CN112195268B

CN112195268B - 与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记、引物、应用及品种选育方法

Info

Publication number: CN112195268B
Application number: CN202011231906.6A
Authority: CN
Inventors: 潘磊; 王志强; 牛良; 鲁振华; 曾文芳; 崔国朝; 闫乐乐
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2040-11-06
Also published as: CN112195268A

Abstract

本发明涉及与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记、引物、应用及品种选育方法。本发明在对一类栽培种来源的新抗蚜类型QMR类抗蚜材料的研究过程中发现了与一种与抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，5’端起第72‑91位插入或缺失。该分子标记与桃抗蚜性状紧密连锁，当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72‑91位为插入纯合基因型时，待测样本为感蚜性状；当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72‑91位为缺失纯合基因型或插入/缺失杂合基因型时，待测样本为抗蚜性状。对该分子标记的基因型进行检测能够早期、有效的预测待测植株是否具有抗蚜性状，本发明还提供了检测上述分子标记的引物及桃抗蚜品种选育方法。

Description

与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记、引物、应用及品种选育方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记、引物、应用及品种选育方法。

背景技术

桃树是重要的经济林树种，我国桃的栽培面积和产量均居世界首位。桃绿蚜(Myzus persicae，简称桃蚜)是桃树春季危害最严重的害虫，严重影响了桃产业的绿色健康发展。桃蚜是世界范围内分布最广的刺吸式害虫，能够取食超过200种植物，桃树是桃蚜的初始寄主，从桃树萌芽开始，直接危害桃树新梢，导致树体营养物质流失、叶片卷曲、新梢停长、光合能力下降；桃蚜刺吸幼果会导致果实畸形，商品品质下降(Blackman et al.,2000)；此外，桃蚜还是桃树多种植物病毒的传播媒介(Pascal et al.,2002；Decroocq etal.,2005)。在我国主要桃产区，为控制蚜虫危害，每年需要多次化学农药防治，不但提高了桃园管理成本，还会导致环境污染和农残超标等问题，生产上迫切需要绿色环保的桃绿蚜防控措施。

利用寄主植物自身抗性控制农业害虫的危害，是一种可持续且环境友好型的害虫管理方法，这离不开抗性种质资源的筛选和抗性调控机制的解析。但是，前人鉴定的抗蚜种质资源均为野生近缘种或半野生种，抗性利用困难，目前尚无抗蚜桃品种推广。桃树抗蚜种质资源的鉴定筛选是抗性利用的先决条件，已报道的抗蚜资源如下：上世纪80年代以来，法国农科院(INRA)先后报道砧木桃Rubira、垂枝桃WFP、山桃P1908等抗蚜资源，并以此开展了广泛的抗性表型分析、遗传规律分析与定位、抗性相关次生代谢物分析等方面的研究(Massoni é et al.,1982；Monet et al.,1994；Sauge et al.,1998)。王力荣等(2001)从国家桃种质资源圃(郑州)保存的众多资源中鉴定出了寿星桃类和山桃类等抗蚜材料。但筛选到的这些抗性种质都是桃野生近缘种或半野生材料，如山桃和P1908同为野生近缘种，Rubira是一个桃砧木品种，垂枝桃WFP和寿星桃都是观赏桃品种，果实商品性状非常差；作为木本植物，桃树生长周期长，育种改良过程中，抗蚜性状的导入与纯化过程漫长，导致抗性的利用十分困难。以寿星桃和山桃为例，一代保留一半的遗传物质，通过7代(0.5⁷＝0.0078＝0.78％)才能将野生种的遗传物质降低至1％以内。即是说，寿星桃和山桃需要7代(35-42年)品种培育，才能获得与栽培品种经济性状基本相同的抗蚜优系。目前，世界范围内还没有商业化推广的桃树抗蚜品种。

发明内容

本发明的目的在于提供与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记，该分子标记是在栽培种来源的主效QTL控制的桃绿蚜抗性(major effect QTL controllingMyzus persicae resistance，QMR)品种中发现的，能够为桃树抗蚜新品种培育提供可靠的辅助选择标记。

本发明的第二个目的在于，提供上述与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记在桃抗蚜品种选育中的应用。

本发明的第三个目的在于，提供用于检测上述与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记的引物。

本发明的第四个目的在于，提供一种桃抗蚜品种选育方法，通过将栽培种来源的QMR抗性品种作为亲本之一进行杂交育种，并对上述分子标记的基因型进行检测，筛选出抗蚜优系。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了与桃树桃绿蚜抗性相关的分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，5’端起第72-91位插入或缺失。

本发明提供了上述与桃树桃绿蚜抗性相关的分子标记及引物在桃抗蚜品种选育中的应用。

具体的，对权利要求1所述的分子标记的基因型进行检测，当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入纯合基因型时，待测样本为感蚜性状；当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为缺失纯合基因型时，待测样本为抗蚜性状；当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入或缺失杂合基因型时，待测样本为抗蚜性状。

优选的，通过PCR扩增检测SEQ ID NO.1所示序列5’端起第72-91位插入或缺失，所述PCR扩增采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了上述用于检测上述分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种桃抗蚜品种选育方法，包括如下步骤：

1)将栽培种来源的QMR抗性品种作为亲本或亲本之一进行杂交育种；

2)提取获得的杂交后代基因组DNA作为待测样本；

3)以基因组DNA为模板，对覆盖上述分子标记的区域设计引物并进行PCR扩增；

4)根据PCR扩增产物的基因型判定待测样本抗蚜性状并筛选出抗蚜单株：当SEQID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入纯合基因型时，待测样本为感蚜性状；当SEQID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为缺失纯合基因型时，待测样本为抗蚜性状；当SEQID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入或缺失杂合基因型时，待测样本为抗蚜性状。

优选的，所述步骤2)中PCR扩增采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ IDNO.3所示。

优选的，所述步骤2)中PCR扩增的反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL，dNTPMixture 1μL，Mg²⁺4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，50ng/μl基因组DNA 2μL，DNAPolymerase 0.5μL，灭菌水35.5μL，总体积50μL；下游引物和上游引物在反应体系中的终浓度均为0.2μM。

优选的，所述步骤2)中PCR扩增的反应程序如下：：预变性95℃，3min；进入PCR扩增循环，每个循环依次经过98℃，30s变性，57℃，30s复性，72℃，30s延伸，共循环38次，最后72℃，7min，完成PCR的扩增。

优选的，所述步骤4)中通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物条带大小，以判断SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位是否缺失。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记，该分子标记是在栽培种来源的主效QTL控制的桃绿蚜抗性(major effect QTL controlling Myzuspersicae resistance，QMR)品种中发现的，能够为桃树抗蚜新品种培育提供更为实用可靠的辅助选择标记。

发明提供了上述与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记在桃抗蚜品种选育中的应用，对上述的分子标记的基因型进行检测，能够准确的筛选出抗蚜单株。本发明还提供了用于检测上述分子标记的引物，使用该引物对SEQ ID NO.1所示的序列进行PCR扩增，而后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物条带大小或对扩增产物进行测序，即可检测该分子标记的基因型。

本申请进一步提供了桃抗蚜品种选育方法，该方法通过将栽培种来源的QMR抗性品种作为亲本或亲本之一进行杂交育种，并对上述与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记的基因型检测，筛选出抗蚜优系。该方法该可操作性强，易推广普及，能够早期、快速、低成本、有效的预测桃树的抗蚜性状，可以用于抗蚜品种的辅助选择，在桃树抗蚜新品种培育方面具有广阔的应用前景。

此前，国内外已经发现的桃抗蚜种质有毛桃类(Rm1、Rm2和Rm3)和山桃类两种，本发明涉及的QMR抗性材料是申请人团队长期育种工作中发现的第3类具有蚜虫抗性的新种质，与前两类抗性表型不同：首先，QMR抗性材料的亲本中没有野生种或桃近缘种材料，本身经济性状接近栽培品种，与野生抗蚜种质山桃和寿星桃比，更加容易被育种利用，育种应用价值也更突出。第二，QMR类材料呈现趋避性抗性，但与前人报道的趋避性抗性Rm1、Rm2和Rm3相比，QMR类材料在蚜虫取食后，刺吸部位没有过敏性反应(图1)。最后，对QMR抗性的遗传和定位分析表明(图2、3和4)，其遗传规律和调控基因位点与寿星桃和山桃也不相同。QMR种质的抗性来源、抗性表现和遗传定位均表明其为新的抗性类型(图1)。QMR抗性最大的优势在于：便于育种过程中抗性利用，因为桃品种培育1代的周期为5-6年(亲本杂交，杂种苗培育1年；杂种苗定植营养生长2年；杂种苗结果后优系鉴定2-3年)。以野生近缘种寿星桃和山桃为例，一代保留一半的遗传物质，通过7代(0.5⁷＝0.0078＝0.78％)才能将野生种的遗传物质降低至1％以内。即是说，寿星桃和山桃需要7代(35-42年)品种培育，才能获得与栽培品种经济性状基本相同的抗蚜优系。而QMR抗性来源于栽培品种，通过1-2代(10-12年)年即可获得与栽培品种经济性状同水平的抗蚜优系，大大缩短了抗蚜品种的育种周期。

附图说明

图1为感蚜材料、趋避性抗蚜材料、抗生性抗蚜材料和QMR抗蚜材料经蚜虫危害后的典型表现图示(A)及抗性特征对比情况(B)；

图2为QMR材料的趋避性蚜虫抗性表型、分离群体中的抗性分级和遗传规律分析；

图中，A.QMR材料的趋避性抗蚜表型；B.寿星桃的典型抗蚜表型-过敏性斑点；C.QMR材料的抗蚜表型；D.感蚜材料的表型；E.抗蚜分离群体的后代抗性等级分布；F.抗蚜分离群体的遗传规律分析；“09南3-30”和“09南4-6”为抗蚜杂合材料，其余代号或品种为感蚜材料。

图3为QMR抗蚜性状的BSA定位分析结果；

图中，桃第3号染色体上方的红色粗线条指示BSA分析关联出的候选调控区域。

图4为桃第3号染色体末端QMR抗蚜调控位点的精细定位分析；

图5为基于转录组合重测序数据的候选调控基因筛选；

图中，A.精细定位区间内基因的表达分析；B.PpQMR3.1在抗感品种间的表达差异及表达不平衡情况；C.RT-qPCR检测PpQMR3.1在不同品种间的表达差异情况；QMR抗蚜材料“09N-3-30”，“Rm3”抗蚜材料“中蟠1号”和R37，感蚜材料“中油桃13号”和S38，接种蚜虫前后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h和72h的幼嫩叶片被用作转录组分析，分别用QMR、Rm3-1、Rm3-2、S-1和S-2表示。

图6为QMR3.1基因上游启动子区20bp抗蚜连锁分子标记在基因组上的位置示意图；

图7为QMR3.1基因上游启动子区抗蚜连锁分子标记的引物设计；

图8为QMR3.1基因在抗感品种启动子区序列多态性(A)和20bp分子标记在小部分自然群体和野生种中基因分型情况(B)。

图9为‘中桃红玉’X‘09南3-30’分离后代的蚜虫抗性基因型鉴定。

图中，A.感蚜品种和抗蚜杂合品种的基因型对应分子标记展示；B.该分子标记在276个分离单株中进行基因型检测的结果展示。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

栽培种来源的抗性来自于美国引进的商业品种农神蟠桃，但是该种抗性在世界范围内并无报道。“中油桃13号”和“中桃红玉”是中国农业科学院郑州果树研究所释放的商业品种，“09南3-30”、“09南4-6”、“中蟠1号”、R37、S38是中国农业科学院郑州果树研究所保存的育种优系。

实施例1桃QMR类抗蚜性状的抗性表型和遗传规律分析

桃中已经定位的抗蚜基因Rm1、Rm2和Rm3，对应的抗性都表现为趋避性抗性(图2A)和危害部位的过敏性反应(图2B)。QMR类抗蚜材料在外接蚜虫条件下也表现出强烈趋避性，接蚜虫后的第2天，虫口密度下降至一半左后，6天时间内几乎全部离开(图2A)，且没有过敏性反应出现(图2C)。

图2D展示了感蚜材料的典型表型，即蚜虫着生及蚜虫取食导致的叶片卷曲现象。为了分析QMR性状的遗传规律，我们对4个F1分离群体进行抗性鉴定，发现群体后代抗性均呈现显著的双峰模式，即1级的抗蚜单株和5级的感蚜单株数量基本一致，并占到分离群体的大部分单株，中间类型数量很少(图2)。如果将1至4级的单株归为具有蚜虫抗性的组别，将5级单株归为感蚜组别单株，则分离群体的抗蚜和感蚜性状分离分大致为1:1(χ2＝0至8.64)，这与显性单基因或主效基因调控性状的分离比例一致。

实施例2 QMR抗蚜性状调控位点的BSA混池定位分析

根据抗性表型的鉴定结果，选取极端抗蚜单株和极端感蚜单株各40株，构建抗、感基因池，进行BSA定位分析(图3)。为了鉴定QMR抗性调控位点，对两个亲本及抗感混合池进行高通量特异性片段测序，抗性亲本‘09N3-30’平均读深为39倍，感蚜亲本‘中桃红玉’的测序深度为38倍，抗性池和感性池的的测序深度分别为75倍和61倍。在88万个多态性标记中，筛选出26.38万个单核苷酸多态性(SNP)和5.59万个插入缺失(Indel)多态性标记，采用△SNP-index和Euclidean Distance两种定位分析方法，都将该性状的调控位点关联到了第3号染色体靠近底部pp03:21,523,514和pp03:26,958,658之间，表明桃绿蚜抗性基因位于第3号染色体上的一个5.44Mb候选区域(图3)。

实施例3 QMR调控位点的精细定位分析

基于BSA定位结果，申请人采用遗传学精细定位策略继续缩小QMR基因在染色体上的位置区间(图4)。

采用‘09N-3-30’×‘中桃红玉’F₁分离群体中的单株，经过了两年的观察，表型一致的单株进行定位分析。根据BSA定位的结果，围绕包含QMR基因的定位区间，我们设计了两个Indel标记,Indel-21.52和Indel-29.95，分别对应于定位区间的两端Pp03:21,523,514和Pp03:26,958,658的位置。采用以上两个标记对288个F₁单株进行基因型分析以寻找染色体重组，共发现41个交换单株。对Indel-21.52和Indel-29.95两个标记内部区域，设计另外12个分子标记(Indel-21.61至Indel-26.35)，对这些交换单株进行基因型分析。基于14个分子标记对41个交换单株的基因型分析，共鉴定到了23种单倍型，结合交换单株对蚜虫的抗性表型，QMR基因被界定在桃基因组分子标记Indel-24.10(Pp03:24,105,281)和CE-24.24(Pp03:24,250,071)间145Kb的染色体区域中(图4)。精细定位区间内标记检测准确率最高为93％，精细定位区间中间和两端的标记对18个单株鉴定的基因型和抗蚜表型不一致，说明该位点为主效基因位点，因此将第3号染色体末端定位到的抗性位点命名为PpQMR3.1。

实施例4基于整合组学策略的QMR候选调控基因筛选

根据桃参考基因组的基因注释，可知QMR精细定位区间内含有22个基因(Prupe.3G251100至Prupe.3G25320)。我们采用抗、感品种间多态性位点比较分析和转录组比较分析结合的方法来识别QMR精细定位区间内可能的抗蚜调控候选基因。根据该基因显性遗传特点，我们推测候选基因应该在QMR材料中表达，并与非QMR材料间存在表达模式的变化或者存在可能导致基因功能改变的基因突变。

通过对转录组数据分析发现，精细定位区间内的22个基因中，5个基因在所有的转录组测序材料中完全不表达，9个基因在QMR抗蚜材料和至少1个非QMR材料蚜虫接种蚜虫前后表达模式无变化，且基因转录本上不存在能够导致功能变化的多态性位点。剩余的9个基因中，通过基因功能注释，Prupe.3G252200、Prupe.3G252600、Prupe.3G252000、Prupe.3G25300和Prupe.3G252400，比较容易被排除与蚜虫抗性调控的相关性(图5A)。余下的2个基因Prupe.3G251700和Prupe.3G251800都编码类受体蛋白激酶。基因组重测序数据和转录组测序数据显示Prupe.3G251700的等位基因表达频率基本均相同，而基因Prupe.3G251800在杂合抗蚜品种基因组重测序数据数据中等位基因出现频率基本相同，转录组测序数据显示出表达不平衡现象，Prupe.3G251800只有一个等位基因能够表达，且该基因在感蚜品种中没有表达(图5B)，以上都证明只有与QMR抗性连锁的Prupe.3G251800等位基因能够表达。利用Prupe.3G251800特异引物对一个含有QMR抗性等位基因的抗蚜品种，和4个不含QMR抗性等位基因接种蚜虫前后8个时间点的荧光定量PCR结果显示，只有QMR抗蚜品种能够检测到Prupe.3G251800在蚜虫接种前后的稳定表达(图5C)，因此Prupe.3G251800最有可能是QMR3.1抗蚜性状的候选调控基因。

实施例5 QMR3.1连锁的抗蚜标记在基因组上的定位

通过以上研究可知，QMR3.1抗性的候选基因Prupe.3G251800位于桃基因组版本2(https://phytozome.jgi.doe.gov/jbrowse/index.html？data＝genomes％2FPpersica/)的第3号染色体上，Prupe.3G251800位于第3号染色体Pp03:24,171,466-24,174,829处(图6A)，而找到的连锁标记位于该基因起始密码子上游-2460bp处20bp缺失(图6A)，其对应的物理位置为第3号染色体Pp03:24,169,445-24,169,464的位置，即与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位(插入或缺失)。

实施例6用于检测分子标记的引物

对覆盖与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记的区域，即覆盖20bp插入位点的基因片段设计引物(位置见图7所示)，引物核苷酸序列如下：

QMR-20bpPCR-F：5'AACTTCAGGTTTTACAAACGGAG 3'(SEQ ID NO.2)

QMR-20bpPCR-R：5'GTGGAGCCCACCAATACAAT 3'(SEQ ID NO.3)

实施例7 PpQMR3.1不同基因型在自然群体和野生近缘种间的分布情况

为了进一步确定Prupe.3G251800是否为调控QMR抗性的候选基因，并考虑到PpQMR3.1在抗感品种中巨大的表达量差异，我们对抗感等位基因对应的启动子调控区核酸序列的差异进行测序分析，发现两个等位序列在基因组起始密码子上游3Kb的范围内，只有3处多态性位点，包含-2460bp处20bp缺失，-1710bp处和-1330bp处TA重复SSR位点(图8A)。采用PlantCARE和PLACE对启动子序列的顺式调控原件进行预测，发现基因启动子两处SSR位点附近并无CREs差异，而位于-2460bp处20bp缺失导致QMR等位基因上游调控区丢失CAATBOX1和ROOTMOTIFTAPOX1 2个顺式调控原件(图8)。

根据20bp缺失位点，我们设计了扩增该多态性位点的DNA扩增引物(引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)，用于验证少量自然群体和野生近缘种品种中抗蚜性状与基因型的共分离情况。初步检测的材料包括不同地域栽培品种40份，野生毛桃、地方品种或砧木品种26份，山桃种质6份，甘肃桃种质5份，光核桃种质4份，新疆桃种质5份，扁桃种质2份和发明人课题组保存的优系材料22份，共计检测品种、品系或种质110份，鉴定结果的准确率96.4％。

实施例8桃抗蚜品种的选育方法

本实施例提供了应用上述分子标记进行桃抗蚜品种选育的方法，包括如下步骤：

1)将栽培种来源的QMR抗性品种作为亲本之一进行杂交育种；

2)提取获得的杂交后代基因组DNA作为待测样本；

3)以基因组DNA为模板，对覆盖与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记的区域设计引物并进行PCR扩增；

引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示；

PCR扩增的反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture 1μL，Mg²⁺4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，50ng/μl基因组DNA 2μL，DNA Polymerase 0.5μL，灭菌水35.5μL，总体积50μL；下游引物和上游引物在反应体系中的终浓度均为0.2μM；具体如表1所示。

表1 PCR扩增反应体系

PCR扩增的反应程序如下：预变性95℃，3min；进入PCR扩增循环，每个循环依次经过98℃，30s变性，57℃，30s复性，72℃，30s延伸，共循环38次，最后72℃，7min，完成PCR的扩增，具体如表2所示。

表2 PCR扩增反应程序

4)根据PCR扩增产物的基因型判定待测样本抗蚜性状并筛选出抗蚜单株；

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物条带大小，以判断SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位是否缺失。

当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入纯合基因型时，待测样本为感蚜性状；当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为缺失纯合基因型时，待测样本为抗蚜性状；当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入或缺失杂合基因型时，待测样本为抗蚜性状。

按照上述方法将09南3-30’和‘中桃红玉’的杂交进行桃抗蚜品种的选育。父本‘09南3-30’(Rr)的抗蚜性来源为‘农神蟠桃’，母本‘中桃红玉’感蚜(rr)，通过人工授粉杂交，获得276株杂种后代。提取杂交后代基因组DNA，用引物QMR-20bpPCR-F：5'AACTTCAGGTTTTACAAACGGAG 3'和QMR-20bpPCR-R：5'GTGGAGCCCACCAATACAAT 3'进行PCR扩增，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该群体的抗感蚜基因型。

当PCR扩增产物为190bp，则SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入纯合基因型，待测样本为感蚜性状；当PCR扩增产物为170bp，则SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为缺失纯合基因型，待测样本为抗蚜个体；当PCR扩增产物为190bp和170bp，则SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入或缺失杂合基因型，待测样本为抗蚜个体；结果如图9所示，276株杂种后代中共筛选出148株抗蚜单株和128株感蚜单株。

本发明对上述育种方法的可靠性进行了验证：杂种后代进行了1年温室鉴定和连续两年田间鉴定，分离单株的抗感蚜性状表型稳定。用引物QMR-20bpPCR-F和QMR-20bpPCR-R检测该群体的抗感蚜基因型和表现型93.10％一致(图9)，即276单株中257个单株抗性表型与基因型一致，表明本发明提供的桃抗蚜品种选育方法可操作性强，能够早期、快速、低成本、有效的预测桃树的抗蚜性状，可以用于抗蚜品种的辅助选择，在桃树抗蚜新品种培育方面具有广阔的应用前景。

最后说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明要求保护的范围。

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记、引物、应用及品种选育方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 193

<212> DNA

<213> 桃树（Prunus persica L.）

<221> 与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记

<222> (72)..(91)

<223> 72-91位插入或缺失

<400> 1

aacttcaggt tttacaaacg gagaaaataa aatattttta gagatacggt gcaaaaagtt 60

tatgccgaac aatataagtt tatgccgaac aatataacct ttaggaaaat gctagggaga 120

ccaactttag atatcaactt gtgtaccaac tctctaatag agtgtaggac ccattgtatt 180

ggtgggctcc acc 193

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> QMR-20bpPCR-F

<400> 2

aacttcaggt tttacaaacg gag 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> QMR-20bpPCR-R

<400> 3

gtggagccca ccaatacaat 20

Claims

1.一种与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的5’端起第72-91位的插入或缺失。

2.如权利要求1所述的分子标记在桃抗蚜品种选育中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，对权利要求1所述的分子标记的基因型进行检测，当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入纯合基因型时，待测样本为感蚜性状；当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为缺失纯合基因型时，待测样本为抗蚜性状；当SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入或缺失杂合基因型时，待测样本为抗蚜性状。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过PCR扩增检测SEQ ID NO.1所示序列5’端起第72-91位插入或缺失，所述PCR扩增采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ IDNO.3所示。

5.用于检测权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2及SEQ ID NO.3所示。

6.一种桃抗蚜品种选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将栽培种来源的桃绿蚜抗性品种作为亲本或亲本之一进行杂交育种；

2)提取获得的杂交后代基因组DNA作为待测样本；

3)以基因组DNA为模板，对覆盖权利要求1所述分子标记的区域设计引物并进行PCR扩增；

4)根据PCR扩增产物的基因型判定待测样本抗蚜性状并筛选出抗蚜单株：当SEQ IDNO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入纯合基因型时，待测样本为感蚜性状；当SEQ IDNO.1所示序列的5’端起第72-91位为缺失纯合基因型时，待测样本为抗蚜性状；当SEQ IDNO.1所示序列的5’端起第72-91位为插入或缺失杂合基因型时，待测样本为抗蚜性状。

7.根据权利要求6所述的桃抗蚜品种选育方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求7所述的桃抗蚜品种选育方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增的反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture 1μL，Mg²⁺4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，50ng/μl基因组DNA 2μL，DNA Polymerase 0.5μL，灭菌水35.5μL，总体积50μL；下游引物和上游引物在反应体系中的终浓度均为0.2μM。

9.根据权利要求8所述的桃抗蚜品种选育方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序如下：预变性95℃，3min；进入PCR扩增循环，每个循环依次经过98℃，30s变性，57℃，30s复性，72℃，30s延伸，共循环38次，最后72℃，7min，完成PCR的扩增。

10.根据权利要求6所述的桃抗蚜品种选育方法，其特征在于，所述步骤4)中通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物条带大小，以判断SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第72-91位是否缺失。