CN112062825B

CN112062825B - 一种灰飞虱基因LsECP1及其编码产物与应用

Info

Publication number: CN112062825B
Application number: CN202010983840.XA
Authority: CN
Inventors: 纪锐; 付健美; 李晶; 王璐; 田甜; 方继朝
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: CN112062825A

Abstract

本发明公开了一个灰飞虱基因LsECP1及其编码产物与应用，该基因LsECP1具有SEQ ID No.1的DNA序列。该基因序列由881个核苷酸碱基组成，包含一个由558个核苷酸构成的完整的编码框，编码含有185个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现该基因与灰飞虱的存活、繁殖有关。构建LsECP1的RNAi载体，转入水稻中，在转基因水稻体内表达LsECP1基因的dsRNA，可以达到提高水稻对灰飞虱抗性的目的。本发明将在作物育种，特别是在水稻抗虫育种中得到广泛应用。

Description

一种灰飞虱基因LsECP1及其编码产物与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种灰飞虱基因LsECP1及其编码产物与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是中国乃至全球最重要的粮食作物之一。在中国，每年由于水稻虫害造成的水稻产量损失巨大，重灾年份甚至颗粒无收。因此如何通过减少虫害来增加粮食产量，是当今人类必需要面对的迫切问题。

自进入本世纪以来，稻飞虱发生范围和发生数量进一步上升。稻飞虱属于半翅目Hemiptera，飞虱科Delphacidae，主要包括褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera、灰飞虱Laodelphax striatellus等，是我国水稻作物上的重要害虫。其中灰飞虱广泛分布于亚洲水稻种植区，它不仅能够直接吸食水稻汁液造成危害，还能传播水稻条纹叶枯病和水稻黑条矮缩病等病毒病。近些年来，灰飞虱接连暴发，所传播的病毒病发生范围进一步扩大、危害程度进一步加重，在长三角稻区不仅水稻条纹叶枯病引起严重危害，而且黑条矮缩病也呈上升趋势，对我国的水稻粮食产量造成了严重损失。在针对灰飞虱的综合防治体系中，种植抗虫水稻品种是控制虫害及其传播的病毒病最经济有效的方法之一，从而最终实现灰飞虱的可持续控制。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源或内源的dsRNA(double-strandedRNA，dsRNA)特异性地引起靶标基因表达沉默的现象，利用RNAi技术对昆虫基因进行功能研究已有较多的报道，近几年，国内外尝试利用转基因植物表达相关基因dsRNA的方法来沉默取食昆虫的相应靶标基因，进而影响昆虫的存活、发育和繁殖，希望最终能达到控制害虫的目的。最近，这一技术己开始在田间实施，并取得了不错的效果。其中利用转基因水稻表达褐飞虱相关基因dsRNA(己糖转运蛋白基因hexose transporter gene，NlHT1、羧肽酶基因carboxypeptidase gene，Nlcar和类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶基因trypsin-like serineprotease，Nltry)，可以在一定程度上降低靶标基因的转录水平，但对褐飞虱的致死效果并不明显。

至今为止，国内外尚没有克隆到能够应用此技术的灰飞虱相关靶标基因，可以通过转基因水稻沉默该基因而达到控制灰飞虱为害的目的。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种灰飞虱基因LsECP1。

本发明还要解决的技术问题是提供了灰飞虱基因LsECP1编码的蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞。

本发明还要解决的技术问题是提供了灰飞虱基因LsECP1，所述的蛋白，所述的表达盒、重组载体或细胞在获得抗虫功能的植物中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有抗虫功能的植物的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了鉴定获得具有抗虫功能的植物的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种灰飞虱基因LsECP1，其LsECP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明内容还包括所述的灰飞虱基因LsECP1编码的蛋白，其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的灰飞虱基因LsECP1。

其中，所述表达载体为pMECE-LsECP1。

本发明内容还包括所述的灰飞虱基因LsECP1，所述的蛋白，所述的表达盒、重组载体或细胞在获得抗虫功能的植物中的应用。

其中，所述植物包括但不仅限于水稻，还可以为其他绿色植物。

本发明内容还包括获得具有抗虫功能的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述的基因；或

2)使植物表达所述的蛋白。

所述的方法，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤。

本发明内容还包括鉴定获得具有抗虫功能的植物的方法，其中植物是包含所述的基因的植物、表达所述的蛋白的植物或任一所述的方法获得的植物，包括以下步骤：

1)测定所述植物是否包含所述的基因；或，

2)测定所述植物是否表达所述的蛋白。

本发明通过灰飞虱唾液腺转录组测序分析获得了LsECP1基因全长；然后以LsECP1基因片段为模板合成相应的dsRNA，并利用注射目的片段dsRNA的方法分析LsECP1基因在RNAi沉默后，灰飞虱中LsECP1的基因表达水平及相应的存活率、产卵量；利用转基因技术将灰飞虱基因LsECP1转化入水稻体内，使该转基因水稻表达LsECP1基因的dsRNA片段。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：本发明获得了一个灰飞虱基因LsECP1，该基因序列由881个核苷酸碱基组成，包含一个由558个核苷酸碱基构成的完整的编码框，编码含有185个氨基酸残基的小分子量蛋白。本发明通过实验研究发现该基因与灰飞虱的存活、繁殖有关，并且构建LsECP1的RNAi载体，转入水稻中，在转基因水稻体内表达LsECP1基因的dsRNA，可以达到提高水稻对灰飞虱抗性的目的。本发明将在作物育种，特别是在水稻抗虫育种中得到广泛应用。本发明利用该转基因技术证实转入LsECP1基因的转基因水稻对灰飞虱均具有极好的抗虫效果。该基因的分离克隆，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗稻飞虱育种将起到重要的促进作用。

附图说明

图1是灰飞虱LsECP1基因全长电泳图，图中，1泳道为灰飞虱PCR电泳结果，M为Marker；

图2是灰飞虱注射LsECP1 dsRNA后对其表达量的抑制作用柱状图，图中，dsLsECP1指注射10nl LsECP1 dsRNA(1μg/μl)的灰飞虱；dsGFP指注射10nl GFP dsRNA(1μg/μl)的灰飞虱；星号表示dsLsECP1组与dsGFP组之间LsECP1基因表达水平存在极显著差异(**，P＜0.01，Student’s t-tests)，柱形图为平均数±标准误(n＝6)；

图3是灰飞虱注射LsECP1 dsRNA后对其存活率的影响图，dsLsECP1指注射10nlLsECP1 dsRNA(1μg/μl)的灰飞虱；dsGFP指注射10nl GFP dsRNA(1μg/μl)的灰飞虱；星号表示dsLsECP1组与dsGFP组之间灰飞虱存活率存在显著差异(*，P＜0.05；**，P＜0.01，Student’s t-tests)，线形图为平均数±标准误(n＝5)；

图4是灰飞虱注射LsECP1 dsRNA后对雌虫产卵量的影响柱状图，图中，dsLsECP1指注射10nl LsECP1 dsRNA(1μg/μl)的灰飞虱；dsGFP指注射10nl GFP dsRNA(1μg/μl)的灰飞虱；星号表示dsLsECP1组与dsGFP组之间单雌产卵量存在极显著差异(**，P＜0.01，Student’s t-tests)，柱形图为平均数±标准误(n＝15)；

图5是含LsECP1基因的水稻遗传转化载体质粒结构示意图；

图6是取食表达LsECP1 dsRNA的转基因水稻对灰飞虱体内LsECP1基因表达水平抑制作用的柱状图，图中，irLsECP1-2：取食表达LsECP1 dsRNA转基因水稻品系irLsECP1-2的灰飞虱体内LsECP1基因表达量；irLsECP1-7：取食表达LsECP1 dsRNA转基因品系irLsECP1-7的灰飞虱体内LsECP1基因表达量；WT：取食非转基因水稻的灰飞虱体内LsECP1基因表达量；图中星号表示取食转基因品系(irLsECP1-2或irLsECP1-7)与WT水稻的灰飞虱之间LsECP1基因表达量存在极显著差异(**，P＜0.01.Student’s t-tests)，柱形图为平均数±标准误(n＝6)；

图7是取食表达LsECP1 dsRNA的转基因水稻对灰飞虱存活率的影响图，图中，irLsECP1-2：取食表达LsECP1 dsRNA转基因水稻品系irLsECP1-2的灰飞虱存活率；irLsECP1-7：取食表达LsECP1 dsRNA转基因水稻品系irLsECP1-7的灰飞虱存活率；WT：取食非转基因水稻的灰飞虱存活率；图中星号表示取食转基因品系(irLsECP1-2或irLsECP1-7)与WT水稻的灰飞虱之间存活率存在显著差异(*，P＜0.05；**，P＜0.01，Student’s t-tests)，线形图为平均数±标准误(n＝10)；

图8是取食表达LsECP1 dsRNA的转基因水稻对灰飞虱产卵量的影响图，图中，irLsECP1-2：取食表达LsECP1 dsRNA转基因水稻品系irLsECP1-2的灰飞虱单雌产卵量；irLsECP1-7：取食表达LsECP1 dsRNA转基因水稻品系irLsECP1-7的灰飞虱单雌产卵量；WT：取食非转基因水稻的灰飞虱单雌产卵量；图中星号表示取食转基因品系(irLsECP1-2或irLsECP1-7)与WT水稻的灰飞虱之间单雌产卵量存在显著差异(*，P＜0.05；**，P＜0.01，Student’s t-tests)，柱状图为平均数±标准误(n＝15)；

图9是表达LsECP1 dsRNA的转基因水稻品系对灰飞虱的耐害性实验图，图中，irLsECP1-2、irLsECP1-7：表达LsECP1 dsRNA转基因水稻品系；WT：非转基因水稻；其中，灰飞虱为害30天后，非转基因水稻枯死，irLsECP1-2、irLsECP1-7水稻仅外面的叶片枯黄，其余部分仍为正常绿色。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明通过构建灰飞虱唾液腺转录组文库进行高通量测序的方法获得转录组数据，初步得到LsECP1 CDS全长序列。首先在CDS序列的5’端和3’端非编码区设计一对引物LsECP1-CDS-F和LsECP1-CDS-R。再提取灰飞虱RNA并反转录成cDNA，以此cDNA为模板，以LsECP1-CDS-F和LsECP1-CDS-R为引物进行常规PCR反应，获得LsECP1CDS全长序列并连接到pMD19-T克隆载体，转化入大肠杆菌感受态细胞(TG1)，摇菌，送菌液测序(南京金斯瑞公司)。测序结果与转录组获得的LsECP1 CDS全长序列进行比对验证。随后在LsECP1 CDS序列中选取497bp长度的片段设计合成dsRNA，并用显微注射法对目的基因进行RNAi，检测其对目的基因表达水平抑制效果及对灰飞虱存活率、产卵量的影响。并通过转基因技术获得表达LsECP1基因dsRNA的水稻转基因突变体。通过生物测定，证明此转基因水稻具有很好的抗虫效果。对该基因的分离和克隆以及生物学功能的分析，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻抗灰飞虱育种将起到重要的促进作用。本发明实施例中PCR扩增采用的是Takara公司购买的试剂盒。

实施例1：

1、LsECP1基因的获得和序列分析

利用对灰飞虱唾液腺转录组测序的方法，获得表达基因数据库，并筛选到LsECP1基因，初步得到LsECP1 CDS全长序列。提取灰飞虱(南京地区)唾液腺mRNA并反转录成cDNA，以该cDNA为模板，以LsECP1基因5’端和3’端非编码区设计LsECP1-CDS-F和LsECP1-CDS-R为引物，PCR扩增CDS(图1)全长序列后连接入pMD19-T克隆载体，转化入大肠杆菌感受态细胞(TG1)，挑取4个克隆送南京金斯瑞公司测序，获得LsECP1基因DNA序列，见序列表SEQ IDNo.1表示的序列。根据该序列的开放阅读框(ORF)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，如SEQ IDNo.2所示。

具体步骤为：

1)灰飞虱唾液腺RNA的提取、质量检测及总cDNA第一链合成；

2)从总cDNA第一链中以PCR合成LsECP1 CDS片段

上游引物(SEQ ID No.3)：5′-CTCATTGGCTTTCATACAGTCAG-3′

下游引物(SEQ ID No.4)：5′-TTCTATTGAGTAGTTAAACGTC-3′

PCR扩增体系(Takara公司)：缓冲液10μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，模板CDNA 1μL，5U/μL Taq酶0.2μL，双蒸水6.8μL。

PCR扩增条件：98℃×3min→(98℃×30sec→55℃×30sec→72℃×30sec)×35循环→72℃×10min，得到特异PCR扩增产物见图1。

3)pMD19-LsECP1克隆载体构建及基因碱基解析

将特异PCR扩增产物通过克隆入Takara公司pMD19-T载体获得pMD19-LsECP1载体，并通过热击法转入TG1大肠杆菌，将含pMD19-LsECP1载体的TG1菌液送南京金斯瑞公司测序。用NCBI Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列比对分析，获得序列表中的序列SEQ ID No.1。将此cDNA的基因命名为LsECP1。根据该序列的开放阅读框(ORF)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。

实施例2灰飞虱LsECP1 dsRNA合成及其RNAi效果

以实施例1中构建的pMD19-LsECP1载体为模板，设计带T7启动子的引物dsLsECP1-T7-F，dsLsECP1-T7-R和dsGFP-T7-F、dsGFP-T7-R，PCR扩增LsECP1基因497bp片段和GFP基因657bp片段，以这两片段为模板合成与纯化LsECP1 dsRNA和GFP dsRNA。分别对灰飞虱注射LsECP1 dsRNA和GFP dsRNA进行RNAi。首先检测灰飞虱注射dsRNA后，对其体内LsECP1基因表达水平的影响。

具体步骤为：

1)从实施例1中构建的pMD19-LsECP1克隆载体中以聚合酶链式反应(PCR)获得LsECP1中间497bp片段，并继续合成LsECP1 dsRNA片段。同时以GFP质粒(浙江大学赠送)为模板，PCR获得GFP中间657bp片段，并继续合成GFP dsRNA片段：

dsLsECP1-T7-F(SEQ ID No.5)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGACTGCGGTTGTCAGTTTGG-3’

dsLsECP1-T7-R(SEQ ID No.6)：

5’-TAATACGACTCACTATAGAGTCAATGTTGAGTTTGCTGTG-3’

dsGFP-T7-F(SEQ ID No.7)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG-3’

dsGFP-T7-R(SEQ ID No.8)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGCAGCAGGACCATGTGATCGCGC-3’

PCR扩增体系(Takara公司购买试剂盒)与实施例1相同。

PCR扩增条件：LsECP1：98℃×3min→(98℃×30sec→55℃×30sec→72℃×30sec)×35循环→72℃×10min

GFP：98℃×3min→(98℃×30sec→55℃×30sec→72℃×40sec)×35循环→72℃×10min。

2)对上述PCR产物进行割胶回收，并以回收产物为模板，用MEGA Script kit(Ambion，Austin，USA)试剂盒合成目的基因LsECP1和GFP的dsRNA。

3)利用TransferMan NK2型显微注射仪(eppendorf，Germany)对灰飞虱(南京地区)进行目的基因dsRNA的显微注射操作。注射部位一般选在灰飞虱腹面前胸和中胸节间膜，每头飞虱注射10nl dsRNA(1ug/μl)，注射后先移入人工气候箱内新鲜水稻苗上恢复1天，随后接到处于分蘖期寄主水稻上生测。

4)吸取灰飞虱3龄若虫进行LsECP1基因dsRNA注射，并转接到水稻上取食，分别在注射后第2、4、8天，每处理随机取10头灰飞虱样品，抽取总RNA，然后反转录成cDNA第一链。结合下面定量引物，检测注射LsECP1 dsRNA对灰飞虱LsECP1基因表达水平的影响。

LsECP1定量引物：

LsECP1-F(SEQ ID No.9)：5’-CACAGCAAACTCAACATTGACT-3’

LsECP1-R(SEQ ID No.10)：5’-CTGGACAAACAAATTAAGGTGAAT-3’

内参elongation factor定量引物：

elongation factor-F(SEQ ID No.11)：5’-GTCTCCACGGATGGGCTTT-3’

elongation factor-R(SEQ ID No.12)：5’-ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT-3’

5)按照上述注射方法给同一批次发育一致的灰飞虱3龄若虫进行dsRNA注射。同一组实验分别设2种处理：注射10nl LsECP1 dsRNA(1μg/μl)的dsLsECP1和注射10nl GFPdsRNA(1μg/μl)的dsGFP对照。灰飞虱注射后先恢复24h，健康的再接到处于分蘖期的水稻上生测。连续生测6天，每24h观察一次，及时将死亡个体移出，计算存活率。每处理设5次重复，每重复注射15头若虫。

6)按照上述注射方法给同一批次发育一致的灰飞虱5龄末期若虫进行dsRNA注射。同一组实验分别设2种处理：注射10nl LsECP1 dsRNA(1μg/μl)的dsLsECP1和注射10nl GFPdsRNA(1μg/μl)的dsGFP对照。在玻璃罩内接入1头初羽化的注射过的灰飞虱雌虫以及2头未经任何处理的初羽化雄虫，进行配对，7天后去除所有灰飞虱，统计每株苗上的产卵量。

结果发现，利用注射dsRNA的方法的确可以诱导灰飞虱靶基因沉默，使靶基因表达持续被抑制(图2)。我们还测定了注射LsECP1 dsRNA的灰飞虱在水稻上的存活和繁殖力，结果表明，与注射GFP dsRNA相比，LsECP1基因沉默后的灰飞虱存活率和单雌产卵量显著降低(图3和4)。

实施例3、表达LsECP1 dsRNA的转基因水稻品系的获得及其对灰飞虱抗性的检测

转基因LsECP1 dsRNA水稻抗虫功能研究：构建含LsECP1基因的水稻遗传转化载体，构建的表达载体以电击法转化农杆菌，获得含有表达载体的工程农杆菌，以本实验室成熟的农杆菌转基因方法侵染水稻愈伤，愈伤经抗性筛选后获得整合了目的基因的愈伤组织，再经分化培养基和生根培养基中培养，获得表达LsECP1基因dsRNA的转基因水稻。对水稻植株进行观察未发现植株生理缺陷，能获得正常世代。

1、以实施例1中构建的pMD19-LsECP1克隆载体为模板，用设计带酶切位点的引物PCR扩增出和注射LsECP1 dsRNA序列相同的497bp LsECP1基因片段。

PCR扩增引物：

正F：TCGTCGACGACTGCGGTTGTCAGTTTGG

正R：ATGGTACCAGTCAATGTTGAGTTTGCTGTG

反F：ATCCCGGGGACTGCGGTTGTCAGTTTGG

反R：GCTCTAGAAGTCAATGTTGAGTTTGCTGTGPCR扩增体系和扩增条件与实施例2步骤1)相同。

2、以DNA亚克隆方法将LsECP1基因片段正向和反向同时插入到pMECE载体(浙江大学赠送)中，获得含正反向连入LsECP1基因片段的RNAi表达载体pMECE-LsECP1(图5)。

3、将pMECE-LsECP1以电击法转入农杆菌EHA105，获得农杆菌工程细胞系。以农杆菌转染法侵染水稻愈伤组织，共侵染水稻愈伤在含有潮霉素的NBDS1培养基[NBD(NB+2mg/L2，4-D+500mg/L GLu+500mg/L Pro+300mg/L Casein+30g/lSucrose+3g/lPhytagel)+3g/LPhytagel+Cef200mg/L+Hyg30mg/L，pH＝5.8]上培养，第1次筛选20天。当新的抗性愈伤长出后，将抗性愈伤从母体上剥离，转入新的筛选培养基NBDS2(NBD+3g/LPhytagel+Cef150mg/L+Hyg50mg/L，pH＝5.8)，一个抗性愈伤即为一个株系。抗性愈伤经继代扩繁后，在预分化培养基MS-PG(MS+2mg/L BA+5mg/L ABA+1mg/L NAA+30g/L Sucrose+10-20g/LSorbitol+3g/L Phytogel，pH5.8)上，26-28℃、避光，培养7-10天；然后，转入分化培养基MS-RG(MS+2-3mg/L BA+0.1-0.5mg/L NAA+3g/L Phytogel，pH5.8)，16h光照、26-28℃培养2-3周，愈伤先转绿后分化出T₀代植株。

4、T₀代转基因植株获得的T₁代种子，去除未含有LsECP1的植株，并单株种植。收获T₂代种子，对每个单株的种子进行鉴定。获得转LsECP1基因的纯合品系irLsECP1-2、irLsECP1-7，用于后面的生物学功能分析。

5、转基因品系irLsECP1-2、irLsECP1-7和非转基因水稻都进行灰飞虱为害试验，比较灰飞虱取食转基因水稻后，其体内LsECP1基因表达水平、存活率、单雌存活率等指标，并比较转基因品系irLsECP1-2、irLsECP1-7和非转基因水稻对灰飞虱耐害能力方面的差异，从而分析LsECP1在抗灰飞虱中的重要作用。

生物测定试验表明，与取食对照的非转基因水稻相比，灰飞虱取食表达LsECP1dsRNA的转基因水稻后，LsECP1基因的表达水平显著降低(图6)，灰飞虱存活率明显降低(图7)，产卵量也显著下降(图8)。耐虫性实验表明，接灰飞虱为害30天后，作为对照的非转基因水稻基本枯死，而表达LsECP1 dsRNA的转基因水稻品系irLsECP1-2和irLsECP1-7仅外面的叶片略微枯黄(图9)，其余叶片均为正常绿色。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种灰飞虱基因LsECP1及其编码产物与应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 881

<212> DNA

<213> 灰飞虱基因(LsECP1)

<400> 1

aacaacttga ggttttgtat aaaatgagaa gcgggcttag agtgaagtta tcagagtaag 60

tccttcagtg agaagatcac ctctcaaagg atcgtcctca ttggctttca tacagtcagt 120

gtattttcgt cagccgagaa atgatgcgac cattgttgtt gactgcggtt gtcagtttgg 180

cgtgttttgg attttctgga gcggcgaaag atttcaagga tgaaaacaac aattatattc 240

atgtttacga cttcaatata acaaggtcac tcaaggctgc agaagcggct gctggagccg 300

acaatattat tgacaggaat gagtacattg aatttagtaa aataatgttg ccatcctatg 360

cccctgcagc agcggagatg ccaatagagg agatgcatgg tctgttcaat ttaatggatg 420

ttgatcaaaa caatgaactg agtatcaagg agtacgttct aggcgctctt caataccagg 480

aattcaacta ctatgacaca aatcctaaag acaatcttct aagtgacgat gaattaatga 540

aaatgtttga tactccagat aaagtgaatg gacaacaata ctatagttat tcaggacatg 600

cttcttttgt tgaattctac caccgcttcc ttgcacacag caaactcaac attgactggc 660

agagcactct gggattgaga cgtttaacta ctcaatagaa aaactgtata aaaaatataa 720

aattgtggaa tcatagactg atggtgattt tggtgatgga ttggaattca ccttaatttg 780

tttgtccaga tgtaatttag ttgttacact gtaatttaat tatttttctg gttttgggta 840

aataaagtgt gtgtgtttgt tgcatgatca tcaaaaaaaa a 881

<210> 2

<211> 185

<212> PRT

<213> 灰飞虱基因LsECP1的编码蛋白(LsECP1)

<400> 2

Met Met Arg Pro Leu Leu Leu Thr Ala Val Val Ser Leu Ala Cys Phe

1 5 10 15

Gly Phe Ser Gly Ala Ala Lys Asp Phe Lys Asp Glu Asn Asn Asn Tyr

20 25 30

Ile His Val Tyr Asp Phe Asn Ile Thr Arg Ser Leu Lys Ala Ala Glu

35 40 45

Ala Ala Ala Gly Ala Asp Asn Ile Ile Asp Arg Asn Glu Tyr Ile Glu

50 55 60

Phe Ser Lys Ile Met Leu Pro Ser Tyr Ala Pro Ala Ala Ala Glu Met

65 70 75 80

Pro Ile Glu Glu Met His Gly Leu Phe Asn Leu Met Asp Val Asp Gln

85 90 95

Asn Asn Glu Leu Ser Ile Lys Glu Tyr Val Leu Gly Ala Leu Gln Tyr

100 105 110

Gln Glu Phe Asn Tyr Tyr Asp Thr Asn Pro Lys Asp Asn Leu Leu Ser

115 120 125

Asp Asp Glu Leu Met Lys Met Phe Asp Thr Pro Asp Lys Val Asn Gly

130 135 140

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Gly His Ala Ser Phe Val Glu Phe Tyr

145 150 155 160

His Arg Phe Leu Ala His Ser Lys Leu Asn Ile Asp Trp Gln Ser Thr

165 170 175

Leu Gly Leu Arg Arg Leu Thr Thr Gln

180 185

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcattggct ttcatacagt cag 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttctattgag tagttaaacg tc 22

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> dsLsECP1-T7-F(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactatagga ctgcggttgt cagtttgg 38

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> dsLsECP1-T7-R(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactatagag tcaatgttga gtttgctgtg 40

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> dsGFP-T7-F(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactatagga agggcgagga gctgttcacc g 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> dsGFP-T7-R(Artificial Sequence)

<400> 8

taatacgact cactataggc agcaggacca tgtgatcgcg c 41

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> LsECP1 -F(Artificial Sequence)

<400> 9

cacagcaaac tcaacattga ct 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> LsECP1 -R(Artificial Sequence)

<400> 10

ctggacaaac aaattaaggt gaat 24

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> elongation factor -F(Artificial Sequence)

<400> 11

gtctccacgg atgggcttt 19

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> elongation factor -R(Artificial Sequence)

<400> 12

atcttgaatt tctcggcata cattt 25

Claims

1.一种灰飞虱基因LsECP1，其LsECP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的灰飞虱基因LsECP1编码的蛋白，其蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2 所示。

3.表达盒，其含有权利要求1所述的灰飞虱基因LsECP1。

4.重组载体，其含有权利要求1所述的灰飞虱基因LsECP1。

5.细胞，其含有权利要求1所述的灰飞虱基因LsECP1。

6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pMECE-LsECP1。

7.权利要求1所述的灰飞虱基因LsECP1在获得抗虫功能的植物中的应用。

8.权利要求2所述的蛋白在获得抗虫功能的植物中的应用。

9.权利要求3所述的表达盒在获得抗虫功能的植物中的应用。

10.权利要求4所述的重组载体在获得抗虫功能的植物中的应用。

11.权利要求5所述的细胞在获得抗虫功能的植物中的应用。

12.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。

13.获得具有抗虫功能的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）使植物包含权利要求1所述的基因；或

2）使植物表达权利要求2所述的蛋白。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤。

15.鉴定获得具有抗虫功能的植物的方法，其中植物是包含权利要求1所述的基因的植物、表达权利要求2所述的蛋白的植物或权利要求13~14之任一所述的方法获得的植物，其特征在于，包括以下步骤：

1) 测定所述植物是否包含权利要求1所述的基因；或，

2) 测定所述植物是否表达权利要求2所述的蛋白。