CN111621589B - 水稻抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

发明涉及水稻品种抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记方法，用分子标记XH‑1引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记NWD‑3引物：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4扩增水稻或育种材料DNA，如果用分子标记XH‑1引物能够扩增出200bp的扩增片段，或用分子标记NWD‑3引物同样能够扩增出200bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱qBPH6基因的存在。本发明所述方法可预测水稻对褐飞虱的抗性水平，大大提高育种中抗褐飞虱品系的选择效率。

Description

水稻抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记及其应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，持续稳定地增加水稻产量是世界粮食安全的重要保障。然而，水稻生产受到多种病虫害的威胁，其中褐飞虱是一种季节性迁飞的同翅目飞虱科害虫，主要聚集于水稻植株下部，通过刺吸韧皮部营养物质为害水稻。严重时会造成水稻基部组织坏死，植株倒伏、枯死，产量严重受损。褐飞虱不仅会通过直接取食危害水稻和产卵造成植株的机械损伤，还是等病毒病的主要传播介体，对水稻造成严重威胁。长期以来，人们依靠农药对褐飞虱进行防治。但是，农药的过度使用不仅造成环境污染、杀伤天敌，而且害虫抗药性的形成，使农药的效率降低、用量增加，形成恶性循环。
推广应用抗褐飞虱水稻品种是综合治理该虫的最有效措施之一，能够抑制害虫的生长、发育和繁殖，而且不增加农民生产成本。在褐飞虱抗源筛选的基础上，研究者在水稻新品种选育、水稻抗虫机制等方面取得一定的成果，鉴定了一些抗褐飞虱的基因/QTL。
国际水稻研究所和其他国内外研究机构从20世纪70年代开始就进行了褐飞虱抗源的筛选。经过大量的筛选工作，研究人员从数万份水稻种质资源中找到并命名了30多个基因，其中有9个基因已经被克隆，包括BPH3、BPH6等主效基因。基于褐飞虱的抗源筛选，育种专家开展了抗性育种研究，通过遗传改良手段培育出一批抗褐飞虱兼抗多种病虫害的水稻新品种，为水稻生产的可持续发展发挥重要促进作用。但由于褐飞虱的繁殖率很高，环境的选择压会加快群体的进化，所以育种实践需要不断发掘抗褐飞虱新抗源，并选育更新换代的抗性品种。
利用分子标记辅助选择技术的基因聚合育种已成为获得作物持久抗性的重要途径。与抗性性状紧密连锁的分子标记是进行分子标记辅助选择和聚合多个基因的先决条件。在水稻育种中应用分子标记进行选择具有特异性高、经济高效、周期短的优势，而且不受基因表达差异性和环境条件多样性的影响。因此，在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择技术，可以有目的地进行抗虫基因或QTL的聚合，选育持久抗性品种。
发明内容
本发明的目的是提供水稻品种W41126抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记及其应用，通过检测与抗褐飞虱基因连锁的分子标记，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻品种的选育进度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种水稻抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记方法，用分子标记XH-1引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记NWD-3引物：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4扩增水稻或育种材料DNA，如果用分子标记XH-1引物能够扩增出200bp的扩增片段，或用分子标记NWD-3引物同样能够扩增出200bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因qBPH6的存在。
本发明还提供一种抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记XH-1引物：
前引物序列AGAGGCCGTGGATGATGA(如SEQ ID NO.1所示)
后引物序列AGAACGCTGCCAATTGTAAC(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明还提供一种抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记NWD-3引物：
前引物序列TCCATGTCTCCATCTCGTTG(如SEQ ID NO.3所示)
后引物序列CAAGAGAGGTGGTCACAGCA(如SEQ ID NO.4所示)。
本发明还提供所述抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记方法、所述分子标记XH-1或分子标记NWD-3在水稻育种中的应用。
本发明所述的鉴定抗褐飞虱植物品种或品系中的应用，具体为用分子标记XH-1引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记NWD-3引物：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4扩增水稻或育种材料DNA，如果用分子标记XH-1引物能够扩增出200bp的扩增片段，或用分子标记NWD-3引物同样能够扩增出200bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻或育种材料为抗褐飞虱品种或品系。
本发明还提供所述抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记方法、所述分子标记XH-1、或分子标记NWD-3在筛选抗褐飞虱植物品种或品系中的应用。
本发明所述的筛选抗褐飞虱植物品种或品系中的应用，具体为用分子标记X-1引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记NWD-3引物：SEQ ID O.3/SEQ ID NO.4扩增水稻或育种材料DNA，如果用分子标记XH-1引物能够扩增出200bp的扩增片段，或用分子标记NWD-3引物同样能够扩增出200bp的扩增片段，则标志着待筛选水稻或育种材料为抗褐飞虱品种或品系。
本发明所述的抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记及其应用可以适用于所有水稻品种W41126后代品系。
本发明所提供的水稻品种抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记及其应用，具有以下优点：
1)通过本发明所提供分子标记定位的qBPH6基因位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗褐飞虱基因连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性；进行水稻品种或品系的基因型检测，可以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗虫品种或品系用于水稻育种。基因位点的检测方便快速，不受环境影响；
2)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对褐飞虱抗性进行单株选择。对水稻抗褐飞虱进行表型鉴定复杂，表型鉴定的结果可靠性低。通过检测抗褐飞虱基因位点，可以在苗期就鉴定出抗褐飞虱的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱材料的选择效率。
附图说明
图1抗褐飞虱基因qBPH6在染色体上的位置。
图2利用qBPH6位点紧密连锁分子标记XH-1进行单株选择。M为Marker；P1为抗虫亲本W41126；P2为感虫亲本C418；1-5为抗虫单株；6-10为感虫单株；11-16为中抗单株。
图3利用qBPH6位点紧密连锁分子标记NWD-3进行单株选择。M为Marker；P1为抗虫亲本W41126；P2为感虫亲本C418；1-5为抗虫单株；6-10为感虫单株；11-16为中抗单株。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。
实施例1
(一)W41126/C418 F2群体构建及表型鉴定
水稻品种W41126高抗褐飞虱，水稻品种C418高感褐飞虱，两个品种分别用作父本和母本，杂交产生F1，F1自交产生F2群体。由于人工室内接虫鉴定的规模限制，本研究选取120个F2单株种植后自交获得F2:3家系。每个家系用苗期集团鉴定法鉴定褐飞虱的抗性等级，进行3次重复。
水稻苗期抗褐飞虱表型的评价采用改进的标准苗期集团鉴定法。每个家系3个重复，每个重复30-35粒种子，浸种催芽后将露白的种子播于直径为8cm且装有营养土的塑料圆钵内，随机分布于周转箱中。待幼苗长至一叶一心期(约播种后一周)，淘汰弱苗和小苗，以保证试验用苗一致。按照每株20头左右二、三龄的褐飞虱若虫进行接种，待感虫对照C418完全死亡后，开始统计各个品种(家系)死苗率。参照IRRI的标准(表1)评定供试材料的抗性等级。
表1国际水稻研究所苗期水稻褐飞虱抗性评价标准
Figure BDA0002556083120000041
(二)W41126/C418 F2群体的分子标记分析
提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下所述：
①取0.2g左右的水稻幼嫩叶片，置于2mL Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。
②加入600μL的CTAB溶液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH8.0)，1.4MNaCl,0.2g/ml CTAB)，65℃水浴30min，每间隔5min左右震荡一次。
③加入600μL氯仿异戊醇(V:V＝24:1)，上下颠倒4-5次。
④将EP管放入离心机，12000rpm离心5min。
⑤吸取200μL上清液至1.5mL的EP管中，加入0.6倍的异丙醇，轻轻颠倒混匀，将样品放置-20℃冰箱30min。
⑥12000rpm离心5min，收集沉淀物，将上清液缓缓倒掉。
⑦向装有沉淀的EP管中加入300μL的70％乙醇，洗涤沉淀5min中，12000rpm离心5min，小心除去上清。
⑧将沉淀物放在超净工作台吹干后，加入200μL的TE溶液，作为母液放置在-20℃冰箱保存。
InDel标记分析的方法如下所述：
将上述提取的DNA稀释成约20ng/L，作为模板进行PCR扩增；
PCR反应体系(10L)：DNA(20ng/L)1L，上游引物(2pmol/L)1L，下游引物(2pmol/L)1L，10xBuffer(MgCl2 Plus)1L，dNTP(10mM)0.2L，rTaq(5U/L)0.1L，ddH2O 5.7L，共10L。
PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30S、55℃退火30s、72℃延伸40s，共循环35次；72℃延伸10min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。
PCR产物检测：扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，以DNA MakerⅠ为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。扩增的DNA条带利用灯箱进行观察，记录结果。
(三)结果与分析：
利用QTL IciMapping 4.1软件构建了w41126/c418 F2群体第6号染色体的遗传图谱，结合120个F2:3家系的表型，在水稻第6号染色体检测到一个抗褐飞虱QTL，命名为qBPH6。该QTL的LOD值为5.0，贡献率为36.9％。
为了精细定位该QTL，利用其两侧的两个引物RM1369和RM3414对BC1F2群体1500个单株和BC2F2群体4000个单株进行基因型分析，共筛选到115个交换单株。这115个交换单株用苗期集团鉴定法鉴定褐飞虱抗性，并且对交换单株的后代分离家系进行鉴定，验证交换单株的表型。此外，根据日本晴(Nipponbare)和93-11的序列开发了12个在W41126和C418之间有多态的InDel标记，将qBPH6定位在第三染色体长臂分子标记XH-1和NWD-3之间，位置如图1所示。
分子标记XH-1和NWD-3与qBPH6紧密连锁，两个标记的带型如图2、图3所示。为验证本发明中分子标记的选择效率，我们用XH-1、NWD-3、从130个W411126/C418的F2:3群体中筛选15个含有qBPH6的家系和15个不含该基因的家系进行褐飞虱抗性鉴定，结果含有qBPH6的家系的平均死苗率为10.23％，不包含该基因的家系平均死苗率为85.10％，两者之间具有极显著差异(P<0.01)，表明这些标记能够准确筛选出含抗褐飞虱基因qBPH6的水稻品种或家系。
分子标记XH-1引物：
前引物序列AGAGGCCGTGGATGATGA(如SEQ ID NO.1所示)
后引物序列AGAACGCTGCCAATTGTAAC(如SEQ ID NO.2所示)。
分子标记NWD-3引物：
前引物序列TCCATGTCTCCATCTCGTTG(如SEQ ID NO.3所示)
后引物序列CAAGAGAGGTGGTCACAGCA(如SEQ ID NO.4所示)。
用分子标记XH-1引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记NWD-3引物：SEQID NO.3/SEQ ID NO.4扩增水稻或育种材料DNA，如果用分子标记XH-1引物能够扩增出200bp的扩增片段，或用分子标记NWD-3引物同样能够扩增出200bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻或育种材料为抗褐飞虱品种或品系。
通过本发明鉴定的抗褐飞虱基因qBPH6及其连锁分子标记的开发，可用来指导抗褐飞虱水稻品种的选育工作，用与之连锁的分子标记对抗虫品种进行筛选，可使不同抗虫主基因位点快速聚合在同一个植株中，从而大大提高育种效率。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 水稻抗褐飞虱基因qBPH6 的分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaggccgtg gatgatga 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaacgctgc caattgtaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccatgtctc catctcgttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagagaggt ggtcacagca 20

Claims (2)

1.基因qBPH6分子标记XH-1或基因qBPH6分子标记NWD-3在鉴定抗褐飞虱水稻中的应用，其特征在于用分子标记XH-1引物：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或者用分子标记NWD-3引物：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增水稻DNA，如果用分子标记XH-1引物能够扩增出200bp的扩增片段，或用分子标记NWD-3引物同样能够扩增出200bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻为抗褐飞虱品种；所述水稻品种为W41126或C418。
2.基因qBPH6分子标记XH-1或基因qBPH6分子标记NWD-3在筛选抗褐飞虱水稻中的应用，其特征在于用分子标记XH-1引物：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,或者用分子标记NWD-3引物：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增水稻DNA，如果用分子标记XH-1引物能够扩增出200bp的扩增片段，或用分子标记 NWD-3引物同样能够扩增出200bp的扩增片段，则标志着待筛选水稻为抗褐飞虱品种或品系；所述水稻品种为W41126或C418。
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