CN113248586B - 褐飞虱pib14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用 - Google Patents
褐飞虱pib14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113248586B CN113248586B CN202110444115.XA CN202110444115A CN113248586B CN 113248586 B CN113248586 B CN 113248586B CN 202110444115 A CN202110444115 A CN 202110444115A CN 113248586 B CN113248586 B CN 113248586B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- brown planthopper
- pib14
- protein
- gene
- coding gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001556089 Nilaparvata lugens Species 0.000 title claims abstract description 140
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 27
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims description 25
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 25
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 24
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 13
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 12
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 6
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N Asn-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 2
- XWKPSMRPIKKDDU-RCOVLWMOSA-N Asp-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O XWKPSMRPIKKDDU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- 101100048230 Caenorhabditis elegans ubq-1 gene Proteins 0.000 description 2
- DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N Cys-Gly-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- BEXGZLUHRXTZCC-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N BEXGZLUHRXTZCC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KXOPYFNQLVUOAQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXOPYFNQLVUOAQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N Arg-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N Asn-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RRVBEKYEFMCDIF-WHFBIAKZSA-N Asn-Cys-Gly Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)O)N)C(=O)N RRVBEKYEFMCDIF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000254123 Bemisia Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 241001498622 Cixius wagneri Species 0.000 description 1
- YZFCGHIBLBDZDA-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YZFCGHIBLBDZDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- ORYMMTRPKVTGSJ-XVKPBYJWSA-N Gln-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ORYMMTRPKVTGSJ-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- JILRMFFFCHUUTJ-ACZMJKKPSA-N Gln-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JILRMFFFCHUUTJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RBXSZQRSEGYDFG-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RBXSZQRSEGYDFG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZQYZDDXTNQXUJH-CIUDSAMLSA-N Glu-Met-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZQYZDDXTNQXUJH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WXONSNSSBYQGNN-AVGNSLFASA-N Glu-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O WXONSNSSBYQGNN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KMSGYZQRXPUKGI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KMSGYZQRXPUKGI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Cys Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N Gly-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N Gly-Met-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- NWOSHVVPKDQKKT-RYUDHWBXSA-N Gly-Tyr-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NWOSHVVPKDQKKT-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N Gly-Val-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- ZYVTXBXHIKGZMD-QSFUFRPTSA-N Ile-Val-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ZYVTXBXHIKGZMD-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 244000118056 Oryza rufipogon Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YQQKYAZABFEYAF-FXQIFTODSA-N Ser-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YQQKYAZABFEYAF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N Ser-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- DXUVJJRTVACXSO-KKUMJFAQSA-N Tyr-Gln-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N DXUVJJRTVACXSO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N Val-Asn-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N Val-Gly-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FXVDGDZRYLFQKY-WPRPVWTQSA-N Val-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C FXVDGDZRYLFQKY-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- OWZREIFADZCYQD-UHFFFAOYSA-N [cyano-(3-phenoxyphenyl)methyl] 3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate Chemical class CC1(C)C(C=C(Br)Br)C1C(=O)OC(C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 OWZREIFADZCYQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- ZOMSMJKLGFBRBS-UHFFFAOYSA-N bentazone Chemical compound C1=CC=C2NS(=O)(=O)N(C(C)C)C(=O)C2=C1 ZOMSMJKLGFBRBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000032669 eclosion Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004416 odontoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
- A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
- A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及褐飞虱PIB14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用。本发明发现了褐飞虱PIB14蛋白及其编码基因的序列，该基因对于调控植物对于褐飞虱的抗性，以及调控褐飞虱的生长具有重要意义。通过抑制褐飞虱中PIB14基因的表达可以有效降低褐飞虱的生存能力，通过在植物中过表达PIB14基因可以有效提高植物对于褐飞虱的抗性，本发明发现的褐飞虱PIB14蛋白及其编码基因具有很好的应用前景，对降低农药使用，维持生态平衡及可持续发展有着重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及褐飞虱PIB14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用。
背景技术
褐飞虱(BPH；Nilaparvata lugens Stal.)，属同翅目飞虱科(Homoptera；Delphacidae)，是水稻上的主要害虫之一。褐飞虱有远距离迁飞习性，是单食性害虫，只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代。褐飞虱的刺吸式口器可以刺入植物体内，吸食韧皮部汁液。褐飞虱不仅仅只取食韧皮部汁液，造成直接损伤，而且褐飞虱是草状丛矮病和齿叶矮缩病传播的媒介，从而引起间接损伤。褐飞虱取食分蘖期之前的水稻，会引起水稻穗数和谷粒数的减少；褐飞虱取食成熟期的水稻，会引起成熟谷粒的数目减少，重量减轻。水稻被褐飞虱危害严重时，会造成水稻大面积死亡，出现“飞虱火烧”的现象，从而颗粒无收。褐飞虱每年大约造成10到15亿公斤的水稻产量减少，相当于数十亿元的经济损失。目前一般使用杀虫剂来控制褐飞虱，但是随着杀虫剂的大量使用，已经引起褐飞虱产生了抗药性，比如灭必虱，卡巴呋喃，扑灭松，甚至合成的除虫菊酯(Nagata,1982；Lakshmi et al.,2010)。并且喷洒农药，不仅对人畜有害，还造成在严重的环境污染。因此，积极开展褐飞虱生物防治技术的研究及应用，对褐飞虱的危害实施科学有效控制，以及保障粮食安全和环境安全具有重要意义。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA介导的诱发同源mRNA高效特异性降解的现象。从发现以来，迅速发展，成为基因功能研究的一个有效工具，目前也在昆虫基因研究中广泛应用。使用显微注射仪将体外合成的dsRNA注射到昆虫的特定部位的方法称为显微注射法。显微注射法是目前应用最普遍的导入方法之一(Ober and Jockusch,2006)。显微注射法有以下优点，注射量可精确控制，可特定的观察特定基因表达量降低后对单头褐飞虱的影响，对基因功能的理论研究有着很大的帮助，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供褐飞虱PIB14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用。
第一方面，本发明提供褐飞虱PIB14蛋白或其编码基因或褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的抑制因子在调控植物抗褐飞虱中的应用。
进一步地，所述调控植物抗褐飞虱为提高植物对褐飞虱的抗性，或抑制褐飞虱生长。
进一步地，所述提高植物对褐飞虱的抗性为：
在所述植物中过表达所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因。
进一步地，所述抑制褐飞虱生长为：
抑制褐飞虱中PIB14蛋白的编码基因的表达。
进一步地，所述褐飞虱PIB14蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的抑制因子包括能够抑制褐飞虱PIB14蛋白的编码基因表达的gRNA或dsRNA；
所述dsRNA优选包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一种用于抑制褐飞虱PIB14蛋白的编码基因表达的dsRNA，
所述dsRNA包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因优选包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞；所述生物材料包括褐飞虱PIB14蛋白的编码基因，或所述的dsRNA；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种提高植物抗褐飞虱能力的方法，包括：
在所述植物中过表达褐飞虱PIB14蛋白的编码基因；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
第五方面，本发明提供一种抑制褐飞虱生长的方法，包括：
抑制褐飞虱中褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的表达；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
优选地，通过dsRNA抑制褐飞虱中褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的表达；
所述dsRNA包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
本发明具备如下有益效果：
1、本发明首次公开褐飞虱PIB14基因核苷酸序列，目前关于抑制其表达可显著影响褐飞虱生长发育的功能未见相关报道。
2、本发明根据褐飞虱PIB14基因的cDNA序列，采用显微注射dsRNA的RNAi技术，沉默褐飞虱PIB14基因，导致褐飞虱产生致死效应，随着时间的延长，存活率越来越低；显然该基因的dsRNA及其对应的表达盒、重组载体或重组菌等产品在褐飞虱防治领域有着重要的应用价值。
3、本发明构建了一种针对褐飞虱PIB14基因的过表达遗传转化载体，实验证明，将该载体转入褐飞虱寄主水稻植株中，水稻抗褐飞虱性能大大提高，褐飞虱取食该转基因材料之后，褐飞虱的虫增重和存活率降低，说明该载体对提高褐飞虱抗性有着重要作用。本发明对培育抗虫植株具有重要意义，有着很好的应用前景，对降低农药使用，维持生态平衡及可持续发展有着重大的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的PIB14基因的克隆结果；其中，第一泳道为Marker，第二泳道为PIB14 ORF；第三泳道代表去掉信号肽之后的PIB14 ORF序列。
图2为本发明实施例2提供的dsPIB14和dsGFP的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明实施例3提供的显微注射后PIB14基因相对表达量分析结果；其中，CK为未注射的褐飞虱，dsGFP为注射dsGFP的褐飞虱，1-10为注射dsPIB14不同天数的褐飞虱；不同小写字母表示P<0.05，达显著差异。
图4为本发明实施例4提供的显微注射后褐飞虱存活率和虫增重分析结果；其中，A为显微注射后将褐飞虱放在水稻上，每天统计褐飞虱的存活率的结果，B为注射后的褐飞虱，待其羽化为成虫，称取雌虫在两天内的虫增重结果。
图5为本发明实施例6提供的褐飞虱取食对照RI35和RI35PIB14植株表型分析结果；其中，A为野生型RI35和RI35PIB14植株中PIB14表达量分析结果，B为PIB14过表达转基因T2代阳性株系抗褐飞虱苗期鉴定结果，C为褐飞虱取食转基因植株亲本RI35以及RI35PIB14转基因植株两天后的虫增重分析结果，D为褐飞虱取食转基因植株亲本RI35以及RI35PIB14转基因植株后，十天内的褐飞虱存活率分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1褐飞虱PIB14基因的克隆
取20头生物型1褐飞虱，提取总RNA，并反转为cDNA。通过该序列设计引物，使用TaKaRa公司5’与3’RACE试剂盒，获得了该候选基因5’末端及3’末端序列，确定了候选基因的转录起始位点及终止位点，并拼接出该基因的全长cDNA序列。根据全长cDNA序列重新合成引物PIB14-F，PIB14-R，扩增获得PIB14的全长cDNA，预测ORF，其ORF序列如序列表SEQ IDNO.1所示(图1)。
PIB14-F：5’-ACATGGGGCTCATTTCTCCAAGCAT-3’
PIB14-R：5’-GTATTTATTTATTAAAAACACAAG-3’
实施例2用于沉默褐飞虱PIB14基因的dsRNA(dsPIB14)以及用于对照的绿色荧光蛋白GFP基因dsGFP的制备
1、以实施例1得到的cDNA为模板，用PI-F，PI-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PI-F(正向引物):5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAGTCCTCCGAACAGGAATCGTACAG-3’
PI-R(反向引物)：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCTCCACAGTTTCCTCCACAGTTTCCTC-3’。
下划线标注的区域为T7 RNA聚合酶启动子序列。
2、以含GFP的质粒为模板，用dsGFP-F，dsGFP-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
dsGFP-F(正向引物)：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGGACT-3’
dsGFP-R(反向引物)：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGATGC-3’
下划线标注的区域为T7 RNA聚合酶启动子序列。
3、将扩增产物，回收，加A，连pMD18-T(TAKARA)载体，阳性克隆送测序。得到正确的克隆，以该克隆质粒为模板，同样用上述引物扩增，扩增产物纯化，浓缩，使其浓度为1μg/μL，该产物为dsRNA合成的模板。
4、按以下比例加入Transcription buffer 10μL，ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)各1μL，RNA酶抑制剂1.25μL，T7 RNA Polymerase 1μL，模板1.5μg，DEPC H2O定容至49μL。轻弹混匀，瞬时离心。放入PCR中，程序为37℃，4h；75℃，5min；16℃保存。吸出1μL，凝胶电泳检测，检测到目的条带后继续下一步操作。
5、10×Reaction buffer 6μL，DNaseI2μL，RNase 0.5μL，DEPC H2O 1.5μL，充分混匀，瞬时离心，放入PCR仪中37℃，30min。之后取出加入EDTA(Fementas)1μL，继续放回PCR仪中65℃，5min终止反应。吸出1μL，稀释10倍，2μL凝胶电泳检测，2μL用NANOdrop紫外分光光度计检测浓度。如果检测条带是很单一明亮的条带，如图2所示，且OD260/280在1.8-2.0之间，则说明dsRNA质量良好，可以进行下一步：RNA酚氯仿抽提。
6、常规酚氯仿抽提，去除蛋白质，根据浓度将dsRNA调到5μg/μL，每管10μL分装好，放入-80℃保存。
实施例3 dsPIB14和dsGFP的显微注射及效果检测
1、褐飞虱准备：取30头雌虫，10头雄虫于有TN1苗子的杯子中，24h后，取出成虫。待孵化，20d后为四龄若虫，注射使用。
2、平板准备：称取1.5g的琼脂粉加入到100ml水中，煮沸，倒入玻璃平皿中，待其凝固备用。
3、注射：取长势相似的虫子5-8头于试管中，通入CO2麻醉20s。再将虫子倒于1.5％的琼脂粉平板上，腹部朝上。用Nanoliter2010显微注射仪依照说明书进行注射。注射位置在前中胸之间。注射量为46nl(5μg/μL)。
4、褐飞虱注射dsRNA后，从注射后第一天开始取样，每天取样三头，取样十天，同时取没有注射的以及注射dsGFP的褐飞虱作为对照，用qRT-PCR验证基因表达量变化。
具体操作如下：取样后，提RNA，用TAKARA的PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser(货号RR047A)按照说明书进行反转，得反转产物。将反转得到的cDNA取5μL，用TE稀释10倍，按以下操作进行实时定量PCR。PCR反应在CFX96 TouchTM Real-Time PCRDetection System(Bio-Rad)仪器上进行，遵循以下反应体系：DNase/RNase-Free ddH2O2.9μL，2×Supermix 4μL，Primers(5mM)0.6μL，cDNA模板0.5μL。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性5-10s，TM(55-65℃)退火延伸30s，重复后两步骤40个循环，最后65℃-95℃，每步增加0.5℃，5s做溶解曲线以确定扩增产物的特异性。
首先对不同引物做55-65℃梯度PCR确定最适退火延伸温度(起峰早，溶解曲线特异)，取PCR产物稀释106后作为第一个梯度，然后再10倍稀释3个梯度，通常以这四个模板作标准曲线来筛选扩增效率高的引物作为基因的定量引物。每一个样品做3个技术重复，每一板PCR都做扩增效率。结果采用Bio-Rad CFX Manager来分析，首先分析其溶解曲线，QC(质控)等，去除不合格数据，基因表达分析用软件自带Gene Study功能为(1+E)-ΔΔCt算法分析。
内参基因actin引物：
Actin-F：5’-GACAGGATGCAGAAGGAAATCA-3’
Actin-R：5’-GACTCGTCGTACTCCTGCTTTG-3’
PIB14定量引物：
QPI-1F：5’-GTTAGAAATACTCCACCATCA-3’
QPI-1R：5’-GAGAGGCGAATCTTCAAG-3’
5、结果附图3所示，显微注射dsPIB14的实验组，与未注射的褐飞虱以及注射dsGFP的对照组相比，从注射第一天起，褐飞虱体内PIB14基因的相对表达量显著降低，达10％以下，与对照相比有极显著差异(P<0.01)。结果表明，通过显微注射dsPIB14能够引起褐飞虱体内唾液腺分泌基因PIB14的RNAi效应，导致基因表达量明显降低。
实施例4显微注射后褐飞虱表型检测
褐飞虱存活率实验：褐飞虱分三组，未注射，注射dsGFP，注射dsPIB14，注射后待其复苏，放回水稻上。每次做十头虫，重复5次。结果如图4中的A所示，注射dsPIB14后褐飞虱的存活率从注射第三天开始一直显著性低于注射dsGFP和未注射的褐飞虱。
褐飞虱虫增重实验：褐飞虱注射后放回水稻上，待其羽化，将第一天羽化的褐飞虱，单头称重，然后放入绑在水稻苗子上的蜡袋中，两天后，取下存活的褐飞虱，再次称重，两次重量之差，记为虫增重。每次做十头虫，重复5次。如图4中的B所示，对刚羽化褐飞虱在48h内的虫增重进行分析，发现注射dsPIB14以后，虫增重有所降低。结果表明，注射dsPIB14后，由于该基因的表达量降低，导致褐飞虱取食受到影响，进而影响褐飞虱的存活率。
实施例5褐飞虱PIB14基因过表达遗传转化载体的构建
1、ORF序列扩增(去掉信号肽区段)：用高保真酶KOD Plus Neo(TOYOBO)，及引物PIB14-SP-F和PIB14-SP-R，模板为含有PIB14基因的质粒，扩增PIB14基因的ORF序列。
PIB14-SP-F：5’-ATGTATCACAGCAAAGTGGGTTTG-3’
PIB14-SP-R：5’-AATACAAACACGAGCGCTAACTCTGGCACC-3’
2、PCR完成后，取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。条带单一，直接回收；有杂带，切胶回收目的大小的片段，大约为0.7kb，由于KOD PLUS NEU扩增片段末端没有A尾巴，故需加A后连接载体。
3、PCXUN载体用Xcm I酶切回收，可形成T末端，与上述加A产物16℃连接过夜。转化，挑单克隆，载体引物为UBIS和UBIA,PCR验证插入片段大小，大小为1kb左右的片段送公司测序。
UBIS：5’-TGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC-3’
UBIA：5’-TTCTATCGCGGCTTAACGTAATTCA-3’
4、将测序正确的载体质粒通过常规电转方法转入农杆菌菌株EHA105。
实施例6PIB14过表达后的转基因功能验证
1、农杆菌介导的PIB14过表达转基因植株获得
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6:271-282)将上述PIB14过表达遗传转化载体导入Bph14基因的重组自交系RI35中，最后获得阳性植株23株。
2、褐飞虱取食RI35PIB14转基因植株后表型验证
收获种子后，对T2代纯合转基因植株RI35PIB14-10、RI35PIB14-37中PIB14基因的表达进行定量PCR检测，引物为QPI-2F，QPI-2R，内参为Osactin，引物为Osactin-F，Osactin-R。结果如图5中的A所示，PIB14基因在转基因植株体内大量积累。
QPIB14-2F：5’-GTGTGGGAATGTCATCTG-3’
QPIB14-2R：5’-GCTGCTGTAATCACTATCA-3’
Osactin-F：5’-GATCACTGCCTTGGCTCCTA-3’
Osactin-R：5’-GTACTCAGCCTTGGCAATCC-3’
采用苗期集团法对阳性转基因株系进行了抗褐飞虱鉴定。接入褐飞虱10天后，对照品种RI35整株死亡，PIB14的过表达载体转基因阳性株系生长健康，无叶片受害，说明PIB14基因具有增强水稻抗褐飞虱的功能(图5中的B)。因此，褐飞虱基因PIB14可以在水稻中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。
生物型I的二龄褐飞虱20头分别取食WT(RI35)和RI35PIB14-37，按天数虫子的存活率，重复五次。结果如图5中的C所示，由于转基因植株RI35PIB14-37抗性提高，影响了褐飞虱的取食，使其在第5天到第10天的存活率显著降低。
生物型I的刚羽化的褐飞虱雌成虫分别饲养于WT(RI35)和RI35PIB14-37上，两天后，称其虫重，每次10头。三次重复。结果如图5中的D所示，褐飞虱的虫重也显著性降低。这些都说明PIB14能够提高水稻对褐飞虱的抗性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉大学 袁隆平农业高科技股份有限公司 武汉禾泰青生物科技有限公司
<120> 褐飞虱PIB14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用
<130> KHP211113287.6
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Tyr His Ser Lys Val Gly Leu Leu Ala Val Ala Leu Val Met Gln
1 5 10 15
Ala Ile Leu Leu Cys Gly Cys Asp Ala Ser Ala Met Arg Tyr Ala Ser
20 25 30
Gly Phe Gln Asn Asn Glu Arg Gln Ser Ser Glu Gln Glu Ser Tyr Ser
35 40 45
Arg Ser Ala Gln Ser Ser Glu Lys Ser Ser Ser Gly Tyr Gln Met Gly
50 55 60
Glu Met Ala Ser Ala Gly Val Gly Met Ser Ser Gly Tyr Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Gln Gln Gly Val Gly Tyr Ser Gly
85 90 95
Cys Asp Ser Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Gly Gly Ile Val Asn Thr
100 105 110
Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ser Val Thr Gly Met Ala Gly Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Leu Ala Asp Val Gly Gly Val Val Asn Thr Val Ser
130 135 140
Gly Leu Ala Asp Val Gly Gly Leu Thr Asn Thr Val Ser Gly Leu Ala
145 150 155 160
Asp Val Gly Gly Val Thr Asn Thr Val Gly Gly Leu Val Asn Gly Ile
165 170 175
Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly
180 185 190
Gly Asp Gly Gly Cys Gly Gly Asn Cys Gly Gly Asn Cys Gly Gly Asn
195 200 205
Cys Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Ile Leu
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Gly Ala Arg Val Ser Ala Arg Val
225 230 235 240
Cys
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtatcaca gcaaagtggg tttgcttgcc gtagcgcttg ttatgcaggc aatcctgcta 60
tgcggctgcg atgcttccgc gatgaggtat gcttccggtt tccaaaacaa cgagagacag 120
tcctccgaac aggaatcgta cagcagatct gctcaatcaa gtgagaagag cagctcagga 180
taccaaatgg gtgaaatggc ctctgctggt gtgggaatgt catctggtta tggcggaagc 240
ggttacagta gtggaggtgg ataccaacaa ggagtaggtt acagtggatg tgatagtgat 300
tacagcagcg ggggaatcgg gggcattgtc aacacagcta cgggtcttgc tagttccgtc 360
accggtatgg ccggcggttt gggtggtggc ggcggtttag ccgatgttgg aggtgtagtg 420
aataccgtca gcggtttagc cgatgttgga ggtttaacga ataccgtcag cggtttagcc 480
gatgttggag gtgtaacgaa taccgtcggc ggtttggtca atggcatcgc tggaggcgga 540
gccggtggcg gtcttttggg aggagttttg ggaggcggtg atggaggctg tggaggaaac 600
tgtggaggaa actgtggagg aaactgtggt ggacgcggag gtggaggcgg tggccttttg 660
ggaggtattc ttgggggcgg gagcgggggc ggcagaggtg ccagagttag cgctcgtgtt 720
tgttaa 726
<210> 3
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtcctccg aacaggaatc gtacagcaga tctgctcaat caagtgagaa gagcagctca 60
ggataccaaa tgggtgaaat ggcctctgct ggtgtgggaa tgtcatctgg ttatggcgga 120
agcggttaca gtagtggagg tggataccaa caaggagtag gttacagtgg atgtgatagt 180
gattacagca gcgggggaat cgggggcatt gtcaacacag ctacgggtct tgctagttcc 240
gtcaccggta tggccggcgg tttgggtggt ggcggcggtt tagccgatgt tggaggtgta 300
gtgaataccg tcagcggttt agccgatgtt ggaggtttaa cgaataccgt cagcggttta 360
gccgatgttg gaggtgtaac gaataccgtc ggcggtttgg tcaatggcat cgctggaggc 420
ggagccggtg gcggtctttt gggaggagtt ttgggaggcg gtgatggagg ctgtggagga 480
aactgtggag ga 492
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acatggggct catttctcca agcat 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtatttattt attaaaaaca caag 24
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg agacagtcct ccgaacagga atcgtacag 49
<210> 7
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatacgact cactataggg agatcctcca cagtttcctc cacagtttcc tc 52
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taatacgact cactataggg cggact 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taatacgact cactataggg cgatgc 26
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacaggatgc agaaggaaat ca 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gactcgtcgt actcctgctt tg 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttagaaata ctccaccatc a 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagaggcgaa tcttcaag 18
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgtatcaca gcaaagtggg tttg 24
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aatacaaaca cgagcgctaa ctctggcacc 30
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtttctttt gtcgatgctc accc 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttctatcgcg gcttaacgta attca 25
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgtgggaat gtcatctg 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gctgctgtaa tcactatca 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gatcactgcc ttggctccta 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtactcagcc ttggcaatcc 20
Claims (8)
1.褐飞虱PIB14蛋白或其编码基因在提高水稻对褐飞虱的抗性中的应用；
所述褐飞虱PIB14蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
2.褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的抑制因子在抑制褐飞虱生长中的应用；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的抑制因子为能够抑制褐飞虱PIB14蛋白的编码基因表达的dsRNA，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高水稻对褐飞虱的抗性为：
在所述水稻中过表达所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制褐飞虱生长为：
抑制褐飞虱中PIB14蛋白的编码基因的表达；
所述PIB14蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种用于抑制褐飞虱PIB14蛋白的编码基因表达的dsRNA，其特征在于，
所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种提高水稻抗褐飞虱能力的方法，其特征在于，包括：
在所述水稻中过表达褐飞虱PIB14蛋白的编码基因；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种抑制褐飞虱生长的方法，其特征在于，包括：
抑制褐飞虱中褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的表达；
所述褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于通过dsRNA抑制褐飞虱中褐飞虱PIB14蛋白的编码基因的表达；
所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110444115.XA CN113248586B (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 褐飞虱pib14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110444115.XA CN113248586B (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 褐飞虱pib14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113248586A CN113248586A (zh) | 2021-08-13 |
| CN113248586B true CN113248586B (zh) | 2022-08-30 |
Family
ID=77221439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110444115.XA Active CN113248586B (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 褐飞虱pib14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113248586B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113846073B (zh) * | 2021-09-03 | 2023-03-24 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 褐飞虱NlLIPH基因及其应用 |
| CN115927351B (zh) * | 2022-07-29 | 2024-03-15 | 南京农业大学 | 褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9在诱导植物产生抗性中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104995304A (zh) * | 2013-02-05 | 2015-10-21 | 植物生物科学有限公司 | 转基因植物 |
| CN108901831A (zh) * | 2018-08-17 | 2018-11-30 | 江苏里下河地区农业科学研究所 | 抗稻瘟病强优势籼稻恢复系的选育方法 |
| CN110951748A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-03 | 武汉大学 | 水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1268528A2 (en) * | 2000-03-28 | 2003-01-02 | Chiron Corporation | Human genes and expression products |
| CN101801321B (zh) * | 2007-07-10 | 2014-07-02 | 敏捷治疗公司 | 原位密封的经皮输送装置 |
| JP2018024669A (ja) * | 2017-08-09 | 2018-02-15 | 住友化学株式会社 | 有害生物防除組成物及びその用途 |
-
2021
- 2021-04-23 CN CN202110444115.XA patent/CN113248586B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104995304A (zh) * | 2013-02-05 | 2015-10-21 | 植物生物科学有限公司 | 转基因植物 |
| CN108901831A (zh) * | 2018-08-17 | 2018-11-30 | 江苏里下河地区农业科学研究所 | 抗稻瘟病强优势籼稻恢复系的选育方法 |
| CN110951748A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-03 | 武汉大学 | 水稻抗褐飞虱基因Bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Development and characterization of japonica rice lines carrying the brown planthopper-resistance genes BPH12 and BPH6;Yongfu Qiu等;《Theoretical and Applied Genetics》;springer;20111029;第124卷;第485-495页 * |
| Nilaparvata lugens PIB14 mRNA, complete cds;Wang,H.;《GenBank DataBase》;GenBank DataBase;20200906;Accession NO：MH885414 * |
| PIB14 [Nilaparvata lugens];GenBank DataBase;《GenBank DataBase》;GenBank DataBase;20200906;Accession NO：QFZ96017 * |
| UniProtKB - A0A0A1H1G0(A0A0A1H1G0_NILLU);EMBL;《EMBL》;EMBL;20150204;accession number: A0A0A1H1G0 * |
| 水稻抗褐飞虱基因发掘与抗虫机理研究;郭建平等;《2018全国植物生物学大会论文集》;CNKI;20181018;第5页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113248586A (zh) | 2021-08-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754948B (zh) | 褐飞虱NlMLP基因、编码蛋白及其应用 | |
| CN103183732B (zh) | 一种棉花Gh FPF1蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN113248586B (zh) | 褐飞虱pib14蛋白及其编码基因在调控植物抗褐飞虱中的应用 | |
| CN108795943B (zh) | 一种植物特异表达启动子POssalt2及其应用 | |
| CN112812163B (zh) | 转录因子在水稻育种中的应用以及水稻育种的方法 | |
| CN108103076B (zh) | 一种抑制叶片衰老的黑麦草转录因子基因LpNACL及其应用 | |
| CN111826364B (zh) | 一种抗病虫害相关基因及其应用 | |
| CN111518186A (zh) | 植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用 | |
| CN109096380B (zh) | OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用 | |
| CN110862996A (zh) | 一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用 | |
| US20240043858A1 (en) | A Protein Vapbp2-L For Enhancing Drought Resistance Of Plants And Application Thereof | |
| CN114349835B (zh) | GhREM蛋白及其编码基因在调控棉花抗蚜性能中的应用 | |
| CN108456683B (zh) | 一个调控水稻抽穗期基因sid1的功能及应用 | |
| CN113564200A (zh) | 茶树CsCIPK20基因在提高植物抗寒性中的应用 | |
| CN111454987B (zh) | GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用 | |
| CN108841839B (zh) | 蛋白质TabZIP60在调控植物对氮素吸收中的应用 | |
| NL2030997B1 (en) | Zea mays receptor-like kinase 7 (zmrlk7) gene related to kernel and plant type development of maize and use thereof | |
| CN112062825B (zh) | 一种灰飞虱基因LsECP1及其编码产物与应用 | |
| CN114657209B (zh) | 蛋白rar1及其相关物质在调控植物耐逆性或培育高耐逆性植物中的应用 | |
| CN116063431B (zh) | 一种植物抗虫蛋白质及其应用 | |
| CN114644701B (zh) | 来源于玉米的蛋白及其相关生物材料的应用 | |
| CN114214334B (zh) | 来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用 | |
| CN117210490B (zh) | 一种调控苹果属植物自花结实的pchr基因及其应用 | |
| AU2021107431A4 (en) | Application of Galega orientalis gibberellin receptor gene GoGID1 for improving alfalfa biomass | |
| CN113151322B (zh) | 一种烟草淀粉合酶基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |