CN103484556B - 检测水稻香味等位基因的分子标记的引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够针对多种类型香味基因的香型水稻进行筛选的分子标记及扩增与稻米香味形成直接有关的多种类型甜菜碱乙醛脱氢酶2基因（Badh2/badh2）分子标记的引物及检测方法。检测方法为：（1）提取水稻总DNA作为模板，加入上述引物进行PCR扩增；（2）取PCR产物进行限制性核酸内切酶AluⅠ消化；（3）酶切产物凝胶电泳检测。本发明突破了以往对香味基因分子标记的检测都只能针对一种突变类型的香味等位基因进行鉴定的局面，可辅助选择含有不同类型香味基因的植株，无需在分子标记辅助进行香型水稻新品种育种前确定亲本香稻品种的香味等位基因突变类型，简化了分子标记辅助育种的前期操作步骤，从而快速有效地实现培育香型水稻新品种的育种目标。

Description

检测水稻香味等位基因的分子标记的引物和方法
技术领域
本发明涉遗传学和植物育种领域，具体为筛选香型水稻的分子标记和分子标记的引物以及检测方法，用于辅助常规育种快速、简便、准确选育香型水稻。
背景技术
香米由于在蒸煮过程中能散发出宜人的香味受到广大消费者的青睐。香米的价格普遍高于非香水稻品种。随着人们生活水平的提高，目前市场对香米的需求量日益增加。这些都极大地促进了人们对水稻香型特性的遗传研究，同时也加快了香稻新品种的选育进程。
尽管过去人们对于稻米香味遗传研究结果存在分歧，但多数学者认为稻米香味是由位于水稻第八染色体上的一个隐性主基因(fgr)控制的（闵绍揩等，水稻育种学，中国农业出版社，1996，322-353；Sood等，Indian J Genet Plant Breed,1978,38:268-271;Huang等，RiceGenet Newsl,1994,11:134-137；Lorieux等，Theor Appl Genet，1996，93:1145-1151；Jin等，Plant Sci，2003，165:359-364）。
过去在香稻传统育种过程中，育种者主要通过感官来区分香型水稻和非香型水稻。通过咀嚼来判断谷粒香味（Reinke等，Int Rice ResNewsl，1991，16:10-11）的方法不仅因连续品尝舌尖易受损害，而且会因为尝食过多导致味觉灵敏度下降而产生误判，致使含有香味基因的优良杂合个体在多代的选择过程中被淘汰，最终导致香味基因的丢失。通过1.7%KOH检测水稻叶片和种子的方法（董彦君等，种子，1992（3）24-27；Sood等，Indian J Genet Plant Breeding，1978，38：268-271）来区分香稻和非香稻的方法操作简单，由于KOH有助于选择性地释放香味，而排除了叶绿素气味的干扰，使测定的精确度得到提高，但是这种方法对人的嗅觉系统有很大的损害。近年来利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)直接测量香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-Acetyl-1-pyrroline，简称2-AP）含量以检测香米的方法也有被利用（Niu等，BMC Plant Biology，2008，8：100-130；Fitzgerald等，Plant Science，2008，175：539-546），但该方法费时且检测费用非常昂贵。
随着各种分子标记的发展，许多研究者利用与香味基因连锁的标记对香稻育种进行辅助选择。Ahn等（Ahn等，Theor ApplGenet,1992,84：825-828）研究发现RFLP标记RG28与香味基因连锁。Lorieux等（Lorieux等，Theor Appl Genet，1996，93：1145-1151）通过遗传作图的方法确认RG28和水稻香味密切相关，并且计算它们之间的遗传距离为5.8cM。Garland等（Garland等，Theor ApplGenet,2000，101：364-371）在前人工作的基础上建立了基于PCR技术的连锁性分子标记RG28，同时他们利用RG28进行香稻辅助育种。Cordeiro等（Cordeiro等，Mol Breed，2002，9(4)：245-250）发现微卫星标记SCU015RM与香味基因的遗传距离为4cM。李金华等（李金华等，分子植物育种，2006，4(1)：54-58）通过设计SSR标记，找到与香味基因连锁更加紧密的分子标记，遗传距离为3.3cM。随着发现的分子标记与香味基因的遗传距离的缩小，尽管在一定程度上提高了香型水稻育种的速度和准确性，但是这些标记都只是与香味基因的连锁标记，彼此之间还有一定的遗传距离，在对杂交后代的筛选中，也有可能会因目的香味基因与标记之间存在一定遗传距离而发生交换，导致对后代筛选中存在一定的误差。对于香味基因分子标记鉴定，最理想和有效的方法是直接检测香味基因，也就是将分子标记直接设计在香味基因内。
在2005年，Bradbury等首次提出位于水稻8号染色体上的甜菜碱醛脱氢酶2基因(Badh2)与水稻香味直接相关（Bradbury等，PlantBiotechnol J，2005，3(3)：363-370）。Chen等（Chen等，Plant Sci，2006，171:505-514）进行的互补试验直接证明了Badh2基因控制水稻的香味。甜菜碱醛脱氢酶2基因有15个外显子和14个内含子。Bradbury等首次发现能使稻米呈现香味的甜菜碱醛脱氢酶2第一个等位基因badh2-E7，与非香水稻比较，在其第七外显子上有8个碱基缺失和3个核苷酸多态性变化。在2008年，我国学者又报道了第二个香型等位基因badh2-E2（Shi等，Mol Breed,2008,22(2):l85-192）。与非香水稻比较，badh2-E2等位基因第七外显子核苷酸序列与非香水稻相同，但在第二外显子处缺失7个核苷酸。以后又有关于编码链不同外显子突变（Amarawathi等，Mol Breed,2008,21(1):49-65；Kovach等，PNAS,2009,106(34):14444-14449；Shao等，Plant Breeding,2011,130(2):172-176）以及外显子没有突变（徐小龙等，植物分类与资源学报,2011,33(6):667-673）的香味等位基因的报道。
在培育香型水稻新品种过程中香味基因的分子标记是非常有效的工具，为此开发简单、准确、便于操作使用的分子标记一直是研究者们努力的方向。香味基因的确定，为在香味基因内部设计分子标记辅助选育香稻新品种研究奠定了非常重要的基础。Bradbury等在2005年首次报道badh2-E7等位基因的同一年，就针对badh2-E7等位基因建立的分子标记设计了用于检测其分子标记的两对引物（Bradbury等，Molecular Breeding，16:279-283）。将这两对引物对基因组DNA进行扩增，PCR产物进行电泳检测，即可区别甜菜碱醛脱氢酶2基因第七外显子有突变的香味基因和非香基因的水稻。2008年，Amarawathi等针对badh2-E7类型等位基因设计了分子标记和一对引物，建立了能够稳定筛选，并且比Bradbury等建立的方法略微简便一些筛选badh2-E7类型等位基因的方法(Amarawathi等，MolecularBreeding,2008,21(1):49-65)。2008年，Shi等（Shi等，Molecular Breeding,2008,22(2):l85-192）和王丰等（王丰等，中国水稻科学，2008，22（4）:347-352）也报道了针对badh2-E7类型等位基因检测设计了一对引物，用于鉴定是否含有badh2-E7类型的香稻或非香稻。Sakthivel等通过调整一对引物在badh2-E7突变位点两侧的位置，又一次针对badh2-E7类型等位基因建立了较易区别香味基因和非香味基因的检测方法（Sakthivel等，Molecular Breeding，2009，24:185-190）。本实验室曾经综合考虑了badh2-E7类型等位基因内含子和外显子两部分序列，设计了两对引物用于区分是否含有badh2-E7类型等位基因的香稻或非香稻（李建粤等，专利授权号：ZL201010181087.9；徐小龙等，植物分类与资源学报,2011,33(6):667-673）。在Shi等2008年的报道中，还针对badh2-E2类型等位基因设计了分子标记及一对引物，用于鉴定是否含有badh2-E2类型香稻或非香稻（Shi等，Molecular Breeding，2008,22(2):l85-192）。王军等（王军等，分子植物育种，2008，6(6):1209-1212）以及本实验的徐小龙等（徐小龙等，植物分类与资源学报,2011,33(6):667-673）也都采用类似Shi等的方法，设计了鉴定第二外显子有突变的badh2-E2类型香味等位基因的引物，用于鉴定是否含有badh2-E2类型等位基因香稻或非香稻。Shao等对于新发现的第四和第五外显子之间具有803bp大片段缺失的badh2等位基因筛选，也建立了分子标记检测的引物（Shao等，Plant Breeding,2011,130(2):172-176）。Myint等（Myint等，Theor Appl Genet,2012,125(5):887-896）针对在第十三外显子处的一个3bp插入形成的badh2等位基因，也建立能够进行筛选的分子标记及引物。我们实验室曾根据在“上师香2号”水稻中发现的只有在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游序列有突变的新甜菜碱醛脱氢酶2基因设计了能够鉴定该新基因的分子标记及检测的引物。
目前国内外对由于甜菜碱醛脱氢酶2基因不同突变形成的香味基因，大多都已建立了能够鉴定是否分别含有某种特定等位基因的香稻和非香稻的分子标记及检测的引物。这些香味等位基因分子标记的建立及进行相应检测的引物设计，比原先使用连锁标记进行香稻分子标记辅助选育，已经有了非常大的进步，使分子标记辅助选育香型水稻新品种准确性得到了极大地提高。但是，目前报道对于香味基因设计的各种分子标记及引物，都只能针对一种香味等位基因突变类型进行鉴定。如果发明能够针对各种香味等位基因鉴定的分子标记及相应的检测引物和方法，将能够减少育种家们在采用分子标记技术进行香型水稻新品种选育前，对被选为香稻亲本的甜菜碱醛脱氢酶2基因究竟是属于什么样的突变类型进行分析这一繁琐的操作步骤。目前已发现由甜菜碱醛脱氢酶2基因突变形成的香味基因的等位基因类型就有13种，因此要探索被选为香稻亲本的甜菜碱醛脱氢酶2基因属于什么样的突变类型的工作量还是非常大的。因此，发明无需提前知道被选为香稻亲本的甜菜碱醛脱氢酶2基因属于什么样的突变类型就能够用于鉴定各种类型的香味基因的分子标记，对于采用分子标记进行香型水稻新品种选育将会是一项非常有实用价值的发明。
发明内容
本发明提供了一种筛选香型水稻的新的分子标记CAPS(Alu Ⅰ)以及检测该分子标记的引物及方法，能够快速并准确地鉴定由甜菜碱醛脱氢酶2基因不同位点突变形成的多种不同类型香味等位基因。
新的分子标记CAPS(Alu Ⅰ)位于各种香型水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸下游+896至+899位点。该位点的4个核苷酸序列“AGCT”能够被限制性核酸内切酶Alu Ⅰ识别并剪切，而非香水稻品种在+896至+899位点的核苷酸序列为“AGTT”，不能被限制性核酸内切酶Alu Ⅰ识别并剪切，由此可以快速和准确地区分出香稻和非香水稻品种中的香味基因和非香味基因。
新的分子标记CAPS(Alu Ⅰ)的引物包括如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的核苷酸序列。更优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：   GATGGGTTCAAGCGGAGA
SEQ ID No.2：   GCACTGGTCACTGTTTTAC
在距离甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸+896上游的第二内含子序列中，设计与甜菜碱醛脱氢酶2基因反义链同源配对的正义引物F，序列为：GATGGGTTCAAGCGGAGA；
在距离甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸+899bp下游的第二内含子序列中，设计与甜菜碱醛脱氢酶2基因正义链同源配对的反义引物R，序列为：GCACTGGTCACTGTTTTAC。
新的分子标记CAPS(Alu Ⅰ)检测方法包括如下步骤：
（1）提取水稻基因组DNA作为模板（可采用CTAB法和TPS法），加入上述2种引物进行PCR扩增。PCR扩增程序为：93～95℃预变性4～7min；93～95℃变性42～50s、51～54℃退火42～50s、70～73℃延伸25～35s，共30～35个循环；最后70～73℃延伸9～12min。优选的，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸10min；
（2）PCR产物用Alu Ⅰ进行酶切反应。反应体系为：10×快酶反应缓冲液（购自Fermentas公司)2ul，PCR产物14ul（≤0.2μg），Alu Ⅰ快酶(购自Fermentas公司)1ul（10个酶活单位），灭菌水13ul。反应条件为：37℃水浴4小时；
（3）取酶切产物用凝胶电泳检测，优选在0.8%～1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测；更优选用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
检测结果显示，各种类型的香稻均含有分子量分别约为320bp和160bp的两条带，而非香稻都含有分子量约为480bp的条带。
上述方法可用于筛选鉴定分别含有不同类型香味等位基因的香稻与非香水稻杂交后代，以及分别含有不同类型香味等位基因的香稻与非香水稻杂交后的自交后代，或者分别含有不同类型香味等位基因的香稻与非香水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代。所检测的水稻为温带非香粳型水稻、香型水稻、温带非香粳型水稻与香型水稻的杂交后代及其再自交或回交后代；其中的温带非香粳型水稻不包括甜菜碱醛脱氢酶2基因（Badh2）编码链第一个核苷酸下游+898处位点为胞嘧啶脱氧核苷酸（C）的温带非香粳型水稻。
香味基因是指不论突变发生在编码链还是非编码链的甜菜碱醛脱氢酶2基因各种隐性等位基因（badh2），与稻米香味形成直接有关。香型水稻指具有不同突变类型甜菜碱醛脱氢酶2基因的水稻。
非香味基因是指编码链第一个核苷酸下游+898处位点为不包括胞嘧啶脱氧核苷酸（C）的甜菜碱醛脱氢酶2基因的显性等位基因（Badh2），也与稻米香味形成直接有关。非香型水稻为温带非香粳型水稻中含有该非香味基因的品种。
如模板总DNA由纯合香型水稻提取，酶切后的产物均含有分子量分别约为320bp和160bp的两种条带。
如模板总DNA由非香型水稻提取，酶切后的产物均含有分子量约为480bp的条带。
如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交后代的杂合子水稻提取，酶切后的产物均含有分子量约为480bp、320bp和160bp的三种条带。
如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交F1植株再自交的后代水稻提取，不同植株酶切后的产物应该有三种类型的带型：对于纯合型香稻含有分子量约为320bp和160bp两种条带；对于杂合子含有分子量约为480bp、320bp和160bp三种条带；对于纯合型非香稻含有分子量约为480bp一种条带。
如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交F1植株再与非香型水稻回交的后代水稻提取，不同植株酶切后的产物应该有两种类型的带型：对于纯合非香稻含有分子量约为480bp一种条带；对于杂合子含有分子量约为480bp、320bp和160bp三种条带。
对于鉴定非香稻中是否含有如上所述的非香味基因，即编码链第一个核苷酸下游+898处位点为不包括胞嘧啶脱氧核苷酸（C）的甜菜碱醛脱氢酶2基因的显性等位基因（Badh2），的操作方法与本发明操作方法相同。如果在电泳后的凝胶中显示分子量约为480bp条带，表明在该非香稻中即含有与部分温带非香粳型水稻品种相同的非香味基因。
本发明除了与其他设计在香味基因内的分子标记具有同样的先进性特点外，还具有两大突出的优点：一是克服了目前已建立的所有分子标记及检测方法都只能针对一种突变类型的香味等位基因进行鉴定的局限。可辅助选择含有不同类型香味基因的植株，从而使育种家们在利用分子标记辅助将部分温带非香粳型水稻品种培育成香型水稻新品种时，不需要提前对用作香型亲本水稻究竟属于哪一种甜菜碱醛脱氢酶2基因突变类型进行大量的前期研究工作，简化了分子标记辅助育种的前期操作步骤，从而快速有效地实现培育香型水稻新品种的育种目标。
本发明的CAPS（Alu Ⅰ）分子标记检测操作简便，结果容易判断。目前大多研究者，如Amarawathi等(Amarawathi等，MolecularBreeding,2008,21(1):49-65)、Sakthivel等(Sakthivel等，MolecularBreeding，2009，24:185-190)、Shi等（Shi等，Molecular Breeding,2008,22(2):l85-192）、王丰等（王丰等，中国水稻科学，2008，22（4）:347-352）、王军等（王军等，分子植物育种，2008，6(6):1209-1212）以及本实验的徐小龙等（徐小龙等，植物分类与资源学报,2011,33(6):667-673），针对香味基因编码链设计的各种分子标记的检测方法，以及本实验室对于在香味基因启动子上的突变设计的分子标记及检测方法，都是针对香味基因与非香基因相差7个或8个核苷酸长度差异进行鉴定。由于PCR扩增出的非香基因Badh2与香味基因badh2两种PCR产物的条带大小差距只有7bp或者8bp，因此需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者是4%高浓度的琼脂糖凝胶进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测非香基因和香味基因，两个条带较易分辨，但是聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作比较繁琐。配制均匀一致的4%琼脂糖凝胶难度也较大，而且即便采用4%琼脂糖凝胶进行检测，非香基因和香味基因两条PCR条带有时也不易区分，容易导致判断误差。而使用本发明的CAPS（Alu Ⅰ）分子标记，对香味基因和非香基因进行检测，只需要使用1%左右琼脂糖凝胶就能很容易分辨香味基因和非香基因。
附图说明
图1为实施例1中3种不同突变类型的香稻和3种非香稻以及它们各自杂交的F1植株香味基因的鉴定图。其中M1为250bp类型的标准分子量DNA；第1泳道为非香稻“C418”植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量约为480bp条带；第2泳道为非香稻“C418”与香味基因启动子突变类型香稻“南海138”的杂交F1植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量分别约为480bp、320bp和160bp条带；第3泳道为香味基因启动子突变类型香稻“南海138”植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量分别约为320bp和160bp条带；第4泳道为非香稻“超2-10”植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量约为480bp条带；第5泳道为非香稻“超2-10”与香味基因第七外显子突变类型香稻“W香77075”的杂交F1植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量分别约为480bp、320bp和160bp条带；第6泳道为香味基因第七外显子突变类型香稻“W香77075”植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量分别约为320bp和160bp条带；第7泳道为非香稻“嘉花1号”植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量约为480bp条带；第8泳道为非香稻“嘉花1号”与香味基因第二外显子突变类型香稻“B1”杂交F1植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量分别约为480bp、320bp和160bp条带；第9泳道为香味基因第二外显子突变类型香稻“B1”植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量分别约为320bp和160bp条带；M2为100bp类型标准分子量DNA。
图2为实施例2中2种非香稻和22种香稻的香味基因鉴定图。M1为250bp类型标准分子量DNA;第1泳道为非香稻“日本晴”植株PCR扩增后的酶切产物，含有分子量约为480bp条带；第2泳道到第22泳道分别为香味基因不同突变类型的香稻品种：“苏沪香粳”、“大华香粳”、“通运粳”、“松香早粳”、“滆湖香糯”、“99983香稻”、“香粳05-7”、“武香粳14”、“49②香稻”、“银香18”、“武运2645”、“W香99075”、“紫香糯861”、“07-08香稻”、“香稻1号”、“中香1号”、美国香稻“Della”光身稻、“泰国香稻”、“C香517”、“大粒香”、日本香稻“南海138”、“B1”香稻植株PCR扩增后的酶切产物，均含有分子量分别约为320bp和160bp条带；第23泳道为非香稻“261S”植株扩增后的酶切产物，含有分子量约为480bp条带。M2为100bp类型标准分子量DNA。
具体实施方式
实施例中所使用的非香稻是温带非香粳型水稻，不包括甜菜碱醛脱氢酶2基因（Badh2）编码链第一个核苷酸下游+898处位点为胞嘧啶脱氧核苷酸（C）的温带非香粳型水稻。（此位点可以是T、A、G）
实施例1能够鉴定多种类型香味基因分子标记的建立及检测方法
以第二外显子突变类型香稻“银香18”和第七外显子突变类型香稻“W香99075”作为编码链突变类型的香稻品种的代表，以“南海138”水稻作为编码链上游突变类型的香稻品种的代表，提取了3种水稻基因组DNA，设计了8对引物，克隆了这3种香型水稻与稻米香味直接相关的甜菜碱醛脱氢酶2基因（badh2）7666bp序列，并进行了测序分析，同时查看了已公布在Genbank中非香型水稻“日本晴”的甜菜碱醛脱氢酶2基因序列（AP004463.2）。
比较4种水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因序列，3种香型水稻的香味基因都各自具有代表其特征性的突变区段。但是与非香水稻“日本晴”比较，在3种香型水稻的不同香味基因上，还存在15处共同的突变位点，其中在第二内含子中相当于编码链起始密码子第一个核苷酸下游的+898bp处，3种香稻均为胞嘧啶脱氧核苷酸（C），对于非香水稻“日本晴”则是胸腺嘧啶脱氧核苷酸（T）。3种香稻+898处的“C”分别与其上游+896和+897以及下游+899组合就构成了“AGCT”序列，能够作为限制性核酸内切酶Alu Ⅰ酶识别和剪切的序列。而非香水稻“日本晴”从+896至+899的相应序列为“AGTT”，不能作为限制性核酸内切酶Alu Ⅰ酶识别的位点。由此建立一个能够同时鉴定多种类型香味基因的分子标记：CAPS(Alu Ⅰ)。
在甜菜碱醛脱氢酶2基因+896至+899序列的两端分别设计一对上、下游引物，序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的5’–GATGGGTTCAAGCGGAGA-3’和5’–GCACTGGTCACTGTTTTAC-3’。以香味基因突变位点分别位于编码链上游、第七外显子和第二外显子的三种香稻：“南海138”水稻、“W香99075”水稻和“B1”香稻，三种非香水稻：“C418”、“超2-10”和“嘉花1号”，以及三种不同香味基因突变位点的香稻依次分别与三种非香稻杂交的F1植株为材料，提取基因组DNA，使用如上设计的引物对基因组DNA进行扩增。使用Alu Ⅰ酶对所有水稻样品的PCR产物进行酶切处理。酶切后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果显示，三种香稻品种都含有分子量分别约为320bp和160bp的条带，三种非香水稻都含有分子量约480bp的条带，三种杂交的F1植株都含有分子量分别约为480bp、320bp和160bp的条带（如图1）。
再将非香稻“C418”与香稻“南海138”的杂交F1植株、非香稻“超2-10”与香稻“W香99075”的杂交F1植株以及非香稻“嘉花1号”与香稻“B1”杂交F1植株自交，得的三种自交F2植株中提取总DNA，用同样的方法进行PCR扩增、酶切和电泳检测。从检测结果显示三种组合的自交后代都有三种不同基因型的植株，其中DNA分子量只有约320bp和160bp两条带对应于自交后代香味基因纯合植株PCR产物，具有约480bp、320bp和160bp三条带对应于自交后代香味基因杂合植株PCR产物，只有480bp一条带对应于自交后代非香纯合植株PCR产物。我们还使用了1.7%KOH溶液对F2植株的叶片进行香味检测。取1克新鲜的水稻叶片，剪成碎片放入试管，加入1.7%KOH溶液5ml，立即塞住试管口，在室温下保持10min，然后逐一打开试管塞迅速用鼻嗅来鉴别香味有无。为确保鉴定的准确性，由三人同时闻味。由于香味属于隐性性状，对于出现480bp条带的纯合非香植株和同时出现480bp、320bp和160bp三条带的杂合植株都没有香味，只有出现320bp和160bp两条带的植株才有香味。
将非香稻“C418”与香稻“南海138”的杂交F1植株、非香稻“超2-10”与香稻“W香99075”的杂交F1植株以及非香稻“嘉花1号”再与各自的非香稻亲本回交，从所得的回交一代植株BC1F1中提取总DNA，用同样的方法进行PCR扩增、酶切和电泳检测。检测结果显示，三种回交组合的后代中都出现了两种基因型后代。无香味基因的纯合植株只有480bp条带，香味基因杂合类型植株具有480bp、320bp和160bp三条带。同样采用1.7%KOH溶液对回交一代植株BC1F1叶片进行检测，所有植株都没有香味。
使用CAPS(Alu Ⅰ)分子标记和KOH溶液两种方法的检测结果，与遗传分离规律中的一对基因自交及回交预期结果完全一致。由此表明，使用本发明建立的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记及检测方法，不仅能够有效区别香型水稻和非香水稻所具有的甜菜碱醛脱氢酶2基因，而且采用相同的操作方法就能够对多种不同类型的香味基因同时进行鉴定。
实施例222种香型水稻CAPS(Alu Ⅰ)分子标记的鉴定
为了说明本发明设计的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记能够适用于更多香型水稻的香味基因鉴定，我们又收集了19种分别来自于中国、美国、泰国，香味基因突变位点分别为第二外显子和第七外显子的香稻：“苏沪香粳”、“大华香粳”、“通运粳”、“松香早粳”、“滆湖香糯”、“99983香稻”、“香粳05-7”、“武香粳14”、“49②香稻”、“银香18”、“武运2645”、“紫香糯861”、“07-08香稻”、“香稻1号”、“中香1号”、美国香稻“Della”光身稻、“泰国香稻”、“C香517”、“大粒香”，以及实施例1中使用过的3种香稻：“W香99075”、日本香稻“南海138”和“B1”香稻共22种香稻，同时又选择了两种非香稻：“日本晴”和光温敏两系不育系水稻“261S”，按照实施例1的方法进行检测。检测结果显示，所有香稻品种香味基因PCR扩增后的酶切产物，都含有分子量分别约为320bp和160bp的条带，非香稻植株的非香味基因扩增后的酶切产物，都含有分子量约为480bp的条带（图2）。
检测结果表明，本发明设计的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记及检测方法，能够适用于更多香型水稻香味基因的鉴定。
实施例3非香水稻CAPS(Alu Ⅰ)分子标记的鉴定
由于大多香型水稻的产量都较低，因此在利用分子标记辅助选育新的香型水稻中，一般都选择产量较高的非香水稻与香型水稻进行杂交，然后再将杂交F1植株与高产的非香水稻回交几代，在每次回交前，需要使用鉴定香味基因的分子标记对回交后代进行检测，选取含有香味基因的杂合植株继续与非香水稻回交。因此，对于作为鉴定香味基因的分子标记位点，应该能够区别出作为亲本的香型水稻和非香型水稻分别具有的香味基因和非香味基因。
对于非香水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸下游+898位点是否是胞嘧啶脱氧核苷酸（C）的鉴定，可确定在使用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)进行新的香型水稻新品种培育的辅助筛选时，有哪些非香水稻品种适合被选作非香亲本。
在实施例1和实施例2中，我们选用的5种非香水稻，使用本发明的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记及检测方法，对它们的基因组DNA进行鉴定，结果它们都显示一条480bp的条带，表明这5种非香水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因的PCR产物都不能被Alu Ⅰ剪切，说明它们在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸下游+898位点不是胞嘧啶脱氧核苷酸（C），从而也表明利用本发明设计的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记，能够用于鉴定这5种非香水稻与香型水稻杂交培育新的香型水稻新品种，也就是说这5种非香水稻品种适合被作为非香亲本进行新的香型水稻新品种的选育。
为了探索是否有更多的非香水稻在培育新的香型水稻新品种时，也适合使用本发明的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记进行检测。我们又另外选取了目前大多在上海市等周边地区主栽的11种重要的非香水稻：“连粳6”、“光明粳1号”、“杨粳4227”、“中花11”、“宝农34”、“金丰”、“湘晴”、“R44”、“上实2号”、“上师大5号”、“秀水134”，使用CAPS(Alu Ⅰ)分子标记对这11种非香水稻进行鉴定。结果也与在实施例1和实施例2中的5种非香水稻一样，也都含有480bp条带。我们还查看了Kovach等（Kovach等，PNAS,2009,106(34):14444-14449）报道中的8个不同于在本发明实施例中使用过的温带非香粳稻品种（Baber、Chinese031、Early Wataribune、Luk Takhar、Shinriki、TainanIku487、Taipei309、Randhanipagal）的甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸下游+898位点的脱氧核苷酸，情况与本发明实施例中检测过的16种非香水稻相同。也就是说，本发明的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记对使用这些非香稻作为非香型亲本进行新的香型水稻新品种选育也是适合的。但是，我们曾将非香型籼稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因进行分析，结果显示，籼稻甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸下游+898位点与香稻相同，PCR产物经过Alu Ⅰ酶处理也会出现与香稻相同的条带，即含有分子量分别约为320bp和160bp的条带。因此本发明的CAPS(Alu Ⅰ)分子标记不适合选择非香型籼稻作为非香亲本进行分子标记辅助培育新的香型水稻新品种。
我们建议育种家在使用本发明CAPS(Alu Ⅰ)分子标记辅助选育新的香型水稻育种前，最好能够提前使用本发明简便的操作方法对用作亲本的非香水稻进行鉴定，如鉴定结果只显示一条480bp条带的，即表明是本发明适合被选为非香亲本使用范围的水稻品种。
实施例4利用分子标记辅助选育香型软米恢复系水稻
“秋优金丰”是近年上海市闵行区农科所培育出的优质杂交水稻品种。该品种稳定性好、抗逆性强，而且产量高、米质优，已成为目前本市水稻生产的主推品种之一。“秋优金丰”父本为“R44”恢复系。
近年来在世界上正兴起一种新型稻米----软米育种研究。软米米质介于糯性与粘性之间，其最大的特点是稻米直链淀粉含量较低。据报道直链淀粉含量为8%-12%的软米，米饭食味好，甜润爽口，冷饭热饭均蓬松，质软。最近几年上海市培育出的“清香软粳”常规水稻是香型软米类型的品种，米质优。
杂交水稻一般能够比常规水稻增产15%。本实验室曾将“清香软粳”常规水稻与“R44”恢复系杂交，发现由此得到的杂交稻的确产量比原先的“清香软粳”水稻明显提高。如果要以“R44”作为恢复系培育香型软米杂交稻，需要培育“清香软粳”三系不育系水稻，以及含有“R44”遗传组成的香型软米恢复系。因此能够利用分子标记辅助育种技术培育含有“R44”遗传组成的香型软米三系恢复系，将能够为今后培育高产的香型软米杂交水稻新品种奠定重要基础。本实施例将叙述利用本发明的香味基因鉴定的分子标记及检测方法辅助培育香型软米恢复系的过程。
目前还没有文献报道“清香软粳”香型软米水稻的香味基因属于甜菜碱醛脱氢酶2基因什么位点突变类型，因此无法直接使用现已报道的只针对一种突变类型的香味基因分子标记筛选的检测方法。采用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)及检测方法可以免去提前对作为香稻亲本的香味基因类型进行研究的大量操作步骤。
在实施例3中，我们已知“R44”恢复系非香水稻适合使用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)及检测方法辅助选育新的香稻品种。如果前期不知道作为非香稻的亲本是否属于本发明的分子标记适合选择的非香稻类型，只需要采用本发明的分子标记简便的检测方法进行一次操作即可确定。
在确定“R44”恢复系可以作为杂交的非香亲本后，将“R44”恢复系作为母本，将“清香软粳”水稻作为父本进行杂交，再以“R44”恢复系作为母本，以杂交F1植株作为父本进行回交得到BC1F1种子。在继续将“R44”恢复系作为母本，BC1F1植株作为父本进行第二次回交前，使用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)和已报道的软米基因分子标记检测的方法（谢米雪等，上海师范大学学报，2013，42（2）：384-391）先后对BC1F1植株进行鉴定。对于回交BC1F1群体的检测出现两种基因型后代，含有香味基因杂合植株显示分别含有分子量约为480bp、320bp和160bp的条带，只有纯合非香基因的植株显示含有分子量约为480bp的条带。将含有480bp、320bp和160bp三个条带的杂合植株继续检测软米基因，将同时含有香味基因和软米基因的植株作为父本继续与“R44”恢复系回交，获得BC2F1种子。继续种植BC2F1种子和“R44”恢复系种子。再使用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)对BC2F1群体进行检测，再将含有分子量约为480bp、320bp和160bp条带杂合香味基因植株进行软米基因检测，将含有杂合香味基因和软米基因的植株为父本继续与“R44”恢复系回交，获得BC3F1种子。同样的操作再继续回交3代，获得BC6F1种子，同样在每次回交前，都需要采用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)和软米基因分子标记检测回交前的植株。继续种植BC6F1种子，在苗期继续使用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)对BC6F1植株继续检测，将显示分子量约为480bp、320bp和160bp条带的香味基因杂合植株继续检测软米基因，从含有三个条带的香味基因杂合植株中选出也含有软米基因的植株上收获自交种子BC6F2。大量种植自交的BC6F2种子，在植株接近成熟期，在田间观察，选择各种农艺性状都更接近“R44”恢复系水稻的植株，取叶片同样采用本发明的香味基因分子标记CAPS(Alu Ⅰ)检测BC6F2植株。香味基因的检测结果有三种基因型。含有纯合非香基因的植株检测结果只有480bp条带，含有杂合香味基因植株同时具有480bp、320bp和160bp三条带，含有纯合香味基因植株只有320bp和160bp两条带。取含有纯合香味基因的植株继续检测软米基因，从含有纯合香味基因同时又检测到具有纯合软米基因的植株上收获种子BC6F3。再继续种植两代BC6F3种子，获得BC6F5种子。在自交期间，通过田间观察，也从各种性状都与“R44”恢复系尽量较近的植株上收获种子，由此培育出具有较多“R44”恢复系遗传组成的香型软米恢复系水稻新品系。

Claims (6)

1.一种检测水稻香味等位基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以水稻总DNA为模板，用引物进行PCR扩增；
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
(2)将步骤(1)的产物用Alu Ⅰ酶切；
(3)将步骤(2)的酶切产物用凝胶电泳检测；
模板总DNA由为含有甜菜碱醛脱氢酶2基因的纯合香型水稻提取时，酶切产物含有分子量约为320bp和160bp的两种条带。
模板总DNA由非香型水稻提取时，酶切产物为分子量约480bp的条带；
模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后代的杂合子水稻提取时，酶切产物含有约分子量为480bp、320bp和160bp三种条带；
如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交F1植株再自交的后代水稻提取，纯合型香稻含有分子量约为320bp和160bp两种条带；杂合子含有分子量约为480bp、320bp和160bp三种条带；纯合型非香稻含有分子量约为480bp的一种条带；
如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交F1植株再与非香型水稻回交的后代水稻提取，纯合非香稻含有分子量约为480bp一种条带；对于杂合子含有分子量约为480bp、320bp和160bp三种条带。
2.权利要求1所述检测水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增程序为：93～95℃预变性4～7min；93～95℃变性42～50s、51～54℃退火42～50s、70～73℃延伸25～35s，共30～35个循环；最后70～73℃延伸9～12min。
3.权利要求1或2所述检测水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸10min。
4.权利要求1所述检测水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切的反应条件为36～37℃下反应3～6小时。
5.权利要求1所述检测水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的凝胶为0.8％～1.5％琼脂糖凝胶。
6.权利要求1所述检测水稻香味等位基因的方法，其特征在于，所述的水稻为温带非香粳型水稻、香型水稻、温带非香粳型水稻与香型水稻的杂交后代及其再自交或回交后代；其中的温带非香粳型水稻不包括甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链第一个核苷酸下游+898处位点为胞嘧啶脱氧核苷酸的温带非香粳型水稻。
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