CN114292951B - 与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的InDel分子标记及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的InDel分子标记及其引物和应用。该分子标记为4M141，其由如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列扩增得到。本发明所开发与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的分子标记是一对特异性共显性分子标记，其定位的抗褐飞虱主效基因位点位置明确，鉴定方便，可快速筛选抗虫品种或品系，有效提高水稻抗褐飞虱效率。

Description

与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的InDel分子标记及 其引物和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的InDel分子标记及其引物和应用。

背景技术

褐飞虱是我国水稻生产的主要虫害之一。由于它们具有爆发性和毁灭性特点，对水稻生产构成了极大威胁，每年都造成不同程度的损失。2006年-2015年10年平均，稻飞虱实际造成损失占总损失的29.51％，已严重威胁着水稻粮食生产。

目前生产上仍以化学防治为主，这不仅增加生产成本、污染环境、影响生态且农药残留也严重影响人们身体健康。实践表明，发掘利用抗褐飞虱基因，培育推广抗性品种是防治褐飞虱最有效、最经济和最安全的技术措施。

迄今为止，已从栽培稻和野生稻资源中鉴定报道抗褐飞虱主效基因超过40个，大部分抗褐飞虱主效基因已定在水稻不同的染色体上,其中利用图位克隆法,克隆验证了8个基因。

利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。国际水稻研究所(IRRI)的研究结果和东南亚的水稻生产实践证明，即使是只有中等抗性水平的水稻品种，也足以将褐飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不至于对水稻造成实际的危害和产量损失。因此，挖掘水稻抗褐飞虱基因以及相应的分子标记并在水稻育种项目中应用是防治水稻褐飞虱的根本措施。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的InDel分子标记及其引物和应用，旨在提高抗褐飞虱水稻选育的育种效率。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种与抗褐飞虱基因bph41(t)连锁的共显性分子标记4M141，其由如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列扩增得到。

引物具体序列为：

4M141-F：CATTTCCTCATGCAGGTCAGA(SEQ ID NO.1)

4M141-R：TAGTTGCCTCTGTGCATCCT(SEQ ID NO.2)

一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，采用上述引物序列对待检样本进行PCR检测，若利用引物序列扩增出255bp的扩增片段，且为纯合状态，则该样本中存在抗褐飞虱主效基因bph41(t)。

进一步地，利用该引物扩增水稻抗源HS204的后代材料或抗褐飞虱基因bph41(t)单基因系后代材料DNA，若能扩增出255bp的扩增片段，则表明该杂交后代材料含有抗褐飞虱主效基因位点bph41(t)。

进一步地，PCR的反应体系包括：10×PCR Buffer(含Mg²⁺)1.0μL，10mmol/L dNTP0.2μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，10μmol/L上、下游引物各0.2μL，DNA模板1.0μL，最后用ddH₂O补足至10.0μL。

进一步地，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行34个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

一种试剂盒，包括上述引物序列。

上述分子标记或引物序列，或试剂盒在筛选/鉴定抗褐飞虱水稻品种中的应用。

上述分子标记或引物序列，或试剂盒在作物分子育种、培育转基因水稻或水稻种质资源改良中的应用。

本发明的有益效果：

本发明开发的分子标记4M141能特异区分bph41(t)与其它水稻材料，是bph41(t)特异性共显性分子标记，并与抗褐飞虱表型标记准确率达96％。

本发明所开发与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的分子标记是一对特异性共显性分子标记，其定位的抗褐飞虱主效基因位点位置明确，鉴定方便，可快速筛选抗虫品种或品系，有效提高水稻抗褐飞虱效率。

附图说明

图1为本申请开发的分子标记的多态性验证。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1水稻抗褐飞虱基因bph41(t)共显性分子标记的开发及验证

1、水稻抗褐飞虱基因bph41(t)共显性分子标记的开发

(1)参考已公布日本晴和9311的基因组序列，把两者在bph41(t)定位区间的基因组序列在NCBI数据库中进行比对分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastS earch&LINK_LOC＝blasthome)，寻找两者序列上的插入\缺失片段，再利用Primer3在线软件开发了易于检测的共显性分子标记4M141(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？)。

(2)采用CTAB法(Murray MG&Thompson,1980Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA.Nucl Acids Res 8:4321-4325)提取不同水稻品种(创10B，又香B，广8B，软华B，泰丰B，野香B，粤香B，中浙2B，MR3，黄华占，华占，广恢169，桂恢553，SCR102，R273，桂3158)的基因组DNA。

采用上述设计开发的共显性分子标记4M141对这些水稻品种的DNA进行PCR扩增，PCR反应采用10.0μL体系，包括：10×PCR Buffer(含Mg²⁺)1.0μL，10mmol/L dNTP 0.2μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，10μmol/L上、下游引物各0.2μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O调至总体积10.0μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，进行34个循环；72℃延伸5min。再将PCR扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后银染显色，检测结果如图1所示。

图1中，Marker代表分子量标准，编号2至17的泳道分别对应水稻品种创10B(含bph41(t))、又香B、广8B、软华B、泰丰B、野香B、粤香B、中浙2B、MR3(含bph41(t))、黄华占、华占、广恢169、桂恢553、SCR102、R273、桂3158。

图1的结果表明，共显性分子标记4M141(正向引物序列：CATTTCCTCATGCAGGTCAGA；反向引物序列：TAGTTGCCTCTGTGCATC)能特异性区分含bph41(t)材料创10B、MR3与其它水稻品种，在含bph41(t)材料创10B、MR3中共显性分子标记扩增出255bp大小的PCR产物，与其它水稻品种中扩增的PCR产物条带大小明显不同，具有多态性。

2、水稻抗褐飞虱基因bph41(t)共显性分子标记的验证

为验证bph41(t)共显性分子标记4M141，本发明采用优异恢复系SCR102(感褐飞虱)为母本，以bph41(t)亲本材料MR3(抗褐飞虱，来源于广西普通野生稻渗入系HS204)为父本进行杂交，再自交收获F₂。随机选择50株F₂单株，用本发明开发的分子标记4M141分析这些F₂单株的基因型，对只含有抗虫亲本MR3的带型记为A，只含有感虫亲本SCR102的带型记为B，含有双亲带型的记为H。另单株收种，各株系抗性值为对应的F_2:3代的抗褐飞虱鉴定结果。

抗性值的确定：在确定了这50株F₂单株的基因型后，按单株收获种子，采用苗期集团法对各F_2:3株系进行抗褐飞虱表型鉴定。将待鉴定各株系每份取适量种子，催芽后条播于营养盘内，每行播20-25粒，当苗长至2-3叶时去除小苗、弱苗，保留健壮一致的苗，按每株5-8头接入2-3龄若虫，在感虫对照品种TN1死亡5d后对各单株进行受害统计(参照表1)，实验重复两次，利用各株系的加权平均计算该株系的抗性级别。

表1水稻抗褐飞虱鉴定分级标准

由于发现除2株的基因型与抗褐飞虱表型不吻合外，其余48株都完全一致，准确率96％。

将这50株F₂单株的基因型与抗褐飞虱表型进行对比，结果见表2。由于该抗褐飞虱基因bph41(t)为隐性基因，所以基因型与MR3纯合一致，即为A时对应的F₂单株对褐飞虱表现为抗，平均抗性值在3.1-4.8。基因型与SCR102纯合一致的或为杂合基因型的单株，即为B或H时对应的F₂单株对褐飞虱表现为感，本结果中除编号21、46外，平均抗性值在7.2-9。编号21、46的抗级分别为5.1、4.8，表现为中抗，与预期不符，因此标记的准确率为96％。本结果表明共显性分子标记4M141与抗褐飞虱基因bph41(t)紧密连锁，可应用于检测bph41(t)的存在，其准确率达96％。

表2亲本及F₂单株基因型与抗褐飞虱表型对比表

实施例2水稻抗褐飞虱基因bph41(t)共显性分子标记进行分子标记辅助选择育种应用

采用自育的优质恢复系SCR102(感褐飞虱)为母本，以bph41(t)亲本材料MR3(抗褐飞虱，来源于广西普通野生稻渗入系HS204)为父本进行杂交，种植F₁并作父本，对SCR102为母本进行回交，获得BC₁F₁，再利用本发明开发的分子标记4M141筛选出含MR3(bph41(t))片段的后代作父本，与SCR102作母本再回交，种植BC₂F₁并收获自交种，再利用分子标记4M141筛选出含MR3(bph41(t))纯合片段的单株100株种植，结合育种目标，选择农艺性状优良的4株收获。

对收获的4株BC₂F_2:3进行抗褐飞虱苗期集团法鉴定(方法同实施例1)，抗级表现分别为3.2、3.4、3.7、4.4，抗性评价为抗，其基因型与抗褐飞虱表型完全吻合，一致度为100％。说明在育种中，本发明开发的bph41(t)共显性分子标记与抗褐飞虱表型紧密连锁，可应用于bph41(t)的分子标记辅助选择育种，从而大大提高了育种效率。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所

<120> 与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的InDel分子标记及其引物和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catttcctca tgcaggtcag a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagttgcctc tgtgcatcct 20

Claims (7)

1.一种与水稻抗褐飞虱主效基因bph41(t)连锁的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记为4M141，由如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列扩增得到。

2.一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其特征在于，采用权利要求1中所述的引物序列对待检样本进行PCR检测，若利用引物序列扩增出255bp的扩增片段，且为纯合状态，则该样本中存在抗褐飞虱主效基因bph41(t)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系包括：10×PCRBuffer1.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，5 U/μL Taq DNA polymerase 0.1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.2 μL，DNA模板1.0 μL，最后用ddH₂O补足至10.0 μL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，进行34个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述引物序列。

6.权利要求1所述的分子标记或权利要求1中所述的引物序列，或权利要求5所述试剂盒在筛选/鉴定抗褐飞虱水稻品种中的应用。

7.权利要求1所述的分子标记或权利要求1中所述的引物序列，或权利要求5所述试剂盒在水稻分子育种、培育转基因水稻或水稻种质资源改良中的应用。

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