段为同源重组区段；603-833bp为供体‘HB13001-14-5’的基因组片段，与‘五山丝苗’相比，存在2个SNP。
‘HB17004-7-88’中Rec78802同源重组片段测序长度为1063bp(其序列如SEQ IDNo.2所示)。1-678bp为供体‘HB13001-14-5’的基因组区段，与受体‘五山丝苗’相比，存在4个SNP；679-894bp这一216bp区段为同源重组区段；895-1063bp为受体‘五山丝苗’的基因组片段，与供体‘HB13001-14-5’相比，存在5个SNP。
表2重组DNA片段同源重组区域扩增和测序引物信息
实施例3
抗性鉴定
为了鉴定‘五山丝苗’导入褐飞虱抗性基因组片段(目标单株)后的抗性效果，对“HB17004-7-88”、“五山丝苗”、“HB13001-14-5”、“TN1”和“B5”进行室内种植及人工接种褐飞虱抗性鉴定，具体方法如下：
在进行人工接虫鉴定前，先利用不携带任何抗性基因的TN1(Tai Chang Native1)材料对人工捕获的褐飞虱进行饲养。具体做法为：从大田中捕获一定数量的野生褐飞虱饲养在提前栽植的TN1秧苗上，人工饲养繁殖多代，使褐飞虱若虫数量增加达到鉴定需求。
将‘HB17004-7-88’、‘五山丝苗’、‘HB13001-14-5’、‘TN1’和‘B5’各准备100粒种子，同时将播种用的泥土用水浸泡3天。种子浸种24小时后在30℃条件下催芽48小时。种子出芽后，选择其中出芽状况良好的20粒条状播种在方长方形面包盒中，每个材料随机分别播3份，覆盖细土，并插上标签。以TN1和受体亲本作感虫对照。待秧苗长到1叶1心时，施少量尿素，使秧苗健康生长。秧苗生长到2叶1心期，用饲养好的2-3龄褐飞虱若虫进行人工接虫，平均每株秧苗接虫10-12头。在TN1都全部死亡时，一次性观察记载每一株水稻幼苗的抗性分数，随后计算每个株系材料3个重复的抗性分数均值，并根据均值得出该株系的抗性水平。
幼苗的单株抗性分数判定标准为：0级(植株健康，未受到伤害)，1级(1叶片轻微发黄)，3级(1-2片也发黄或1片叶萎缩)，5级(1-2片叶萎缩或1片叶枯萎)，7级(3-4片叶萎缩或2-4片叶枯萎，但植株仍是活的)，9级(植株死亡)。株系的抗性水平评价标准为：抗性分数0-0.9(免疫，I)；1.0-1.9(高抗，HR)；2.0-3.9(抗，R)；4.0-5.5(中抗，MR)；5.5.0-7.9(感，S)；8.0-9.0(高感，HS)。根据表3所显示的鉴定结果，感虫对照TN1全部死亡，表现高感褐飞虱(HS)，抗虫对照B5表现高抗褐飞虱(HR),供体亲本HB13001-14-5表现抗褐飞虱(R)，受体亲本“五山丝苗”则表现为感褐飞虱(S)，而重组材料HB17004-7-88表现高抗褐飞虱(HR)，表明导入Bph14和Bph15基因后，“五山丝苗”的褐飞虱抗性得到极大的提高。
表3苗期褐飞虱抗性鉴定表现
株系或名称 重复1 重复2 重复3 平均抗性
TN1 HS HS HS HS
B5 HR HR HR HR
HB13001-14-5 HR R R R
五山丝苗 S S S S
HB17004-7-88 R HR HR HR
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 重组核苷酸片段Rec78801和Rec78802及其检测引物与应用
<130> 180122F
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 833
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(430)
<223> 来源于“五山丝苗”基因组区域
<220>
<221> gene
<222> (431)..(602)
<223> 同源重组区段
<220>
<221> gene
<222> (603)..(833)
<223> 来源于“HB13001-14-5”基因组区域
<400> 1
tccaacgttt gaccgtccgt cttatttgaa aaaaattaaa aagacaagcc ccgcataaaa 60
tattaatcat gttttatcat ctaacaacaa taaaaattct aattataaaa taaatcatat 120
aagacggaca gtcaaacgtt gaaatggaaa cccacaattt gttttttttt ttacggggac 180
ggagggagta gaagacagtt gcaatttctt tcatatctga aatggataat gtcgccggtg 240
ccgttaggga agttgtgagc gcacgtcgcc ggacttgcgc ttttggatgg ttgcgaggaa 300
tattccgtcg tcagcagagt agatgcctga gccgcgcggc gacggcggcg cgattggccg 360
gtcggccggt ccaagtgctt gggccgtttc gggaatctcg tcatgccgac ccatgggaaa 420
gcttttcttg cttcgctggg catgcgtatg catatgcatg tgtcgctgcc gccgcctacc 480
gggatgctct agacggttga agaatttcaa caaggatatg cagtcgtgat ctctctctct 540
gcttcttttt ctgcttgcgt ttgcgtttgc atggctaaaa aattcagcaa tggaggcgca 600
gcgccacgtt gattgtttca tcacgttgct ctcctttact tcttgactag ggagactgag 660
aaatttgcag ctagaatggg cagatttgaa aacttatctg aaaatttcat aaaattccgt 720
ccaaaattgc tcccgtcggc cgatccacga gacccatggg ctggatcaca agccacgttg 780
ggccgggccg tatttttatc taccaagaaa agcaccaagt tgcgggcaat ttt 833
<210> 2
<211> 1063
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(678)
<223> 来源于“HB13001-14-5”基因组区段
<220>
<221> gene
<222> (679)..(894)
<223> 同源重组区段
<220>
<221> gene
<222> (895)..(1063)
<223> 来源于“五山丝苗”基因组区段
<400> 2
atgagttgga ttaaggactt atttatacta tttgattatg gggttaggat gagaagaata 60
aagcttgata atatgaaaac ggagaaagag agtgtgaaat agcaacatac ctgtattatg 120
tgccctttca acaatggatg agataatgct ggttgtagat tgatatcgat gcaatgaaac 180
acgtcgccgt ctccagtcta ttaattgtga aatttatatt gcttgtcaac tagacaaagg 240
aattatatat gtaaatctag aagaatcgaa attatatgga gatatgaaat gaaaaaggtg 300
tgtagatagt acctcaatga tcttgttgat aatcttgtcg gaaataggtt gatcataact 360
tgcttcatgc tttacatatc taccttcttg tattcctgcc gcaaggagga caagatatga 420
tatgaaaatt atcactggaa gttctagtgg tttggtcatt gagaaaactg aattgttcac 480
tattctagga tacagaccta ccgttttata ggacatggag ggtggctacc gctcttacag 540
taacccccgt tttaatgaat ttggtggaaa tgaactgtca tgtctttgac tcaaaagata 600
tagtgaagat ggaaaaaaca aaagacatga tgtatataat ctgcgaatga tgtacgagta 660
ttagtagaga aatcaaacat gaccgctcaa gaagaatgaa tttaatgcct ccagagaatc 720
tcatttattg cagttgccaa ctaagaaaga tatagagcaa taaacttaat aaatgcatga 780
aactagtcta tatttattag aaaatatata atctacagaa ttattggcac aaaaaatatt 840
gcaacgatat ataaattgtt gcaattagtt agtcagtgat tgagtccacg actcctcctc 900
gttgtaaccg tccctgcttc cccattcttc tctctcgctc tgtccctctc tctcgccacg 960
cgcaaccgtt gtcggtcgtc gagacgccac cactgtgtgc ctcttggctc ccagggcgcc 1020
ttcctgttct tctcctcttc aactccttat gtacaatcct cct 1063
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
agagatcaca tacggtgtac t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tttcttgtta cgaccacgag at 22
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ccacaccttt tttgtgtaat tgacta 26
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
aggaacaccg ccacattggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ctgctgctgc tctcgtattg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cagggaagct ccaagaacag 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
agaaatggtg aaagatggtg ctaccg 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ctgaatgttc ttcaactccc agtgc 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
cagggacgaa tcgtcgccgg ag 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ttggccccct tgaggttgtc gg 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
agaatgctaa agatgactga a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
aacggtattg ttcttgtcta a 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ctacttctcc ccttgtgtcg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
tgtaccatcg ccaaatctcc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
aggtgaagct gatgtgcttg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
cgatacttat tgcaacacac 20

Claims (10)

1.一种重组核苷酸片段，其选自：
I)包含SEQ ID NO：1所示序列430-603位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；
II)包含SEQ ID NO：1所示序列，或其变体，或其互补序列；
III)包含SEQ ID NO：2所示序列678-895位核苷酸的序列，或其变体，或其互补序列；
IV)包含SEQ ID NO：2所示序列，或其变体，或其互补序列；
V)I)-IV)中任意片段的组合。
2.用于扩增权利要求1所述的重组核苷酸片段的引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：当扩增目标为SEQ ID No.1所示序列时，所述引物可选自以下I-V的任一组引物组合：
I)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列1-430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列603-833位核苷酸的序列的反向引物；
II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含：
a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第1-430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第431-602位核苷酸的序列的反向引物；
b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第431-602位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603-833位核苷酸的序列的反向引物；
III)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603位核苷酸的序列的反向引物；
IV)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603-833位核苷酸的序列的反向引物；
V)特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第1-430位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：1所示序列第603位核苷酸的序列的反向引物；
和/或，任选地，
当扩增目标为SEQ ID No.2所示序列时，所述引物可选自以下VI-X的任一组引物组合：
VI)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第1-678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895-1063位核苷酸的序列的反向引物；
VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含：
a)第三组引物对：特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第1-678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第679-894位核苷酸的序列的反向引物；
b)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第679-894位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895-1063位核苷酸的序列的反向引物；
VIII)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895位核苷酸的序列的反向引物；
IX)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895-1063位核苷酸的序列的反向引物；
X)特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第1-678位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO：2所示序列第895位核苷酸的序列的反向引物。
4.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述引物可选自：
I)扩增或检测SEQ ID No：1所示序列的引物对为：
5’-AGAGATCACATACGGTGTACT-3’，如SEQ ID NO：3所示，
5’-TTTCTTGTTACGACCACGAGAT-3’，如SEQ ID NO：4所示；
和/或，任选地，
II)扩增或检测SEQ ID No：2所示序列的引物对为：
5’-CCACACCTTTTTTGTGTAATTGACTA-3’，如SEQ ID NO：5所示，
5’-AGGAACACCGCCACATTGGG-3’，如SEQ ID NO：6所示。
5.用于扩增或检测所述重组核苷酸片段的试剂盒，其包括权利要求2-4任一项所述的引物。
6.检测权利要求1所述的重组核苷酸片段的方法，包括下述步骤：根据所述的重组核苷酸片段设计特异性引物，以待测样品基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR扩增产物；
可选地，所述引物为权利要求2-4任一项所述引物。
7.权利要求1所述的重组核苷酸片段作为分子标记在水稻育种中的应用；
可选地，所述水稻育种指抗褐飞虱水稻的培育。
8.权利要求1所述的重组核苷酸片段作为分子识别标记在鉴定水稻材料中的应用。
9.一种抗褐飞虱水稻的选育方法，包括下述步骤：
以“五山丝苗”为轮回亲本，以含褐飞虱抗性基因的水稻材料为供体亲本进行杂交，将得到的杂交种与轮回亲本进行回交，再将所得到的回交种进行自交，获得含有所述重组核苷酸片段的水稻植株；其中，所述杂交种、回交种和自交种需分别利用分子标记和水稻全基因组育种芯片进行前景选择和背景选择；
可选地，供体亲本为同时含Bph14和Bph15基因的水稻材料；
和/或，可选地，所述分子标记包括76-2、InD4、RM570、RM114、RM261、15-6中的一种或多种；所述水稻全基因组育种芯片包括但不限于Rice6K；
和/或，可选地，所述选育方法包括下述步骤：
1)以“五山丝苗”为轮回亲本，以同时含Bph14和Bph15基因的水稻材料为供体亲本进行杂交和回交，在BC1F1-BC4F1世代利用正向选择标记76-2和InD4对全部单株进行检测，获得携带2个目标基因的单株后，针对Bph14利用上下游负向选择标记RM570和RM114进行两侧同源重组筛选，针对Bph15利用上下游负向选择标记RM261和15-6进行两侧同源重组筛选；在BC4F1世代，获得仅携带Bph14和仅携带Bph15且上下游发生同源重组的单株；
2)获得重组单株后，其相互杂交产生MF1代，实现两个基因在同一水稻中的聚合，并利用水稻全基因组育种芯片Rice6K对聚合单株进行背景选择；随后选择背景回复率最高的1个单株自交收种，获得MF2代；
3)MF2代种植后成苗，再次利用76-2和InD4对目标基因进行检测，选种目标基因型为纯合的单株分别利用Rice6K和GSR40K芯片进行前景和背景的确认；最终获得目标基因纯合，遗传背景与“五山丝苗”完全相同的株系。
10.权利要求9所述的选育方法获得的抗褐飞虱水稻作为抗褐飞虱材料在其他水稻品种培育中的应用。
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