CN102181440B - 水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记及其应用。通过将水稻抗虫品种T12（♂）与感虫品种9311（♀）杂交获得的F2各单株的基因型，同时结合F2:3各家系的抗褐飞虱的抗性级别进行遗传连锁分析，获得抗虫品种T12抗性基因bph7并定位于分子标记RM3448和RM313之间。与该基因连锁的分子标记还有RM28295、RM519、RM28305和RM28374。本发明中的分子标记可以有效检测抗虫品种T12及其衍生品种（系）中是否含有该主效基因位点，大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率，获得含有bph7基因的抗褐飞虱水稻品种。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，涉及水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记，本发明还涉及该分子标记在选育水稻抗褐飞虱品种中的应用。
背景技术
水稻是世界上最主要的粮食作物之一。同时，它也遭到不同病菌和害虫的侵袭，使水稻生产受到严重的威胁。其中，稻褐飞虱就是水稻种植过程中为害最严重虫害之一，其成虫和若虫以口针刺吸水稻韧皮部中的汁液，从而引起植株的叶片变黄，严重时整个植株枯死，最后可能导致减产甚至绝收。据中国农业年鉴记载，在1966、1969、1973、1977、1983和2003年这6年中全国性褐飞虱大发生；而在1987、1991、2005、2006和2007年这5年中全国性褐飞虱特大发生。褐飞虱发生面积达到水稻种植总面积的50％以上，给我国水稻生产造成了严重的威胁。由于褐飞虱的为害多发生在水稻的灌浆期，若此时大量使用杀虫剂进行防治，会对环境和稻谷造成较严重的污染。相反，若利用抗褐飞虱基因来培育抗虫水稻品种，这将是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。
迄今为止，在不同的籼稻品种和野生稻材料中已经鉴定并报道了23个抗褐飞虱主效基因（Rahman et al. 2009 High-resolution mapping of two rice brown planthopper resistance genes, Bph20(t) and Bph21(t), originating from Oryza minuta. Theor Appl Genet 119(7): 1237-1246.）。除了bph5和bph8外，其余抗褐飞虱主效基因均已经利用分子标记被定位到水稻不同的染色体上。早期鉴定的抗褐飞虱基因中，如Bph1、bph2和Bph3等，都已经利用传统的杂交方式转育到一些性状优良的水稻材料中并培育成抗虫品种，同时在亚洲热带水稻种植区大面积推广种植。然而，随着抗褐飞虱水稻品种的推广种植，褐飞虱出现新的能致害抗性品种的生物型，从而使抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性。例如，携带抗性基因Bph1的水稻抗虫品种经过2～3年（约24～36代）推广种植后，它们就失去对褐飞虱群体的抗性。而携带Bph1和另外几个微效抗性位点的水稻品种IR64对褐飞虱群体表现出更持久的抗性性状。可见，在水稻生产中迫切需要更多的新的抗褐飞虱基因，以利于培育更多携带不同抗性基因的水稻品种。
由于水稻材料抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地导入和聚合不同的抗虫基因。本发明是在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）技术可以有目的地进行抗虫基因的导入和聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记，通过检测这些与抗褐飞虱主效基因紧密连锁的分子标记，能够预测水稻植株对褐飞虱的抗性，加快抗褐飞虱水稻品种的选择进度。
本发明水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记，由下述之一的引物对经PCR扩增获得：
1）标记引物RM28295，
左端引物序列，CCAGCTTAGCTATCAACGGATCG
右端引物序列，ACCTCCTCCGTTTCAATTCTCC；
2）标记引物RM519，
左端引物序列，AATTTCCGCGAAATCAGCATCC
右端引物序列，TCATCTGGACAGTCGAGGTACGC；
3）标记引物RM28305，
左端引物序列，GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG
右端引物序列，GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG；
4）标记引物RM3448，
左端引物序列，TATTTACCACTCCCTGCCACTGC
右端引物序列，AGGGAAGGGTACAAGGGTGTCG；
5）标记引物RM313，
左端引物序列，TGCTACAAGTGTTCTTCAGGAC
右端引物序列，GCTCACCTTTTGTGTTCCAC；
6）标记引物RM28374，
左端引物序列，GTCATCATGCGAAAGCAACAAAGG
右端引物序列，CGACATCGCCTTCAAGGTTGG。
本发明还提供水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记方法，其是用上述之一的引物对扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM28295能够扩展出100bp的扩增片段，或者用引物RM519能够扩增出125bp的扩增片段，或者用引物RM28305能够扩增出142bp的扩增片段，或者用引物RM3448能够扩增出163bp的扩增片段，或者用引物RM313能够扩增出111bp的扩增片段，或者用引物RM28374能够扩增出169bp的扩增片段，均标志着水稻T12抗褐飞虱主效基因位点bph7的存在。该基因位点位于水稻基因组第4染色体长臂的分子标记RM28295和RM313之间的区域内。本发明用RM28295和RM313筛选了2430个BC2F2和BC3F2的单株，得到了在这两个分子标记间有重组的单株。分析重组单株的基因型和抗虫级别后发现，分子标记RM3448和RM313与抗褐飞虱主效基因bph7最靠近；同时，分子标记RM28295、RM519、RM28305和RM28374也均能用于筛选含bph7基因的抗褐飞虱水稻品种。
筛选上述分子标记引物的过程如下：
（1）最早由Kabir & Khush（1988）利用抗虫性筛选发现水稻品种T12对褐飞虱Bangladesh群体（生物型4）具有抗性，通过遗传分析表明该品种携带一对隐性抗褐飞虱基因并将其命名为bph7（Kabir & Khush. 1988 Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100, 54–58）。但到目前为止，bph7仍未定位在水稻的染色体上，这给该抗虫基因在水稻分子辅助育种中的应用带来很大的困难。同时，水稻品种T12中抗性基因bph7的鉴定已经过去二十多年，在此过程中世界不同水稻种植地区的褐飞虱群体遗传结构可能发生了变化。因此，评价水稻品种T12对我国主要褐飞虱群体的抗性级别并且利用SSR分子标记定位该抗虫基因是非常必要的，这将为该基因在我国的水稻育种应用中提供技术支持。因此，本发明筛选并开发了基于PCR技术的SSR分子标记。根据gramene网站（http://www.gramene.org）公布的SSR分子标记，按照较均匀的遗传距离选择一定数目分子标记进行合成。
（2）以高感褐飞虱的籼稻品种9311为母本，抗褐飞虱的品种T12为父本，配制杂种，构建9311/T12 F2分离群体用于分子标记分析；每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系并用于苗期抗虫鉴定。
（3）用CTAB法（Murray & Thompson，1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325）提取亲本T12、9311及F2群体各单株的基因组DNA。用方法（1）获得的备选标记对两亲本进行多态性筛选，PCR反应在PTC-100扩增仪上进行，扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，记录并选择在亲本间具有多态性的SSR标记用于后续分析。
（4）采用苗期接虫进行抗虫性鉴定，褐飞虱为生物型1和生物型2混合群体。两叶一心期按8头/苗的比例接种2～3龄褐飞虱若虫，当对照感虫品种TN1死亡株数达到90%以上时，参照Huang等介绍的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价（Huang et al. 2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102,929–934），对亲本材料和群体中的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别。
（5）根据F2单株的抗虫级别，分别选择10个极端抗虫单株和10个极端感虫单株的DNA混合构建抗、感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗、感DNA池并获得有多态性的分子标记，该类多态性标记很可能与抗性性状连锁。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选F2分离群体的各个单株，PCR程序同上，获得群体基因型资料。根据连锁交换规律，利用软件JoinMap 3.0将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合F2群体各个单株的分子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别，利用MapQTL 5.0软件复合区间作图法，对目标染色体进行QTL位点扫描。
（6）根据初次QTL鉴定的结果，本发明用RM28295和RM313筛选了2430个BC2F2和BC3F2群体的单株，DNA提取、SSR的PCR扩增及电泳分析同（2），获得了37个在分子标记RM28295和RM313之间有重组的单株。结合37个重组单株的基因型和相应家系的抗虫级别，得到与抗褐飞虱主效基因bph7共分离的分子标记。
本发明的有益效果：
1. 通过本发明首次用SSR标记定位了水稻品种T12中的抗褐飞虱主效基因bph7；
2. 通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗虫品种或品系用于水稻育种。其检测方便快速，不受环境影响；
3. 辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对水稻品种进行抗褐飞虱性状的鉴定并进行选择，操作非常复杂，同时还受环境的影响。此外，在进行抗虫鉴定之前，首先要获得虫源并饲养繁殖褐飞虱群体，同时还要求接种虫源与水稻秧苗苗龄较同步，这同样给育种工作带来麻烦，若不能有效地处理好虫源、秧苗以及环境之间的关系，抗褐飞虱的表型鉴定结果可靠性就很低。因此，抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。然而，通过检测抗褐飞虱主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻材料的选择效率，极大地缩短水稻品种的育种周期。
附图说明
图1．水稻品种T12抗褐飞虱主效基因bph7定位在第12染色体。A，bph7初步定位。垂直线表示水稻第12号染色体，水平短线表示染色体上的分子标记，括号内的数值表示标记间的遗传距离（cM），n为群体的单株数目；B，RM28295和RM313筛选BC2F2和BC3F2重组单株的结果，结合表现型和基因型结果，bph7定位于RM3448和RM313之间。参照9311的基因组序列，这两个标记间的物理距离约为485kb。n表示筛选的BC2F2和BC3F2单株总数。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
（一）9311/T12 F2群体构建及表型鉴定
（1）在1988年，Kabir & Khush利用抗虫性筛选发现水稻品种T12对褐飞虱Bangladesh群体（生物型4）具有抗性，通过遗传分析表明该品种携带一对隐性抗褐飞虱基因并将其命名为bph7（Kabir & Khush, 1988 Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100, 54–58）。水稻品种来源于中国农业科学院种质资源库，T12来源于国际水稻研究所水稻种质资源库。抗虫鉴定实验表明，T12对我国的褐飞虱群体具有中等抗性。为了寻找简单有效且与bph7紧密连锁的分子标记，本发明以感虫品种9311为母本，以抗褐飞虱品种T12为父本杂交，得到的F1再自交，从而获得F2分离群体；然后，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系。
（2）采用苗期接种对亲本和F2:3家系进行抗虫性鉴定。为确保亲本和F2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系（品种）各60粒种子播种于一个长58cm、宽38cm和高9cm，且盛有7cm厚营养土的面包盒中。每盒每个材料播种3个重复，其中随机播种亲本和TN1(感性对照)各3个重复。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长至两叶一心期时，按8头/苗的比例接种2～3龄褐飞虱若虫，最后罩上透光性良好的尼龙纱网。当感虫品种TN1全部死亡时，参照Huang等（Huang Z et al，2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102,929–934）介绍的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价（表1），对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。
表1：水稻抗褐飞虱性能鉴定的分级标准
| 抗性级别 | 受害程度 (当90％以上台中本地1号死亡时考察) | 抗性水平 |
| 0 | 植株生长健康，无叶片受害 | 抗（R） |
| 1 | 一片叶黄 | 抗（R） |
| 3 | 一至两片叶黄，或一片叶枯萎 | 中抗（MR） |
| 5 | 两到三片叶黄，或二片叶枯萎 | 中抗（MR） |
| 7 | 三到四片叶枯萎，但植株尚未死亡 | 感（S） |
| 9 | 整株死亡 | 感（S） |
（二）9311/T12 F2群体的分子标记分析
（1）用CTAB法（Murray & Thompson，1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321–4325）提取亲本及F2群体各单株的基因组DNA。
（2）根据gramene网站（http://www.gramene.org/）公布的SSR分子标记，按照较均匀的遗传距离选择一定数目分子标记进行合成。
（3）SSR标记的分析参照Temnykh的方法（Temnykh et al，2000 Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice. Theor Appl Genet 100：697–712）。10μl反应体系包括：10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq polymerase和20ng DNA模板。扩增反应在PTC-100 PCR仪上进行：94℃ 2min；94℃ 15sec，55℃ 30sec，72℃ 1.5min，35个循环；72℃ 5min。扩增产物用6%的聚丙烯酰氨凝胶进行分离，通过银染显色（Zhu et al, 2004 Identification and characterization of a new blast resistance gene located on rice chromosome 1 through linkage and differential analyses. Phytipathology 94:515-519）。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，获取群体基因型资料。
（4）根据F2单株的抗虫级别，分别选择10个极端抗虫单株和10个极端感虫单株的DNA混合构建抗、感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗、感DNA池并获得有多态性的分子标记，该类多态性标记可能与抗性性状连锁。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选F2分离群体的各个单株，PCR程序同上，获得群体中单株的基因型资料。根据连锁交换规律，利用软件JoinMap 3.0将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合F2群体各个单株的分子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别，利用MapQTL 5.0软件复合区间作图法，对目标染色体进行QTL位点扫描。
（三）利用分子标记筛选9311/T12 BC2F2和BC3F2群体定位bph7基因
根据QTL的定位结果，用两侧的SSR标记RM28295和RM313筛选了BC2F2和BC3F2单株，获得两个标记间发生重组的单株。结合检测各单株的基因型和表型，考察标记与抗性表型共分离的情况。
（四）结果与分析
苗期抗虫鉴定结果表明，水稻品种T12对褐飞虱表现出中等抗性，9311表现出高感性状；它们的抗虫级别分别为4.9和8.7。140个F2:3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为2.4，最大为8.8。根据褐飞虱的抗虫级别，我们可以将F2:3家系分为抗虫、抗感分离和感虫3种表型，而相应的F2单株的基因型则分别记为RR（纯合抗虫）、Rr（杂合抗虫）和rr（纯合感虫）3种。若以分别以0～7.0和7.1～9.0来划分抗感植株，F2群体对褐飞虱的抗感分离符合3:1的比例（90:40，χ2=2.31 < χ2 0.05=3.84）（表2）。
根据gramene网站（http://www.gramene.org/）公布的分子标记，按照较均匀的遗传距离选择并合成一定数目的SSR分子标记以备选。
用亲本间有多态性的SSR标记分析F2单株的基因型，同时结合各单株的抗性值进行QTL扫描。结果表明第4染色体长臂RM28295和RM313间存在一个QTL位点，LOD值为13.4，贡献率为38.3%，该QTL所在的分子标记RM28295和RM313相距1.1cM（图1）。RM28295和RM313的选择正确率可以达到98～99%。
表2 9311/T12 F2分离群体130个单株对褐飞虱抗感分离比
| F2基因型a | F2个体数b | 相应的F2:3家系表现型c |
| RR和Rr | 90 | RS＜7 |
| rr | 40 | 7≤RS |
a RR，纯合抗虫；Rr杂合抗虫；rr，纯合感虫；b 3RR(Rr) : 1rr 适合性检测值χ2=2.31＜χ2 0.05=3.84；c抗虫级别：RS，Resistance Score
表3 分子标记筛选的BC2F2和BC3F2重组单株的基因型及表现型
a 9311和T12是两个亲本材料；表中所列单株是部分重组单株，通过分析重组单株基因型和抗虫级别，将bph7基因定位于RM3448和RM313之间。表中三种基因型分别为：A，9311纯合的基因型；B，T12纯合的基因型；H，9311和T12杂合的基因型。
由于RM28295和RM313之间的物理距离仍较大，在测序的籼稻品种9311中相距约0.7Mb，为了寻找与bph7更紧密连锁的标记，本发明用RM28295和RM313筛选了2430个BC2F2和BC3F2单株。结果显示，共有22个单株在标记RM28295和RM313之间存在重组（表3）。于是，用这两个标记之间的其它的SSR标记检测重组单株的基因型，并结合重组单株的抗虫鉴定结果，最后将bph7定位于RM3448和RM313之间。在测序的9311品种中，RM3448和RM313之间的物理距离仅有485kb，因此，利用上述分子标记来鉴定bph7抗性基因的存在具有很高的效率，这样也大大提高水稻抗褐飞虱品种的育种进度。
实施例2 分子标记的验证
1、材料和方法
1.1材料
阴性品种：10份，感虫品种9311、台中本地1号（TN1）、9311 X T12育种组合中的不抗虫材料8份。
阳性品种：抗虫品种T12和9311 X T12育种组合中的抗虫材料9份。
分子标记引物：RM28295、RM519、RM28305、RM3448、RM313、RM28374。
1.2方法
CTAB抽提法提取水稻样品基因组DNA（方法同实施例1）。分别用引物RM28295、RM519、RM28305、RM3448、RM313和RM28374扩增样品DNA。反应体系中包括0.10μM的引物、250μM dNTP、1×PCR反应缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2)、100ng的DNA模板、1UTaq酶。反应程序为：94℃预变性5min，循环(94℃ 1min、51-61℃ 1min、72℃ 1min)41次，最后72℃延伸10min。根据引物的特性，对退火温度作相应的修改（退火温度分别为：58℃（RM28295）、55℃（RM519）、57℃（RM28305）、55℃（RM3448）、55℃（RM313）和52℃（RM28374）。PCR扩增产物在6％的聚丙烯胺凝胶电泳分离。电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析。
2、结果：
用上述方法，分别对水稻品种T12等二十份不同样本进行扩增。结果表明，在阳性样本中均能分别扩增出相应的100bp片段、125bp片段、142bp片段、163bp片段、111bp片段和169bp片段，而在阴性样本中均不能扩增出这些片段。
由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱的主效基因，从而大大提高育种效率。
Claims (3)
1.水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记，其由下述之一的引物对经PCR扩增获得：
1）标记引物RM28295，
左端引物序列，CCAGCTTAGCTATCAACGGATCG
右端引物序列，ACCTCCTCCGTTTCAATTCTCC；
2）标记引物RM519，
左端引物序列，AATTTCCGCGAAATCAGCATCC
右端引物序列，TCATCTGGACAGTCGAGGTACGC；
3）标记引物RM28305，
左端引物序列，GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG
右端引物序列，GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG；
4）标记引物RM3448，
左端引物序列，TATTTACCACTCCCTGCCACTGC
右端引物序列，AGGGAAGGGTACAAGGGTGTCG；
5）标记引物RM313，
左端引物序列，TGCTACAAGTGTTCTTCAGGAC
右端引物序列，GCTCACCTTTTGTGTTCCAC；
6）标记引物RM28374，
左端引物序列，GTCATCATGCGAAAGCAACAAAGG
右端引物序列，CGACATCGCCTTCAAGGTTGG；
其中，所述bph7来自水稻T12，扩增模板为水稻T12基因组；所述标记引物1）~6）的扩增长度分别为100bp、125bp、142bp、163bp、111bp以及169bp。
2.权利要求1所述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。
3.一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其用权利要求1中所述的引物对之一扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM28295能够扩增 出100bp的扩增片段，或者用引物RM519能够扩增出125bp的扩增片段，或者用引物RM28305能够扩增出142bp的扩增片段，或者用引物RM3448能够扩增出163bp的扩增片段，或者用引物RM313能够扩增出111bp的扩增片段，或者用引物RM28374能够扩增出169bp的扩增片段，则标志着该待检水稻存在抗褐飞虱主效基因bph7。
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