CN112322642A

CN112322642A - 栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因、蛋白质及其应用

Info

Publication number: CN112322642A
Application number: CN202011233377.3A
Authority: CN
Inventors: 潘磊; 王志强; 牛良; 鲁振华; 曾文芳; 崔国朝; 闫乐乐
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明涉及栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因、蛋白质及其应用。本发明在对一类栽培种来源的新抗蚜类型QMR类抗蚜材料的研究过程中，通过对桃树QMR类蚜虫抗性性状进行遗传分析、BSA基因定位、精细定位和基于组学整合的候选基因筛选，确定该抗性的候选调控基因为RLK受体蛋白激酶基因PpQMR3.1(Prupe.3G251800)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因及其编码的蛋白质能够应用于抗蚜单株的筛选、增强植物抗蚜性状等方面，具有广阔的应用前景，为桃树抗蚜品种选育提供理论依据和辅助选择手段，加速桃树抗蚜品种遗传改良进程。

Description

栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因、蛋白质及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因、蛋白质及其应用。

背景技术

桃树是重要的经济林树种，我国桃的栽培面积和产量均居世界首位。桃绿蚜(Myzus persicae，简称桃蚜)是桃树春季危害最严重的害虫，严重影响了桃产业的绿色健康发展。桃蚜是世界范围内分布最广的刺吸式害虫，能够取食超过200种植物，桃树是桃蚜的初始寄主，从桃树萌芽开始，直接危害桃树新梢，导致树体营养物质流失、叶片卷曲、新梢停长、光合能力下降；桃蚜刺吸幼果会导致果实畸形，商品品质下降(Blackman et al.,2000)；此外，桃蚜还是桃树多种植物病毒的传播媒介(Pascal et al.,2002；Decroocq etal.,2005)。在我国主要桃产区，为控制蚜虫危害，每年需要多次化学农药防治，不但提高了桃园管理成本，还会导致环境污染和农残超标等问题，生产上迫切需要绿色环保的桃绿蚜防控措施。

利用寄主植物自身抗性控制农业害虫的危害，是一种可持续且环境友好型的害虫管理方法，这离不开抗性种质资源的筛选和抗性调控机制的解析。但是，前人鉴定的抗蚜种质资源均为野生近缘种或半野生种，抗性利用困难，目前尚无抗蚜桃品种推广。桃树抗蚜种质资源的鉴定筛选是抗性利用的先决条件，已报道的抗蚜资源如下：上世纪80年代以来，法国农科院(INRA)先后报道砧木桃Rubira、垂枝桃WFP、山桃P1908等抗蚜资源，并以此开展了广泛的抗性表型分析、遗传规律分析与定位、抗性相关次生代谢物分析等方面的研究(Massoni é et al.,1982；Monet et al.,1994；Sauge et al.,1998)。王力荣等(2001)从国家桃种质资源圃(郑州)保存的众多资源中鉴定出了寿星桃类和山桃类等抗蚜材料。但筛选到的这些抗性种质都是桃野生近缘种或半野生材料，如山桃和P1908同为野生近缘种，Rubira是一个桃砧木品种，垂枝桃WFP和寿星桃都是观赏桃品种，果实商品性状非常差；作为木本植物，桃树生长周期长，育种改良过程中，抗蚜性状的导入与纯化过程漫长，导致抗性的利用十分困难。以寿星桃和山桃为例，一代保留一半的遗传物质，通过7代(0.5⁷＝0.0078＝0.78％)才能将野生种的遗传物质降低至1％以内。即是说，寿星桃和山桃需要7代(35-42年)品种培育，才能获得与栽培品种经济性状同水平的抗蚜优系。目前，世界范围内还没有商业化推广的桃树抗蚜品种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因，该基因是在栽培种来源的主效QTL控制的桃绿蚜抗性(major effect QTL controlling Myzus persicaeresistance，QMR)品种中发现的，能够为桃树抗蚜品种选育提供理论依据和辅助选择手段，加速桃树抗蚜品种遗传改良进程。

本发明的第二个目的在于，提供上述桃趋避性抗蚜基因所编码的蛋白质。

本发明的第三个目的在于，提供上述桃趋避性抗蚜基因或其编码的蛋白质在抗蚜单株筛选中的应用。

本发明的第四个目的在于，提供上述桃趋避性抗蚜基因或其编码的蛋白质在增强植物抗蚜性状中的应用。

本发明的第五个目的在于，提供上述桃趋避性抗蚜基因或其编码的蛋白质在桃抗蚜品种选育中的应用。

本发明的第六个目的在于，提供用于检测上述桃趋避性抗蚜基因的引物。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因，所述基因为PpQMR3.1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述桃趋避性抗蚜基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了上述桃趋避性抗蚜基因或其所编码的蛋白质在抗蚜单株筛选中的应用。

优选的，所述应用是通过检测PpQMR3.1基因的表达情况，筛选出含有该抗蚜基因且能够正常表达的单株即得抗蚜单株。

进一步优选的，通过实时荧光定量PCR检测PpQMR3.1基因的表达情况。

进一步优选的，检测PpQMR3.1基因采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQID NO.4所示。

优选的，所述应用是通过检测是否含有上述桃趋避性抗蚜基因所编码的蛋白质，筛选出含有该蛋白质的单株即得抗蚜单株；所述检测采用特异性抗体检测方法；所述抗体为SEQ ID NO.2所示蛋白的特异性抗体。

本发明提供了用于检测上述抗蚜基因的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3及SEQ ID NO.4所示。

本发明提供上述桃趋避性抗蚜基因或其编码的蛋白质在增强植物抗蚜性状中的应用。

优选的，所述应用是通过基因工程的方式将PpQMR3.1基因或含有该基因的表达载体导入感蚜植株中，从而增强植物抗蚜性状。

优选的，所述应用是通过外源输入的方式将上述蛋白质应用于感蚜植株中，从而增强植物抗蚜性状。

本发明提供上述桃趋避性抗蚜基因或其编码的蛋白质在植物抗蚜品种选育中的应用。

优选的，所述应用是通过基因工程和/或杂交育种的方式获得能够稳定遗传并正常表达上述桃趋避性抗蚜基因或稳定分泌其编码的蛋白质的桃树品种。

本发明的有益效果在于：

本发明在对一类栽培种来源的新抗蚜类型QMR类抗蚜材料的研究过程中，通过对桃树QMR类蚜虫抗性性状进行遗传分析、BSA基因定位、精细定位和基于组学整合的候选基因筛选，确定该抗性的候选调控基因为RLK受体蛋白激酶基因PpQMR3.1(Prupe.3G251800)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。试验证明，将本发明提供的PpQMR3.1抗蚜基因通过转基因方式导入番茄中，能够显著增加转基因番茄对桃绿蚜的抗性，说明PpQMR3.1抗蚜基因及其编码的蛋白质能够应用于抗蚜单株的筛选、增强植物抗蚜性状等方面，具有广阔的应用前景。

本发明提供的栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因PpQMR3.1是在栽培种来源的主效QTL控制的桃绿蚜抗性(major effect QTL controlling Myzus persicae resistance，QMR)品种中发现的，能够为植物抗蚜品种选育提供理论依据和辅助选择手段，加速抗蚜品种遗传改良进程。此前，国内外已经发现的桃抗蚜种质有毛桃类(Rm1、Rm2和Rm3)和山桃类两种，本发明涉及的QMR抗性材料是申请人团队长期育种工作中发现的第3类具有蚜虫抗性的新种质，与前两类抗性表型不同：首先，QMR抗性材料的亲本中没有野生种或桃近缘种材料，本身经济性状接近栽培品种，与野生抗蚜种质山桃和寿星桃比，更加容易被育种利用，育种应用价值也更突出。第二，QMR类材料呈现趋避性抗性，但与前人报道的趋避性抗性Rm1、Rm2和Rm3相比，QMR类材料在蚜虫取食后，刺吸部位没有过敏性反应(图1)。最后，对QMR抗性的遗传和定位分析表明(图3、4和5)，其遗传规律和调控基因位点与寿星桃和山桃也不相同。QMR种质的抗性来源、抗性表现和遗传定位均表明其为新的抗性类型(图1)。QMR抗性最大的优势在于：便于育种过程中抗性利用，因为桃品种培育1代的周期为5-6年(亲本杂交，杂种苗培育1年；杂种苗定植营养生长2年；杂种苗结果后优系鉴定2-3年)。以野生近缘种寿星桃和山桃为例，一代保留一半的遗传物质，通过7代(0.5⁷＝0.0078＝0.78％)才能将野生种的遗传物质降低至1％以内。即是说，寿星桃和山桃需要7代(35-42年)品种培育，才能获得与栽培品种经济性状同水平的抗蚜优系。而QMR抗性来源于栽培品种，通过1-2代(10-12年)年即可获得与栽培品种经济性状同水平的抗蚜优系，大大缩短了抗蚜品种的育种周期。

附图说明

图1为感蚜材料、趋避性抗蚜材料、抗生性抗蚜材料和QMR抗蚜材料经蚜虫危害后的典型表现图示(A)及抗性特征对比情况(B)；

图2为抗蚜候选调控基因PpQMR3.1的番茄转基因功能验证；

图中，a)转基因株系的目标基因表达量检测；b)野生型和转基因番茄接种外源蚜虫7天后，植株上蚜虫的残留数量；c)野生型和转基因番茄接种外源蚜虫7天后，植株上蚜虫的残留情况。

图3为QMR材料的趋避性蚜虫抗性表型、分离群体中的抗性分级和遗传规律分析；

图中，A.QMR材料的趋避性抗蚜表型；B.寿星桃的典型抗蚜表型-过敏性斑点；C.QMR材料的抗蚜表型；D.感蚜材料的表型；E.抗蚜分离群体的后代抗性等级分布；F.抗蚜分离群体的遗传规律分析；“09南3-30”和“09南4-6”为抗蚜杂合材料，其余代号或品种为感蚜材料。

图4为QMR抗蚜性状的BSA定位分析结果；

图中，桃第3号染色体上方的红色粗线条指示BSA分析关联出的候选调控区域。

图5为桃第3号染色体末端QMR抗蚜调控位点的精细定位分析；

图6为基于转录组合重测序数据的候选调控基因筛选；

图中，A.精细定位区间内基因的表达分析；B.PpQMR3.1在抗感品种间的表达差异及表达不平衡情况；C.RT-qPCR检测PpQMR3.1在不同品种间的表达差异情况；QMR抗蚜材料“09N-3-30”，“Rm3”抗蚜材料“中蟠1号”和R37，感蚜材料“中油桃13号”和S38，接种蚜虫前后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h和72h的幼嫩叶片被用作转录组分析，分别用QMR、Rm3-1、Rm3-2、S-1和S-2表示。

图7为PpQMR3.1基因及特异性检测标记在基因组上的位置示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

栽培种来源的抗性来自于美国引进的商业品种农神蟠桃，但是该种抗性在世界范围内并无报道。“中油桃13号”是中国农业科学院郑州果树研究所释放的商业品种，“09南3-30”、“09南4-6”、“中蟠1号”、R37、S38是中国农业科学院郑州果树研究所保存的育种优系。

实施例1栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因

本实施例提供了一种栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因，其特征在于，所述基因为PpQMR3.1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因编码的蛋白质

本实施例提供了栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因在抗蚜单株筛选中的应用

本实施例提供基于PpQMR3.1抗蚜基因表达情况的抗蚜单株筛选方法：通过检测PpQMR3.1基因的表达情况，筛选出含有该抗蚜基因且能够正常表达的单株即得抗蚜单株。以桃抗蚜单株的筛选为例，方法步骤如下：

1、桃树枝条总RNA提取试

取超低温保存样品在液氮中充分研磨，约200mg样品使用1ml Trizol；将样品匀浆液室温放置8min以使得核酸与核蛋白分离；加入0.2体积CH₃Cl，手动颠倒混匀2分钟，室温3min。4℃，12,000rpm离心10min；将上层水相转移到离心管中，加入0.5倍体积无水乙醇并混匀；将吸附柱放入收集管中，用上步所得溶液全部加至吸附柱中，静置2min，12,000rpm离心，倒掉收集管中废液；加入500μl RPE Solution，10,000rpm离心30sec，倒掉收集管中废液。重复步骤一次；将吸附柱放回收集管中，10,000rpm离心2min；将吸附柱放入的1.5ml离心管中，膜中央加入30μl DEPC-treated ddH₂O，静置5min，12,000rpm离心2min，将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续试验。

2、第一链cDNA合成

基因组DNA的去除体系混合液配制，将总RNA在冰上解冻，每管加5×gDNA Buffer2μl，总RNA 1μg，RNase-Free ddH2O补足到10μl，彻底混匀；离心收集，并置于42℃，孵育3min；然后置于冰上放置；反转录反应体系混合液配制，10×Fast RT Buffer 2μl，RTEnzyme Mix 1μl，FQ-RT Primer Mix 2μl，RNase-Free ddH2O补足到10μl；将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀；42℃，孵育15min；95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

3、荧光定量PCR检测

使用Light-Cycler 480II荧光定量仪进行qRT-PCR检测，采用SYBR Green IMaster试剂盒(Roche,瑞士)进行扩增反应。反应总体积15μL，包含100ng cDNA(1μL)，2×Lightcycler 480 SYBR Green Ⅰ Master(7.5μL)，0.5μmol.L^-1上下游引物(各0.75μL)和无RNA酶水(5μL)。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。每个样品3次重复。选取Actin作为内参基因(Tatsuki et al.,2013)，采用Primer5设计特异性引物(表2-1)。用2^-ΔΔCT公式计算基因相对表达量。

表1 Real-time RT PCR引物序列

荧光定量检测结果如图6c所示，QMR类抗性植株或品种中PpQMR3.1基因的表达量要远高于非抗蚜品种Rm3-1、Rm3-2、S-1和S-2，表明该方法能够准确筛选出抗蚜单株。

实施例4用于检测PpQMR3.1基因的引物

本实施例提供用于检测PpQMR3.1基因的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例5 PpQMR3.1蛋白在抗蚜单株筛选中的应用

本实施例提供基于PpQMR3.1蛋白的抗蚜单株筛选方法：通过检测是否含有PpQMR3.1蛋白，筛选出含有该蛋白质的单株即得抗蚜单株；所述检测采用特异性抗体检测方法；所述抗体为SEQ ID NO.2所示蛋白的特异性抗体。

实施例6栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因或蛋白质在增强植物抗蚜性状中的应用

本实施例提供PpQMR3.1基因、蛋白质在增强植物抗蚜性状中的应用：通过基因工程的方式将PpQMR3.1基因或含有该基因的表达载体导入感蚜植株中，从而增强植物抗蚜性状。或通过外源输入的方式将PpQMR3.1蛋白应用于感蚜植株中，从而增强植物抗蚜性状。

番茄和桃树一样同为桃绿蚜的寄主，所以我们采用番茄进行PpQMR3.1的转基因功能验证。根据桃受体蛋白基因PpQMR3.1(Prupe.3G251800)设计特异性引物，引物序列如下：Sal I-QMR-TGG:5’-GTCGACATctattgcagcgccgatacaa-3’；Xba Ⅰ-QMR-ATG:5’-TCTAGAatgaagaacccaagcagacg-3’。用上述cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到5′端区约1.4kb片段和3′端区约2.2kb的片段，将其连接，连接到pEASY-T1载体上，测序正确后备用。pEASY-BoPHYB经Stu Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切，连接pWM101得到pWM101-PpQMR3.1。电击转化到农杆菌GV3101中，随后利用叶盘法转化到番茄micro-Tom野生型。得到的T1种子经含有50μg·mL^-1卡那霉素的MS培养基筛选后移栽温室生长，自交得到T2，再经自交和筛选后得到纯系用于抗性鉴定试验。

筛选过程中，对待测的抗性未知的转基因植株进行PCR扩增，产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增的反应体系为：10X PCR buffer 5μl、dNTP 5μl、镁离子3μl、上下游引物各1μl、模板DNA 2μl、H₂O 31μl和KOD-Plus-DNA polymerase 1μl。进行PCR扩增的反应程序为：95℃3min；95℃30S，56℃60S，72℃30S，共扩增40个循环；72℃延伸5min；16℃保温。PpQMR3.1全长扩增引物为5′-ATGAAGAACCCAAGCAGACGT-3′，5′-CTATTGCAGCGCCGATACAAA-3′。

PCR结束后，利用1.0％琼脂糖凝胶对PCR产物进行分离，1.0％琼脂糖凝胶配置方法：去离子水90ml、10X TAE缓冲液10ml、1g琼脂t糖，快速充分混匀加热溶解后灌入胶板，插入点样孔梳子后，静止1小时使其彻底凝固；将点样孔梳子去掉，将胶板放入电泳槽，然后在电泳槽中加入适量1X TAE缓冲液；PCR产物加入6X Loading Buffer，将buffer和PCR产物混匀，聚丙烯酰胺凝胶的孔中加入预混样10μl，点DNA分子量标，用来标记PCR产物的大小以及确定样品的顺序，然后恒压200V电泳0.50小时；后将胶在紫外灯成像灯箱上照相，并统计条带。检测结果如图2a所示，番茄转基因阳性植株能够检测到大约2.0Kb条带(基因实际大小1.974Kb)，转基因阴性植株相关位置为空白。

对获得的T2转基因阳性株系进行RT-PCR检测(检测方法参照实施例3)，证实株系#1、#3和#6中PpQMR3.1可以正常表达(图2a)。

对于这些阳性转基因株系，每个株系取10株幼苗，每个幼苗接种15至蚜虫成虫，1周后鉴定植株上蚜虫的暂留情况，发现野生型植株蚜虫数目几乎不发生变化，而转基因株系#1、#3和#6上蚜虫的数量显著减少了(图2b和图2c)。由此证实栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因或蛋白质(PpQMR3.1，Prupe.3G2518000)，能够通过转基因方式增强番茄等植物对桃绿蚜的抗性。

实施例7栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因或蛋白质在桃抗蚜品种选育中的应用

本实施例提供PpQMR3.1基因、蛋白质在桃抗蚜品种选育中的应用：通过基因工程和/或杂交育种的方式获得能够稳定遗传上述桃趋避性抗蚜基因或稳定分泌其编码的蛋白质的桃树品种。

试验例1桃QMR类抗蚜性状的抗性表型和遗传规律分析

桃中已经定位的抗蚜基因Rm1、Rm2和Rm3，对应的抗性都表现为趋避性抗性(图3A)和危害部位的过敏性反应(图3B)。QMR类抗蚜材料在外接蚜虫条件下也表现出强烈趋避性，接蚜虫后的第2天，虫口密度下降至一半左后，6天时间内几乎全部离开(图3A)，且没有过敏性反应出现(图3C)。

图3D展示了感蚜材料的典型表型，即蚜虫着生及蚜虫取食导致的叶片卷曲现象。为了分析QMR性状的遗传规律，我们对4个F1分离群体进行抗性鉴定，发现群体后代抗性均呈现显著的双峰模式，即1级的抗蚜单株和5级的感蚜单株数量基本一致，并占到分离群体的大部分单株，中间类型数量很少(图3)。如果将1至4级的单株归为具有蚜虫抗性的组别，将5级单株归为感蚜组别单株，则分离群体的抗蚜和感蚜性状分离分大致为1:1(χ2＝0至8.64)，这与显性单基因或主效基因调控性状的分离比例一致。

试验例2 QMR抗蚜性状调控位点的BSA混池定位分析

根据抗性表型的鉴定结果，选取极端抗蚜单株和极端感蚜单株各40株，构建抗、感基因池，进行BSA定位分析(图4)。为了鉴定QMR抗性调控位点，对两个亲本及抗感混合池进行高通量特异性片段测序，抗性亲本‘09N3-30’平均读深为39倍，感蚜亲本‘中桃红玉’的测序深度为38倍，抗性池和感性池的的测序深度分别为75倍和61倍。在88万个多态性标记中，筛选出26.38万个单核苷酸多态性(SNP)和5.59万个插入缺失(Indel)多态性标记，采用△SNP-index和Euclidean Distance两种定位分析方法，都将该性状的调控位点关联到了第3号染色体靠近底部pp03:21,523,514和pp03:26,958,658之间，表明桃绿蚜抗性基因位于第3号染色体上的一个5.44Mb候选区域(图4)。

试验例3 QMR调控位点的精细定位分析

基于BSA定位结果，申请人采用遗传学精细定位策略继续缩小QMR基因在染色体上的位置区间(图5)。

采用‘09N-3-30’×‘中桃红玉’F₁分离群体中的单株，经过了两年的观察，表型一致的单株进行定位分析。根据BSA定位的结果，围绕包含QMR基因的定位区间，我们设计了两个Indel标记,Indel-21.52和Indel-29.95，分别对应于定位区间的两端Pp03:21,523,514和Pp03:26,958,658的位置。采用以上两个标记对288个F₁单株进行基因型分析以寻找染色体重组，共发现41个交换单株。对Indel-21.52和Indel-29.95两个标记内部区域，设计另外12个分子标记(Indel-21.61至Indel-26.35)，对这些交换单株进行基因型分析。基于14个分子标记对41个交换单株的基因型分析，共鉴定到了23种单倍型，结合交换单株对蚜虫的抗性表型，QMR基因被界定在桃基因组分子标记Indel-24.10(Pp03:24,105,281)和CE-24.24(Pp03:24,250,071)间145Kb的染色体区域中(图5)。精细定位区间内标记检测准确率最高为93％，精细定位区间中间和两端的标记对18个单株鉴定的基因型和抗蚜表型不一致，说明该位点为主效基因位点，因此将第3号染色体末端定位到的抗性位点命名为PpQMR3.1。

试验例4基于整合组学策略的QMR候选调控基因筛选

根据桃参考基因组的基因注释，可知QMR精细定位区间内含有22个基因(Prupe.3G251100至Prupe.3G25320)。我们采用抗、感品种间多态性位点比较分析和转录组比较分析结合的方法来识别QMR精细定位区间内可能的抗蚜调控候选基因。根据该基因显性遗传特点，我们推测候选基因应该在QMR材料中表达，并与非QMR材料间存在表达模式的变化或者存在可能导致基因功能改变的基因突变。

通过对转录组数据分析发现，精细定位区间内的22个基因中，5个基因在所有的转录组测序材料中完全不表达，9个基因在QMR抗蚜材料和至少1个非QMR材料蚜虫接种蚜虫前后表达模式无变化，且基因转录本上不存在能够导致功能变化的多态性位点。剩余的9个基因中，通过基因功能注释，Prupe.3G252200、Prupe.3G252600、Prupe.3G252000、Prupe.3G25300和Prupe.3G252400，比较容易被排除与蚜虫抗性调控的相关性(图6A)。余下的2个基因Prupe.3G251700和Prupe.3G251800都编码类受体蛋白激酶。基因组重测序数据和转录组测序数据显示Prupe.3G251700的等位基因表达频率基本均相同，而基因Prupe.3G251800在杂合抗蚜品种基因组重测序数据数据中等位基因出现频率基本相同，转录组测序数据显示出表达不平衡现象，Prupe.3G251800只有一个等位基因能够表达，且该基因在感蚜品种中没有表达(图6B)，以上都证明只有与QMR抗性连锁的Prupe.3G251800等位基因能够表达。利用Prupe.3G251800特异引物对一个含有QMR抗性等位基因的抗蚜品种，和4个不含QMR抗性等位基因接种蚜虫前后8个时间点的荧光定量PCR结果显示，只有QMR抗蚜品种能够检测到Prupe.3G251800在蚜虫接种前后的稳定表达(图6C)。

上述研究表明，桃树QMR类蚜虫抗性性状的调控基因为Prupe.3G251800基因。PpQMR3.1(Prupe.3G251800)基因位于桃基因组版本2(https://phytozome.jgi.doe.gov/jbrowse/index.html？data＝genomes％2FPpersica/)的第3号染色体上，具体位于第3号染色体Pp03:24,171,466-24,174,829处(图7A)。此外，找到的连锁标记位于该基因起始密码子上游-2460bp处20bp缺失(图7B)，其对应的物理位置为第3号染色体Pp03:24,169,445-24,169,464的位置。

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因、蛋白质及其应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1974

<212> DNA

<213> 桃树（Prunus persica L.）

<221> 栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因（PpQMR3.1）

<400> 1

atgaagaacc caagcagacg tcttcataag tccattacca tgaaacccat tctcactcct 60

ctgttccttc ccgtgtttct gcacatcatc accgtacacg tggccggtga cacttctcct 120

atctacactc cggtcgacga tatcaccgtt caatgtggct tttccggcca ccaactcaac 180

acagaggata acagaacttg gactggagat atcaactcaa agttctcccc ccttgaaaac 240

caagcagctg gccgctcctc cacatacaga caagcacctt cttcctcacc tgtaaaccaa 300

ctaccttaca gcaccgctag gctttctctc tatgagttta cgtacgaatt tccagtcacc 360

agcggccaaa agttcgtccg tttgtatttc aacccagttt catatggccc tgacttcgac 420

ccatccaacg ctctcttctc agtcacagca ggtggtttca cccttctcga agacttcaat 480

gcttcagtca ctgctgatgc ttttgggttg gatacaattt acagagagtt ctgtctcaac 540

gttgagtcag atgagagctt gaacattgct ttcactccaa ccagagcaac ccaagatacg 600

tatgctttta tcaacggaat tgaaattgtg tccatgccca acaatcttta ctacacctct 660

gcagaaaatt cagatggagt taattatgtg ggcagcgaca acacatttcg gatcgaaaac 720

agcactgcgc tggagatggt gtaccgattc aacgtcggtg gaagatcact ggttttcatt 780

caggacactg gtatgtaccg aaactgggat ggcgggcaaa aagagaacaa gtacttagac 840

gatttaagct ataagtttag tgttttacca gaaaacagta gtatcgaact caactttact 900

gacatagcag agtactctgc tccagaagaa ctttaccata ctggccggtc aatgggcttg 960

aacaagacca taaacaagag ctataatctc acctgggagt tccctgtcga tcccaagttt 1020

ttgtacctgg ttaggcttca tttttgtgag tttgaaccta aaattaccaa ggccagagac 1080

cgacagtttc agatcttcat cgccaatcaa acagctgaac aacttgcgga cataatcgag 1140

tggagtggtg gaaatggaag accaatttac aaggactacg ttgtgttcat gcctgcaggc 1200

cctggaagcc agaagaaagt tagtctcttt ctcgcactgc aagcaaaccc aaaagatttt 1260

atgaccaact acaacgatgc aatcttgaat gggctcgaga tcttcaaact cagtgacaca 1320

aatcggaatc ttgccggacc caatcccgac ccacctcttc taataacccc acgagtgata 1380

gctccaccgc aaagccgtaa attttcgaat aagagttcaa cttctctaat tgctatcatt 1440

gctggtctag tttccggcgt gcttgtttta ggctctgttc tcgggttttt cttggtgttc 1500

aggcgaggaa gaaaaaacaa ggactcgagc tccaaccagg gaatgaaatg ggatccattt 1560

tcttttccgg cgacccacag aacatatgga ccgtcttatt tgtgtcgtta ctttacactg 1620

gctgagatca aagccgccac tcgaaacttc gatgacagtt ttattattgg agttggaggg 1680

tttggtaacg tgtacaaagg atgcattgat gatggggcca ctctcgttgc aatcaaacgg 1740

ctaaaatctg agtcatcaca aggcgcccac gagttcaaga cggaaatcga gctgctctct 1800

cagttccgcc accgccattt ggtgtctctc atcggatatt gtaaggacgg caatgagatg 1860

gtattggtgt acgattacat gtcacgtggg accctcgaca gccatctcta ccacactgac 1920

aaccccctct ttcttgggat cagcgtctcc aaatttgtat cggcgctgca atag 1974

<210> 2

<211> 657

<212> PRT

<213> 桃树（Prunus persica L.）

<221> 栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因所编码的蛋白质

<400> 2

Met Lys Asn Pro Ser Arg Arg Leu His Lys Ser Ile Thr Met Lys Pro

1 5 10 15

Ile Leu Thr Pro Leu Phe Leu Pro Val Phe Leu His Ile Ile Thr Val

20 25 30

His Val Ala Gly Asp Thr Ser Pro Ile Tyr Thr Pro Val Asp Asp Ile

35 40 45

Thr Val Gln Cys Gly Phe Ser Gly His Gln Leu Asn Thr Glu Asp Asn

50 55 60

Arg Thr Trp Thr Gly Asp Ile Asn Ser Lys Phe Ser Pro Leu Glu Asn

65 70 75 80

Gln Ala Ala Gly Arg Ser Ser Thr Tyr Arg Gln Ala Pro Ser Ser Ser

85 90 95

Pro Val Asn Gln Leu Pro Tyr Ser Thr Ala Arg Leu Ser Leu Tyr Glu

100 105 110

Phe Thr Tyr Glu Phe Pro Val Thr Ser Gly Gln Lys Phe Val Arg Leu

115 120 125

Tyr Phe Asn Pro Val Ser Tyr Gly Pro Asp Phe Asp Pro Ser Asn Ala

130 135 140

Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe Thr Leu Leu Glu Asp Phe Asn

145 150 155 160

Ala Ser Val Thr Ala Asp Ala Phe Gly Leu Asp Thr Ile Tyr Arg Glu

165 170 175

Phe Cys Leu Asn Val Glu Ser Asp Glu Ser Leu Asn Ile Ala Phe Thr

180 185 190

Pro Thr Arg Ala Thr Gln Asp Thr Tyr Ala Phe Ile Asn Gly Ile Glu

195 200 205

Ile Val Ser Met Pro Asn Asn Leu Tyr Tyr Thr Ser Ala Glu Asn Ser

210 215 220

Asp Gly Val Asn Tyr Val Gly Ser Asp Asn Thr Phe Arg Ile Glu Asn

225 230 235 240

Ser Thr Ala Leu Glu Met Val Tyr Arg Phe Asn Val Gly Gly Arg Ser

245 250 255

Leu Val Phe Ile Gln Asp Thr Gly Met Tyr Arg Asn Trp Asp Gly Gly

260 265 270

Gln Lys Glu Asn Lys Tyr Leu Asp Asp Leu Ser Tyr Lys Phe Ser Val

275 280 285

Leu Pro Glu Asn Ser Ser Ile Glu Leu Asn Phe Thr Asp Ile Ala Glu

290 295 300

Tyr Ser Ala Pro Glu Glu Leu Tyr His Thr Gly Arg Ser Met Gly Leu

305 310 315 320

Asn Lys Thr Ile Asn Lys Ser Tyr Asn Leu Thr Trp Glu Phe Pro Val

325 330 335

Asp Pro Lys Phe Leu Tyr Leu Val Arg Leu His Phe Cys Glu Phe Glu

340 345 350

Pro Lys Ile Thr Lys Ala Arg Asp Arg Gln Phe Gln Ile Phe Ile Ala

355 360 365

Asn Gln Thr Ala Glu Gln Leu Ala Asp Ile Ile Glu Trp Ser Gly Gly

370 375 380

Asn Gly Arg Pro Ile Tyr Lys Asp Tyr Val Val Phe Met Pro Ala Gly

385 390 395 400

Pro Gly Ser Gln Lys Lys Val Ser Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Asn

405 410 415

Pro Lys Asp Phe Met Thr Asn Tyr Asn Asp Ala Ile Leu Asn Gly Leu

420 425 430

Glu Ile Phe Lys Leu Ser Asp Thr Asn Arg Asn Leu Ala Gly Pro Asn

435 440 445

Pro Asp Pro Pro Leu Leu Ile Thr Pro Arg Val Ile Ala Pro Pro Gln

450 455 460

Ser Arg Lys Phe Ser Asn Lys Ser Ser Thr Ser Leu Ile Ala Ile Ile

465 470 475 480

Ala Gly Leu Val Ser Gly Val Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Gly Phe

485 490 495

Phe Leu Val Phe Arg Arg Gly Arg Lys Asn Lys Asp Ser Ser Ser Asn

500 505 510

Gln Gly Met Lys Trp Asp Pro Phe Ser Phe Pro Ala Thr His Arg Thr

515 520 525

Tyr Gly Pro Ser Tyr Leu Cys Arg Tyr Phe Thr Leu Ala Glu Ile Lys

530 535 540

Ala Ala Thr Arg Asn Phe Asp Asp Ser Phe Ile Ile Gly Val Gly Gly

545 550 555 560

Phe Gly Asn Val Tyr Lys Gly Cys Ile Asp Asp Gly Ala Thr Leu Val

565 570 575

Ala Ile Lys Arg Leu Lys Ser Glu Ser Ser Gln Gly Ala His Glu Phe

580 585 590

Lys Thr Glu Ile Glu Leu Leu Ser Gln Phe Arg His Arg His Leu Val

595 600 605

Ser Leu Ile Gly Tyr Cys Lys Asp Gly Asn Glu Met Val Leu Val Tyr

610 615 620

Asp Tyr Met Ser Arg Gly Thr Leu Asp Ser His Leu Tyr His Thr Asp

625 630 635 640

Asn Pro Leu Phe Leu Gly Ile Ser Val Ser Lys Phe Val Ser Ala Leu

645 650 655

Gln

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> qQMR3.1-F

<400> 3

ccaagcagct ggccgctcct c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> qQMR3.1-R

<400> 4

gggttgaaat acaaacggac g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> qActin-F

<400> 5

gattccggtg cccagaagt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> qActin-R

<400> 6

ccagcagctt ccattccaa 19

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Sal I-QMR-TGG

<400> 7

gtcgacatct attgcagcgc cgatacaa 28

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> XbaⅠ-QMR-ATG

<400> 8

tctagaatga agaacccaag cagacg 26

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> PpQMR3.1全长扩增引物F

<400> 9

atgaagaacc caagcagacg t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> PpQMR3.1全长扩增引物R

<400> 10

ctattgcagc gccgatacaa a 21

Claims

1.一种栽培种来源的桃趋避性抗蚜基因，其特征在于，所述基因为PpQMR3.1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的桃趋避性抗蚜基因所编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的桃趋避性抗蚜基因或如权利要求2所述的蛋白质在抗蚜单株筛选中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过检测PpQMR3.1基因的表达情况，筛选出含有该抗蚜基因且能够正常表达的单株即得抗蚜单株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过实时荧光定量PCR检测PpQMR3.1基因的表达情况。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测PpQMR3.1基因采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

7.用于检测权利要求1所述抗蚜基因的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过检测是否含有如权利要求2所述的蛋白质，筛选出含有该蛋白质的单株即得抗蚜单株；所述检测采用特异性抗体检测方法；所述抗体为SEQ ID NO.2所示蛋白的特异性抗体。

9.如权利要求1所述的桃趋避性抗蚜基因或如权利要求2所述的蛋白质在增强植物抗蚜性状中的应用。

10.如权利要求1所述的桃趋避性抗蚜基因或如权利要求2所述的蛋白质在植物抗蚜品种选育中的应用。