CN103215237A

CN103215237A - 一组水稻抗褐飞虱基因及其编码蛋白及应用

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Publication number: CN103215237A
Application number: CN2013100989279A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 刘裕强; 吴寒; 江玲; 刘艳玲; 何俊; 陈亮明; 刘世家; 刘喜; 王益华; 赵志刚; 张文伟; 陈赛华
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-03-25
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-03-25
Also published as: CN103215237B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一组水稻抗褐飞虱基因及其编码蛋白及应用。本发明所述的一组水稻抗褐飞虱基因序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。本发明的水稻抗虫相关蛋白影响植物的抗虫性。提高该蛋白编码基因的表达可导致感虫植物抗虫，从而可以培育植物抗褐飞虱转基因植物。所述基因及其编码蛋白可以应用于植物遗传改良。

Description

一组水稻抗褐飞虱基因及其编码蛋白及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一组水稻抗褐飞虱基因及其编码蛋白及应用。

技术背景

水稻是世界最主要的粮食作物之一，但在水稻生产过程中常年受到各类病虫害的危害。我国每年因病虫害造成的水稻产量损失达400-500万吨。褐飞虱是水稻最主要的害虫之一，具有生长周期短，繁殖力强以及高度的迁飞性等特点，对水稻生产构成极大的威胁。长期以来，化学防治在减轻褐飞虱危害中发挥了重要作用，但是化学农药的使用，不仅使褐飞虱产生了抗药性，而且间接杀死了褐飞虱的天敌，最终导致褐飞虱危害的再度猖獗，此外，化学农药的使用同样也对自然环境和生态造成了污染和破坏，并引起稻谷农药残留，品质下降。所以目前认为最理想的防治褐飞虱的方法是利用寄主抗性，抗虫品种的选育和利用是一种安全、经济、有效的措施。同时为了克服褐飞虱新的生物型的出现，在育种中进行多基因聚合成为一个行之有效的手段。所以发现和克隆新的抗褐飞虱基因，不仅能够研究水稻抗褐飞虱的机制，同时也为新品种的选育打下坚实的基础。

到目前为止，已经发现和定位的水稻抗褐飞虱基因有28个，但是只有Bph14已被克隆，该基因编码一个CC-NBS-LRR蛋白，此类蛋白作为典型的R基因，参与了众多的抗病反应^[1]。此外，另一个已克隆的抗蚜虫基因Mi1.2，也属于此类基因^[2]。由此可见水稻对吸汁类害虫的抗性与植物的抗病性具有一定的相似性。凝集素类受体激酶是植物体内广泛存在的一类蛋白，属于受体蛋白激酶的一个亚家族，在植物的生长发育与逆境胁迫等方面有重要的生物学功能^[3-6]。它通过膜外的受体结构识别外界环境或者逆境信号，然后将信号传递到细胞内，通过膜内激酶结构的磷酸化或去磷酸化，激活下游信号途径。有研究表明，此类基因参与了植物的抗病、虫反应。如水稻抗稻瘟病基因Pi-d2就属于此类基因^[7]。但是，此类蛋白激酶在水稻抗褐飞虱中的作用尚未见报道。

参考文献：

[1]Frank LW Takken and Aska Goverse.How to build a pathogen detector:structural basis of NB-LRR function.Current Opinion in Plant Biology,2012,15:1–10

[2]Rossi M,Goggin FL and Milligan SB.The nematode resistance gene Mi of tomato confers resistance against the potato aphid.Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,1998,95:9750-9754.

[3]Bouwmeester K and Govers F.Arabidopsis L-type lectin receptor kinases:phylogeny,classification,and expression profiles.Journal of Experimental Botany,2009,60(15):4383–4396.

[4]Singh P,Kuo YC,Mishra S,Tsai CH,Chien CC,Chen CW,Desclos-Theveniau M,Chu PW,Schulze B,Chinchilla D,Boller T,Zimmerli L.The lectin receptor kinase-VI.2is required for priming and positively regulates Arabidopsis pattern-triggered immunity.Plant Cell,2012, 24(3):1256-70.

[5]Wan J,Patel A,Mathieu M,Kim SY,Xu D,Stacey G.A lectin receptor-like kinase is required for pollen development in Arabidopsis.Plant Mol Biol,2008,67(5):469-82.

[6]Deng KQ;Wang QM;Zeng JX;Guo XH;Zhao XY;Tang DY;Liu XM.A Lectin Receptor Kinase Positively Regulates ABA Response during Seed Germination and Is Involved in Salt and Osmotic Stress Response,Journal of Plant Biology,2009;52(6):493.

[7]Chen X,Shang J,Chen D,Lei C,Zou Y,Zhai W,Liu G,Xu J,Ling Z,Cao G,Ma B,Wang Y,Zhao X,Li S,Zhu L.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance.Plant J.2006,46(5):794-804.

发明内容

本发明的目的在于提供一组水稻抗褐飞虱基因及应用。

本发明的另一目的是提供该水稻抗褐飞虱基因编码蛋白及应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一组水稻抗褐飞虱相关蛋白，其特征在于选自氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质，或者如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻抗褐飞虱相关的由序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4衍生的蛋白质。

为了使本发明中水稻抗褐飞虱相关蛋白便于纯化，可在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

本发明所述的如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻抗褐飞虱相关的由序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4衍生的蛋白质，可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。其编码基因可通过将SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12中任一所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述水稻抗褐飞虱相关蛋白的水稻抗褐飞虱基因簇Bph17也属于本发明的保护范围。

所述的水稻抗褐飞虱基因簇Bph17，主要由OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3、OsLecRK4基因组成，其中OsLecRK1的全长序列为SEQ ID NO.5，编码序列为SEQ ID NO.9，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；OsLecRK2的全长序列为SEQ ID NO.6，编码序列为SEQ ID NO.10，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；OsLecRK3的全长序列为SEQ ID NO.7，编码序列为SEQ ID NO.11，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；OsLecRK4的全长序列为SEQ ID NO.8，编码序列为SEQ ID NO.12，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的水稻抗褐飞虱基因簇Bph17，还包括在严格条件下与SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.12中任一条DNA序列杂交且编码水稻抗褐飞虱相关蛋白的DNA分子；或者与SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.12中任一条DNA序列具有90%以上同源性，且编码水稻抗褐飞虱相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65oC下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增所述基因OslecRK1、OslecRK2、OslecRK3和OslecRK4全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

一种培育抗褐飞虱转基因水稻的方法，其特征在于将所述水稻抗褐飞虱基因簇Bph17中任一个基因导入感虫水稻中，死苗率低于60%的转基因水稻即为抗褐飞虱的转基因水稻。

斯里兰卡地方品种Rathu Heenati(RH)对已鉴定的各种褐飞虱生物型均表现高抗，同时兼抗白背飞虱和灰飞虱，具有一定的应用前景。利用Rathu Heenati和粳稻品种02428的F₂群体，在第四染色体短臂RM8213和RM5953之间检测到一个抗褐飞虱主基因，并命名为Bph17。进一步利用BC₂F_2：3和BC₃F_2：3等作图群体（约2万个家系）将该基因定位于约70Kb的区间内（图2）。测序并结合序列分析发现，该区间包含有4个高度同源的凝集素类受体激酶（OsLeRK1-OsLeRk4）。功能互补实验的结果表明，在感虫背景中转入抗性基因簇中的单个基因能部分提高对褐飞虱的抗性；当四个基因的表达被下调后，抗褐飞虱近等基因系的抗性也显著下降。进一步对精细定位群体中分离得到的含有一个、两个、三个和四个基因的重组个体，进行褐飞虱抗性鉴定，表明四个抗性基因的褐飞虱抗性存在一定的累加作用。我们利用BP348-e-4-2,Lv-7和Sarinah进行抗褐飞虱基因的遗传定位，也均在该位点检测到一个抗褐飞虱主基因。之前的研究表明，另外两个抗褐飞虱水稻品种Ptb33和IR72含有与RH相同抗褐飞虱基因。进一步，对上述6个品种与感虫品种02428、Nippbare和9311中的四个抗性基因进行序列比对，发现OsLeRK1、OsLeRK2和OsLeRK3在上述5个抗性品种中是完全一致的，OsLeRK4存在两种类型。该抗性基因簇的克隆将对阐明水稻抗吸汁类害虫的分子机理及稻飞虱生物防治和水稻的安全生产将具有十分重要的应用价值。

有益效果：

本发明的水稻抗褐飞虱基因及编码蛋白影响水稻对褐飞虱的反应。将所述蛋白的编码基因导入水稻中，可以获得对褐飞虱抗性提高的转基因水稻。所述蛋白及其编码基因可以应用于水稻的遗传改良。

附图说明

图1感虫品种02428和抗虫品种Rathu Heenati接种褐飞虱后的表型比较。

图2Bph17在第4染色体上的精细定位。

图3转OslecRK1、OslecRK2、OslecRK3和OslecRK4的植株与对照植株接种褐飞虱后的抗性比较。

图4抗感品种中四个OslecRK1、OslecRK2、OslecRK3和OslecRK4的序列对比。

图5为本发明中所用到的双元载体pCAMBIA1305.1

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、水稻抗褐飞虱相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻品种Rathu Heenati的抗褐飞虱表现

水稻品种Rathu Heenati高抗水稻褐飞虱。接种褐飞虱若虫后，Rathu Heenati的表现为植株生长正常，无明显不良症状表现。而感虫对照02428，表现为叶片卷曲，植株萎蔫直至枯死（见图1）。

二、抗褐飞虱基因定位

1、抗褐飞虱基因初步定位

利用Rathu Heenati/02428杂交F2群体检测抗褐飞虱基因。在第4染色体短臂两SSR标记RM8213和RM5953区间内检测到一个抗褐飞虱主基因，并命名为Bph17。

2、抗褐飞虱基因的精细定位

根据初步定位的结果，利用2103个Rathu Heenati/02428杂交F2群体，再次在标记RH7845和RM5953的区间内检测到抗褐飞虱主基因Bph17。进一步利用RH7845和RM5953两个标记对一个由6514和13256个植株组成的BC2F2、BC3F2群体进行重组个体的筛选，进行表型鉴定。同时利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对Bph17进行了精细定位，并根据定位结果初步预测候选基因，具体方法如下：

（1）SSR标记开发

将公共图谱的InDel标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter（李强等，遗传，2005，27(5):808-810）或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列（重复次数≥6）；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在02428和Rathu Heenati之间的多态性，表现多态者用作精细定位Bph17的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。

表2用于精细定位的分子标记

标记	正向引物	反向引物	类型
				RM8213	AGCCCAGTGATACAAAGATG	GCGAGGAGATACCAAGAAAG	SSR
A4	AAGCAGCATAAACTGATTGA	TCATCTTCTGAAAAAGCAAT	InDel
				RH7845	AGTATGTCACTTTGGGCTTAT	ACAATACATAGAGAGTTAGGTTCA	InDel
RM5953	AAACTTTCTGTGATGGTATC	ATCCTTGTCTAGAATTGACA	SSR
				RH784	TTCTTGGCTGATTGGGGAGTAT	ATTTGGAATGGAGCAGAGTGGA	InDel
RH0078	GCCGATTTGGTCTAACTTCATT	CAACCAGCAAGGAAACAATAAA	InDel
				W4	GTTTCAACCGAATAGCACGAG	CGGAATAACTCACATCGGCA	InDel
RM16533	TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC	CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC	SSR
				RHD3	GGTAAGGTTGGGCGGTAG	AGTGAAGGGTGAGGGTGG	InDel
RHD9	GTCCATCCGAAGGTGAAAGT	CCGAACATCGAGGAATACAA	InDel
				RH7	CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG	TGAGTGTAACCCGAAGTGGC	InDel
WH2	CCCACCACACCAGAGATAAA	ACACAACACCCGCATACAA	InDel
				W1	TCCTAATCAGCCAATAAATCA	GCAATCTAGTGCACGAACATA	InDel
RHC10	CAATACGGGAGATTTGGAGT	TTGGGAAGCATACGAGTGA	InDel

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃（引物不同，有所调整）45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。

PCR产物纯化回收，按试剂盒（北京Tiangen公司）步骤进行。PCR产物酶切反应过夜后，用1-4%的琼脂糖凝胶中电泳分离，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。

根据BC₂F₂、BC₃F₂群体中单株的分子数据和表型数据，最终把Bph17基因精细定位在标记RHD9和RHC10之间，物理距离约为70kb（图2）。利用日本水稻注释计划数据库（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）和美国密西根州立大学水稻基因组注释计划（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml），发现在70kb的区间内存在7个候选基因，其中ORF5、ORF6和ORF7都编码一类凝集素类受体蛋白激酶，并且在ORF7下游5kb的位置也存在一个编码凝集素类受体蛋白激酶的ORF，所以我们将这四个ORF（Os04g0201900、Os04g0202350、Os04g0202500和Os04g0201900）作为候选基因。

(2）基因组全长互补载体的构建

根据预测的候选基因序列，以日本晴（英文名Nipponbare，一个完成全基因组测序的水稻品种）序列为模板，设计引物（引物见表3），对源自Rathu Heenati中的Bph17进行扩增，获得的OslecRK1全长为6831bp，OslecRK2全长为5651bp，OslecRK3全长为4956bp，OslecRK4全长为2884bp。用同源重组试剂盒（http://bioinfo.clontech.com/infusion/，购自日本Takara公司）把片段重组到pCAMBIA1305.1载体中。（来自澳大利亚的一个公开报道和使用的质粒，图4）

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中序列5-8所示的核苷酸序列，分别编码813,811,811和803个氨基酸残基组成的蛋白质（见序列表的序列1-4）。将序列1-4所示的蛋白分别命名为OsLecRK1、OsLecRK2、 OsLecRK3和 OsLecRK4，将序列1-4所示的蛋白的编码基因命名OsLecRK1、OsLecRK2、 OsLecRK3和 OsLecRK4。OsLecRK1、OsLecRK2、 OsLecRK3和 OsLecRK4的编码序列如序列表的序列9-12所示。

表3 用于本发明Bph17互补载体构建的引物

名称	序列	序列表编号
			OsLecRK1-F	ACCCGGGGATCCTCTAGAATTGTTTACTCCAATAACGGT	SEQ ID NO.13
OsLecRK1-R	AAGCTTGCATGCCTGCAGTTATGGGACAGAGTGAGTATTT	SEQ ID NO.14
			OsLecRK2-F	ACCCGGGGATCCTCTAGACTTTCGCAGGGTGGCAAATAGGGT	SEQ ID NO.15
OsLecRK2-R	CTGCAGGTCGACTCTAGACCTTCGCTGCTCACTAGGACCGTGTA	SEQ ID NO.16
			OsLecRK3-F	ACCCGGGGATCCTCTAGAGCCCGCTCGCTACCGCT	SEQ ID NO.17
OsLecRK3-R	CTGCAGGTCGACTCTAGACGGTCCTGCACATTACTGTAG	SEQ ID NO.18
			OsLecRK4-F	ACGAATTCGAGCTCGGTACCGATGCAAGGGATGTTGTATGTA	SEQ ID NO.19
OsLecRK4-R	AGGTCGACTCTAGAGGATCCGAGAACTGGCGAACCGATGT	SEQ ID NO.20

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一，农杆菌介导转化

以农杆菌菌株EHA105（购自美国英俊公司）为介导，将上述构建的四个基因重组载体导入感虫品种Kitaake。

（1）28℃培养含重组Bph17的农杆菌16 hr，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

（2）将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基（N6固体共培养培养基，Sigma公司购买）中，24℃共培养3天；

（3）将上述愈伤接种在含有150mg/L潮霉素B（Sigma公司购买）的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天；

（4）挑取健康愈伤转入200mg/L潮霉素B的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

（5）挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素B的分化培养基上分化；

（6）分化成苗的再生水稻植株即为所获得的Bph17基因的转基因植株。

二、转基因植株的鉴定

分别将T₀代转Bph17植株和Kitaake种植在南京农业大学转基因作物试验网室内。

水稻植株即将开花时，取叶片，提取基因组DNA,以基因组DNA为模板，通过PCR分子检测（前引物在载体上设计，后引物在插入片段上设计，见表4）。PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer5(10pmol/ul)2ul，Primer6(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O10ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

表4.转基因检测引物

转基因检测引物	序列
		gOsLecRK1-F	TGAGCGCAACGCAATTAAT
gOsLecRK1-R	GAGTATCTATATTTATGGCA
		gOsLecRK2-F	TGAGCGCAACGCAATTAAT
gOsLecRK2-R	AGTCTTGATCACTTCCATA
		gOsLecRK3-F	TGAGCGCAACGCAATTAAT
gOsLecRK3-R	ACATATAGACCTCCAATTTACA
		gOsLecRK4-F	TGAGCGCAACGCAATTAAT
gOsLecRK4-R	TAGAACTGAGCTCTGGCTGCGAA

用试剂盒（北京Tiangen公司）纯化回收PCR产物。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测。结果表明转OslecRK1、OslecRK2、OslecRK3和OslecRK4分别获得22、28、19和25株PCR检测阳性的植株。

将待鉴定转OslecRK1、OslecRK2、OslecRK3和OslecRK4的材料及感虫受体品种Kitaake分别浸种催芽，播种于直径5.8cm、高6.0cm,盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底有一小孔,便于渗透吸水)。置于65cm×44cm×14cm的塑料周转箱内(保持水层约2cm)。每钵播种30粒已露白的萌动种子，接虫前4d间苗，淘汰病、弱苗，每钵保留20棵整齐一致的健苗用于接种褐飞虱幼虫。2次重复。当秧苗长至两叶一心时，进行接种鉴定。按每苗10头2-3龄褐飞虱接种。接种后的苗置于温室周转箱内或移栽到大田内生长，注意水肥管理。待Kitaale死亡后，对转基因株系进行调查。

感虫受体品种Kitaake的死苗率为100%，转OslecRK1家系的死苗率为60%，转OslecRK2家系的死苗率为65%，转OslecRK3家系的死苗率为50%，转OslecRK4家系的死苗率为90%。验证了Rathu Heenati的抗褐飞虱性状是由OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3和OsLecRK4基因控制的，即OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3和OsLecRK4基因为水稻抗褐飞虱相关基因（见图3）。

Claims

1.一组水稻抗褐飞虱相关蛋白，其特征在于选自氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质，或者如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻抗褐飞虱相关的由序列SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的水稻抗褐飞虱基因簇Bph17。

3.根据权利要求2所述的一种水稻抗褐飞虱基因簇Bph17，其特征在于主要由OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3、OsLecRK4基因组成，其中OsLecRK1的全长序列为SEQ ID NO.5，编码序列为SEQ ID NO.9，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；OsLecRK2的全长序列为SEQ ID NO.6，编码序列为SEQ ID NO.10，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；OsLecRK3的全长序列为SEQ ID NO.7，编码序列为SEQ ID NO.11，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；OsLecRK4的全长序列为SEQ ID NO.8，编码序列为SEQ ID NO.12，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求2所述的一种水稻抗褐飞虱基因簇Bph17，其特征在于还包括在严格条件下与SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.12中任一条DNA序列杂交且编码水稻抗褐飞虱相关蛋白的DNA分子；或者与SEQ ID NO.5～SEQID NO.12中任一条DNA序列具有90%以上同源性，且编码水稻抗褐飞虱相关蛋白的DNA分子。

5.含有权利要求1所述的水稻抗褐飞虱基因簇Bph17中任一个基因的重组表达载体。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。

7.含有权利要求3所述的水稻抗褐飞虱基因簇Bph17中任一个基因的细胞。

8.权利要求2所述的水稻抗褐飞虱基因簇Bph17在培育抗褐飞虱水稻品种中的应用。

9.权利要求4所述的重组表达载体在培育抗褐飞虱水稻品种中的应用。

10.一种培育抗褐飞虱转基因水稻的方法，其特征在于将权利要求2或3所述基因导入感虫水稻中，死苗率低于60%的转基因水稻即为抗褐飞虱的转基因水稻。