CN109096380B

CN109096380B - OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用

Info

Publication number: CN109096380B
Application number: CN201810972260.3A
Authority: CN
Inventors: 刘军; 李聪; 赵涛; 李宏宇; 刘斌
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2038-08-24
Also published as: CN109096380A

Abstract

本发明公开了OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用，所述OsBICs基因包括水稻基因OsBIC1、OsBIC2。它们所编码蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、4所示。本发明首次克隆获得了水稻基因OsBIC1、OsBIC2，并对其功能进行了研究，发现OsBIC1、OsBIC2在水稻光周期反应中作用明显，与拟南芥BICs特点相似，均能够延迟开花和蓝光特异性促进叶鞘的伸长。

Description

OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用。

背景技术

水稻为禾本科单子叶C3模式植物，是重要的粮食作物，占全世界粮食产量的21％。据推测，到2030年，为了满足日益增长的人口粮食需求，水稻产量需增加40％才能够满足人口需要。如何提高作物单产，已经成为育种家亟需解决的问题。因此，水稻一直是育种、遗传学、分子生物学研究的主要材料。水稻的产量构成性状复杂，开花(也叫抽穗期)和株高是农作物的两个重要的农艺性状，已成为提高水稻产量的一个极具潜力的研究方向。水稻抽穗期受到多种环境因子的影响，如日照长度(光周期)、温度、营养和水分等。光周期调控开花的分子机制已经基本被阐明，这可能是因为在季节变化过程中，日照长度比其它环境因子更容易被掌控。通过调控植株光周期反应和株高可增加水稻的适应性、抗倒伏能力，从而增加产量。研究表明，隐花色素(cryptochrome)对植物的光周期反应非常重要。

隐花色素是一种普遍存在于动物、植物、微生物中的蓝光受体，它能接受蓝光信号、诱导下游基因进行信号转导，从而引起相关的生理反应。植物中隐花色素的主要作用是参与植物的光形态建成和光周期介导的开花反应。对植物中隐花色素功能的解析主要来自对模式植物拟南芥的研究。拟南芥中有三种隐花色素：AtCRY1、AtCRY2和AtCRY3，其中AtCRY1和AtCRY2具有光解酶活性参与光信号反应，在水稻中，隐花色素也具有同样的作用，OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2分别过表达都会导致水稻叶鞘变短。最新研究表明，在拟南芥中存在两个小蛋白AtBIC1和AtBIC2，可与CRY2在蓝光条件下特异性互作，并在叶鞘和开花中与CRY2呈现相反的表型。AtBIC1和AtBIC2过表达可导致拟南芥开花延迟和蓝光特异下胚轴伸长。

发明内容

本发明的目的是提供OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供OsBICs基因在调控植物株高中的应用，所述OsBICs基因包括水稻基因OsBIC1、OsBIC2。

其中，OsBIC1基因编码的蛋白质为如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；

OsBIC2基因编码的蛋白质为如下(c)或(d)。

(c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。

水稻基因OsBIC1、OsBIC2的cDNA序列分别如SEQ ID NO:1、3所示。

前述的应用，所述调控是指使植物株高变高。所述应用包括：

1)使植物包含OsBIC1基因和/或OsBIC2基因；或者，

2)使植物过表达OsBIC1基因和/或OsBIC2基因。

本发明所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为水稻或拟南芥。

本发明还提供所述OsBICs基因在调控植物开花时间中的应用。所述调控是指延迟开花时间(例如推迟水稻抽穗期)。

所述应用包括：

1)使植物包含OsBIC1基因和/或OsBIC2基因；或者，

2)使植物过表达OsBIC1基因和/或OsBIC2基因。

本发明还提供OsBICs基因在水稻育种中的应用。其中，育种目的为调控植株高度、开花时间。

本发明还提供一种培育转基因植物的方法，包括将所述OsBICs基因导入目的植物中以获得转基因植物，调控水稻植株高度、开花时间。

在本发明的一个具体实施方式中，培育转基因植物的方法进一步包括获得所述转基因植物的种子，并通过种植所述种子以获得转基因植物后代。

本发明还提供一种调控植物植株高度的方法，包括将所述OsBICs基因或含有该基因的载体引入所述植物中以使其在植物中表达，从而调控水稻植株高度。

本发明还提供一种调控植物植株开花时间的方法，包括将所述OsBICs基因或含有该基因的载体引入所述植物中以使其在植物中表达，从而调控水稻植株开花时间。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

在本发明的一个具体实施方式中，利用Infusion系统(Clotech)，通过限制性酶切位点PstI分别将OsBICs的cDNA序列构建到过表达载体pHCF上，将重组载体转入到根癌土壤农杆菌EHA105中，并通过农杆菌介导法转化水稻日本晴(Oryza sativa japonicacv.Kita-ake)。用T1代对过表达植株进行植株高度、开花时间等表型测量。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次克隆获得了水稻基因OsBIC1、OsBIC2，并对其功能进行了研究，发现OsBIC1、OsBIC2在水稻光周期反应中作用明显，与拟南芥BICs特点相似，均能够延迟开花和蓝光特异性促进叶鞘的伸长。

附图说明

图1为本发明实施例2中OsBICs过表达转基因水稻植株的Western blot检测结果。

图2为本发明实施例3中基因OsBICs过表达后，在转基因植株中株开花延迟的表型。其中，A为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7自然条件下植株照片；B为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7分别在自然条件、长日照条件、短日照条件下的开花统计结果。

图3为本发明实施例3中基因OsBICs过表达后，在蓝光条件下叶鞘伸长的表型。其中，A、B、C为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7植株分别在黑暗、弱蓝光、强蓝光条件下的14天幼苗照片；D、E、F为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7植株从黑暗转到蓝光条件下的叶鞘长度变化统计图；G、H、I为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7植株在黑暗、蓝光、红光、远红光条件下的叶鞘长度变化统计图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的pHCF质粒参见Zhang,C.,Liu,J.,Zhao,T.,Gomez,A.,Li,C.,Yu,C.,Li,H.,Lin,J.,Yang,Y.,Liu,B.,et al.(2016).A Drought-InducibleTranscription Factor Delays Reproductive Timing in Rice.Plant physiology 171,334-343。

实施例1水稻OsBICs基因过表达载体的构建

(1)取水稻日本晴的种子，种植在含有营养土中，在短日照下生长15天。取水稻倒数第一片叶，提取RNA。

(2)cDNA第一链的反转录合成

(3)用设计好的OsBICs cDNA扩增引物，以反转录产物为模板，进行PCR扩增。引物序列如下(5′-3′)：

pOsBIC1-F:TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGGCGACTTCCGGCGACGTC

pOsBIC1-R:ATGGATCCGTCGACCTGCAGGTAATCAAGCTCGATAATCA

pOsBIC2-F:TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGTGCAAGAGGAGCTGCATG

pOsBIC2-R:ATGGATCCGTCGACCTGCAGAGAGCAGCCGTTCTGCACCCG

PCR反应体系如下：

(4)PCR产物回收和产物连接

琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司)回收PCR产物，回收片段与酶切后的载体进行连接。

载体酶切：

37℃反应1小时后回收酶切产物。

DNA回收片段与连接：

连接体系：

50℃反应30min后用于转化实验。

(5)大肠杆菌DH5α的转化

(6)阳性克隆的鉴定

(7)对于测序正确的单克隆，扩摇菌液，用试剂盒提取质粒，

实施例2转基因水稻植株的获得

将构建好含有OsBIC1 cDNA和OsBIC2 cDNA的质粒分别转化农杆菌后，进行水稻转化。

1、农杆菌感受态的制备与转化

(1)农杆菌感受态的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落分别置于5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，EHA105抗性为：100μg/ml利福平(Rif)。28℃培养过夜；取过夜培养菌液500μl接种于50ml LB含相应抗生素的液体培养基中，28℃培养到OD 600约为0.5；冰上放置30min；4℃，5,000rpm离心10min，用15ml预冷的10mM CaCl₂重悬农杆菌细胞，4℃，5,000rpm离心10min；用2ml预冷的10mM CaCl₂重悬沉淀，冰上100μl/管分装，液氮速冻，-80℃保存。

(2)农杆菌转化

取100μl感受态细胞冰上解冻，加入1μg质粒DNA混匀后，冰上放置30min，液氮速冻3-5min后立即放于37℃水浴5min，加入1ml无抗LB液体培养基，28℃，160rpm复苏3-5h后菌液均匀涂于含相应抗生素的固体培养基上。28℃倒置培养2～3d，挑单菌用PCR鉴定阳性克隆。

2、水稻转化

(1)愈伤组织的诱导

1)用清水冲洗5-6次。

2)用75％的乙醇2分钟期间不停晃动消毒2min。

3)用34％的次氯酸钠,放置28℃摇床消毒30min，用清水洗5-6次，放在含有滤纸的皿上，风干。

4)将种子转移到含有2.5mg/ml 2,4-D的诱导培养基中诱导愈伤组织。

5)28℃光照培养,约四周可形成许多颗粒状的愈伤组织。

(2)转化

1)农杆菌的培养：经检测含有表达载体质粒的农杆菌划线培养于平板上(含有相对应抗生素)28℃培养3天。

2)转化液的准备：在50ml的灭菌离心管中装入含有诱导剂AS(乙酰丁香酮)的液体培养基30-40ml，再用接种针挑取米粒大小培养好的农杆菌分散在液体培养基中。注意：细菌浓度不能太大，否则脱菌效果不好。另外，细菌应充分分散。

3)转化：以外观良好，生长活力好愈伤组织为转化材料，进行农杆菌转化，浸泡愈伤组织30min其间并不时摇动。然后倒掉农杆菌,将愈伤用无菌滤纸吸干，置于培养基上进行共培养。培养条件是25℃，暗培养3天。

(3)脱菌及筛选

将共培养的愈伤转移到50ml的灭菌离心管中用无菌水冲洗愈伤3-5次最浸泡愈伤组织30min其间并不时摇动后加入含有羧苄青霉素(500ml水中加入1ml 200mg/ml的羧苄青霉素)的无菌水中，浸泡愈伤组织30min，其间不时摇动。将愈伤用无菌滤纸吸干，置于筛选培养基上进行筛选(1L培养基中加1.5ml 50mg/ml的潮霉素Hyg；1L培养基中加2ml 200mg/ml的羧苄青霉素)20天左右，每10天继代一次。

(4)分化

1)将生长良好的抗性愈伤转移到分化培养基中,28℃光照培养10天，不加抗性。

2)将抗性愈伤转移到放分化培养基的三角瓶中,28℃光照培养20-30天周可以成苗。

(5)生根

将分化出绿色小苗转移到生根培养基上进行生根，约7天即可长出发达的根系。

(6)炼苗

将小苗套上保鲜袋进行外界环境的适应锻炼，约7天。

(7)移栽大田

3、转基因阳性株系的鉴定

为了确定转基因阳性植株，取一片鲜嫩的叶片，提取总蛋白，进行免疫印迹(Western blot)，pHCF载体含有flag标签，用flag抗体进行阳性植株鉴定。同时用丽春红染色(Ponceau)作为阴性对照。

实验结果如图1所示，OsBIC1-3、OsBIC1-4、OsBIC2-6、OsBIC2-7株系含有flag抗体，表明其为转基因阳性植株。其中OsBIC1-3和OsBIC1-4为OsBIC1过表达转基因植株的第3和第4个转基因株系；OsBIC2-6和OsBIC2-7为OsBIC2过表达转基因植株的第6和第7个转基因株系。

实施例2中使用的培养基如下：

LB培养基：

其中，诱导培养基、筛选培养基、共培养所用培养基、分化培养基及生根培养基可参见Hiei,Y.,Ohta,S.,Komari,T.,Kumashiro,T.,and(1994).Effcient transformationof rice(Oryza-sativaL)mediated by agrobacterium and sequence-analysis of theboundaries of the T-DNA.The Plant Journal 6,271-282.

实施例3转基因水稻表型鉴定

1、转基因水稻开花鉴定

2017年6月，将转基因水稻种植于北京基地自然条件下，观察开花表型；将转基因水稻种植于长日照培养箱(光照14小时，温度28℃；黑暗10小时，温度24℃)，观察开花表型；将转基因水稻种植于短日照培养箱(光照10小时，温度28℃；黑暗14小时，温度24℃)观察开花表型。

2、转基因水稻叶鞘长度鉴定

将转基因水稻分别种植于黑暗、红光、远红光、蓝光培养箱中，待生长到14天时，测量叶鞘长度。实验结果如图2和图3所示，图2为OsBICs过表达后，在转基因植株中开花延迟的表型。图2A为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7自然条件下植株照片，图2B为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7分别在自然条件、长日照条件、短日照条件下的开花统计结果。植株照片图3为OsBICs过表达后，在蓝光条件下叶鞘伸长的表型。图3A、3B、3C为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7植株分别在黑暗、弱蓝光、强蓝光条件下的14天幼苗照片；图3D、3E、3F为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7植株从黑暗转到蓝光条件下的叶鞘长度变化统计图，图3D为第二片叶鞘长度统计结果，图3E为第三片叶鞘长度统计结果，图3F为幼苗总长度统计结果；图3G、3H、3I为野生型(WT)、OsBIC1-4、OsBIC2-7植株在黑暗、蓝光、红光、远红光条件下的叶鞘长度变化统计图，图3G为第二片叶鞘长度统计结果，图3H为第三片叶鞘长度统计结果，图3I为幼苗总长度统计结果。

从图2可以看出，OsBIC1-4、OsBIC2-7植株在自然条件、长日照条件、短日照条件下都呈现晚花表型；从图3可以看出，OsBIC1-4、OsBIC2-7幼苗在蓝光条件下，第二片叶鞘长度、第三片叶鞘长度、幼苗总长度相比野生型，都显著增加，而OsBIC1-4、OsBIC2-7植株在黑暗、红光、远红光条件下，和野生型相比，叶鞘长度和幼苗总长度无明显变化

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用

<130> KHP181113282.7

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcgactt ccggcgacgt cgaagaggtg ccggagccgg gcatggatca cccggctgag 60

ccatgcatgg gcgtcggcgg cgaccagctg gtgccgacga cggaggaaat aagcctcccg 120

ctggcggccg agacgacgtc agatcaccat gaagcggcac agctggagca gtccgcggag 180

acgtcgacgt cagagtcgga atcagaggag gtggccgcca agacgacgtc cgattccagt 240

gaggcggcgg cggttattcc caagcacgcc gcggagggtt cgtcgacggc gtcagaggag 300

gagcaggtag cgaagaagga gctgaaggaa gccgaggagg acgatggcct gcagggcgag 360

agcgcgcggg agaggctgaa gcggcacagg cgggagatgg ccgggagggt gtgggtgccg 420

gacatgtggg ggcaggagaa gctgctcaag gactgggtgg actgcgccgc cttcgaccgc 480

ccgctcgtgc cgcccgacct gctcacggcg cgccgggcgc tcgtcgccga gtgctgcgcg 540

cgccgcccgg accggacgac gacgccgccc ggaccggacg acgacgccgc ccgccagatc 600

cagccctctc cgggtgcaaa aaagctgctc ctgattatcg agcttgatta ctag 654

<210> 2

<211> 217

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Thr Ser Gly Asp Val Glu Glu Val Pro Glu Pro Gly Met Asp

1 5 10 15

His Pro Ala Glu Pro Cys Met Gly Val Gly Gly Asp Gln Leu Val Pro

20 25 30

Thr Thr Glu Glu Ile Ser Leu Pro Leu Ala Ala Glu Thr Thr Ser Asp

35 40 45

His His Glu Ala Ala Gln Leu Glu Gln Ser Ala Glu Thr Ser Thr Ser

50 55 60

Glu Ser Glu Ser Glu Glu Val Ala Ala Lys Thr Thr Ser Asp Ser Ser

65 70 75 80

Glu Ala Ala Ala Val Ile Pro Lys His Ala Ala Glu Gly Ser Ser Thr

85 90 95

Ala Ser Glu Glu Glu Gln Val Ala Lys Lys Glu Leu Lys Glu Ala Glu

100 105 110

Glu Asp Asp Gly Leu Gln Gly Glu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Lys Arg

115 120 125

His Arg Arg Glu Met Ala Gly Arg Val Trp Val Pro Asp Met Trp Gly

130 135 140

Gln Glu Lys Leu Leu Lys Asp Trp Val Asp Cys Ala Ala Phe Asp Arg

145 150 155 160

Pro Leu Val Pro Pro Asp Leu Leu Thr Ala Arg Arg Ala Leu Val Ala

165 170 175

Glu Cys Cys Ala Arg Arg Pro Asp Arg Thr Thr Thr Pro Pro Gly Pro

180 185 190

Asp Asp Asp Ala Ala Arg Gln Ile Gln Pro Ser Pro Gly Ala Lys Lys

195 200 205

Leu Leu Leu Ile Ile Glu Leu Asp Tyr

210 215

<210> 3

<211> 585

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

atgtgcaaga ggagctgcat ggcgccgtcc gagtcgtgcg cggcgcggcc ggcggacgag 60

aggccggcgg tctgcagctg cggcggggcc ggtggtggtc aggcggcggc ggggacgtcg 120

tcggaccgcc accaccagct tgtgctgctg caggcggagg cggtggagaa gaagaagggc 180

ggcagggggg cggcggcgcc ggacgaggcg gcgatggccg acggcggcgg cggtggcgga 240

ggcgctgggg atcaccatca gcaagcggcg ttgctggcgc cgttgccggt gtcgaggcgg 300

ccggcgccgt cgtcggtggc ggcgggggag gagagggaga gcgcgcggga gcggctgaag 360

cggcaccgga cggagatggc cgggcgggtg cggatcccgg agatgtgggg gcaggagagg 420

ctgctcaagg actgggtcga ctgcgccgtc ttcgaccgcc cgctcgccgc cacgcgcggc 480

ctgctcaccg cccgcgacgc cctcgtcgcc gagtgcgccg cccccgcgcg ccgcccgccg 540

cacggcccca ccgcccgccc gctccgggtg cagaacggct gctct 585

<210> 4

<211> 195

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

Met Cys Lys Arg Ser Cys Met Ala Pro Ser Glu Ser Cys Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Ala Asp Glu Arg Pro Ala Val Cys Ser Cys Gly Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Gly Gln Ala Ala Ala Gly Thr Ser Ser Asp Arg His His Gln Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gln Ala Glu Ala Val Glu Lys Lys Lys Gly Gly Arg Gly Ala

50 55 60

Ala Ala Pro Asp Glu Ala Ala Met Ala Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ala Gly Asp His His Gln Gln Ala Ala Leu Leu Ala Pro Leu Pro

85 90 95

Val Ser Arg Arg Pro Ala Pro Ser Ser Val Ala Ala Gly Glu Glu Arg

100 105 110

Glu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Lys Arg His Arg Thr Glu Met Ala Gly

115 120 125

Arg Val Arg Ile Pro Glu Met Trp Gly Gln Glu Arg Leu Leu Lys Asp

130 135 140

Trp Val Asp Cys Ala Val Phe Asp Arg Pro Leu Ala Ala Thr Arg Gly

145 150 155 160

Leu Leu Thr Ala Arg Asp Ala Leu Val Ala Glu Cys Ala Ala Pro Ala

165 170 175

Arg Arg Pro Pro His Gly Pro Thr Ala Arg Pro Leu Arg Val Gln Asn

180 185 190

Gly Cys Ser

195

Claims

1.OsBICs基因在调控植物开花时间中的应用，所述OsBICs基因包括水稻基因OsBIC1、OsBIC2；

其中，OsBIC1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，OsBIC2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述调控是指在短日照条件下延迟开花时间，所述植物为水稻；

所述应用包括使植物过表达OsBIC1基因和/或OsBIC2基因。