CN110734916B - OsbHLH98在调控水稻叶夹角中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，本发明提供了一种水稻OsbHLH98基因，以及利用转基因CRSPR‑Cas9敲除突变体、CaMV 35s启动子驱动的过表达株系验证该基因在调控水稻叶片倾角中的作用；还涉及利用该基因产物调控叶片倾角从而增加水稻种植密度的利用。

Description

OsbHLH98在调控水稻叶夹角中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种反向遗传学途径克隆的水稻OsbHLH98基因，以及利用转基因CRSPR-Cas9敲除突变体、CaMV 35s启动子驱动的过表达株系验证该基因在调控水稻叶片倾角中的作用；还涉及利用该基因产物调控叶片倾角从而增加水稻种植密度的利用。

背景技术

水稻(Oryiza Sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，占全世界一半以上的人口以水稻为主食，随着全球耕地面积的减少以及全球人口的日益增多，如何解决粮食问题已经成为各个农业大国的重要挑战。以我国为例，水稻是我国最重要的粮食产物，在口粮消费中占60％左右的比重，而我国水稻的种植面积则占耕地总面积的27％左右。水稻的产量主要受种植密度、单株穗数、穗粒数以及粒重等因素综合影响(Xing&Zhang,2010)。

油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)，是一类重要的可促进植物生长的甾醇类植物激素，能够促进植物细胞分裂和伸长，影响胚芽鞘和根的生长以及影响植物暗形态建成等等(S.D.Clouse&Sasse,1998)。研究表明，在水稻中，BR水平能够直接调节叶夹角的大小，并且，目前BR相关的基因突变体，无论是与BR生物合成或与BR信号转导相关，大多显示出在调节水稻形态建成方面的潜力(Steven D.Clouse,2002；S.D.Clouse,2011)，为筛选水稻理想株型提供了生物学依据。

叶枕(Lamina Joint)是禾本科植物特有的功能组织，具有弹性和延展性，可以调节叶片开合角度，以增加受光面积。禾本科作物作为世界最大的粮食供应植物，在农业生产中的产量十分重要，而叶片的开合角度将直接决定作物的种植密度，从而影响单位面积的产出(Ikeda,Miura,Aya,Kitano,&Matsuoka,2013)。

叶夹角是由叶片(Leaf blade)和叶鞘(Leaf sheath)中间的叶枕(Lamina joint)部位控制，除叶枕部位外在这个区域还有白色膜状叶舌(Ligule)和毛状叶耳(Auricle)两个器官。叶枕部位像是一种机械组织，薄壁细胞构成基本组织，而厚壁细胞提供机械支持。当叶片和叶鞘完全长成时，叶枕部位近轴侧伸长，使得叶片向远离茎秆的远轴端弯曲，形成叶夹角(Hoshikawa,1989)。

叶夹角对于农业应用的意义主要在于叶夹角对植株光合作用的影响：密集种植的作物具有更高的叶面积指数，直立的叶片能够使得密集种植的作物捕获更多的光，这有助于提高作物单位面积的产量(Sinclair,1999)。

有研究表明，多种植物激素都参与水稻叶夹角的调控，如油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)通过促进近叶枕轴端厚壁细胞伸长来调控叶片倾斜角度(Sun etal.,2015)。与此相关的BR生物合成或分解途径的基因突变体dwarf2(Hong et al.,2005)，dwarf4-1(Sakamoto et al.,2006)，d2(Hong et al.,2003)均表现为叶片直立，而brd3-D(CYP734A4)，功能获得性突变体表现出叶片直立，对外源BRs的敏感性降低。有研究发现，赤霉素(GA)的代谢收到BR的影响，因此赤霉素也可以间接地参与叶夹角的调控(H.N.Tong etal.,2014)。生长素也能影响叶片夹角，据报道高浓度IAA能增大叶夹角，并且与赤霉素具有协同作用(Wada,Marumo,Ikekawa,Morisaki,&Mori,1981)。生长素响应因子OsARF19过表达株系表现出叶夹角增大，并对外源BR更加敏感(S.Zhang et al.,2015)，抑制生长素的调节因子OsAFB2和OsTIR1的也能增加叶片倾角(Bian et al.,2012)。ABA可以通过调控内源BR稳态从而影响叶片倾角(X.Zhang,Sun,Cao,&Song,2015)。以上这些研究结果表明叶夹角的调控是多种植物激素以及与之相关的各种响应因子相互影响的结果。

在植物激素信号的下游有很多转录因子通过调控叶枕部位的细胞分化，以及厚壁细胞伸长来影响水稻叶片倾角。例如，抑制水稻LIC(Oraza sativa leaf and tillerangle increased controller)基因的表达，能造成叶片倾角和分蘖夹角增大以及半矮化的表型(Wang et al.,2008)。LC2(leaf inclination2)通过负调控叶枕近轴端细胞的分裂影响叶夹角(Zhao,Hu,Guo,Qian,&Xue,2010)。DLT(DWARF AND LOW-TILLERING)蛋白能被经典BR信号通路中的BZR1诱导，并且促进叶片倾角增大(H.Tong&Chu,2009；H.Tong et al.,2012)。WRKY53能够促进叶片倾角和籽粒增大，但它的转录水平则被BRs抑制(Tian et al.,2017)。HLH类转录因子BU1(BRASSINOSTEROID UPREGULATED1)，ILI1(Increased LeafInclination1)，BUL1(BRASSINOSTEROID UPREGULATED 1-LIKE1)，PGL1(POSITIVEREGULATOR OF GRAIN LENGTH 1)均能通过促进叶枕近轴端细胞伸长来增大叶片倾角(Heang&Sassa,2012；Jang,An,&Li,2017；Tanaka et al.,2009；L.Y.Zhang et al.,2009)。而典型的bHLH转录因子，如过表达IBH1(ILI1-BINDING HLH1)会导致叶片直立，IBH1通过与BC1及BUL1相互作用，抑制了BUL1与BC1的结合，同时也阻止了BC1同源二聚体的形成，从而抑制BC1和BUL1发挥功能(Jang et al.,2017)，同时IBH1蛋白也被ILI1结合，使其不能形成二聚体而发挥对细胞伸长的抑制作用(L.Y.Zhang et al.,2009)。APG1(ANTAGONIST OFPGL1)能够诱导下游抑制细胞伸长的基因的表达，与PGL1结合后，阻止了APG1同源二聚体的形成，从而阻止了抑制细胞伸长基因的表达(Heang&Sassa,2012)。

涉及的参考文献如下：

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供OsbHLH98在调控水稻叶夹角中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因OsbHLH98的用途，用于改良植物(转基因植物)叶夹角，使得叶夹角变小；OsbHLH98能够抑制水稻叶夹角的增大。

作为本发明的基因OsbHLH98的用途的改进：提高植物的种植密度和单位种植面积的光合利用率。

作为本发明的基因OsbHLH98的用途的进一步改进：增加OsbHLH98的表达量，筛选叶夹角变小的植株。

在本发明中，基因OsbHLH98的DNA序列如Seq ID NO：1所示；编码的蛋白质属于bHLH转录因子超家族，其氨基酸序列如Seq ID NO：2所示。

本发明提供了一种OsbHLH98基因突变以及超表达的水稻转化的方法。

本发明克隆并鉴定了一个控制水稻叶夹角(叶片与茎秆之间夹角)的基因OsbHLH98，该基因参与调控水稻叶片夹角。本发明通过CRISPR-Cas9技术获得了OsbHLH98功能缺失的突变体，突变体中一个碱基的缺失，导致OsbHLH98的编码序列发生紊乱，并导致蛋白表达提前终止，植物表现为叶片倾角明显增大。而在日本晴(Nipponbare)中过表达OsbHLH98，叶片倾角稍有减小，在油菜素内酯BL敏感性测试实验中表现出对外源BL促进的叶夹角增大不敏感。水稻叶片的倾斜角度过大，会影响单位面积的种植数量，也会导致光照利用效率变低。通过增加OsbHLH98的表达量，可以筛选叶夹角较小的植株，提高种植密度和光合利用率，因此，该基因在分子育种中具有潜在的农业利用价值。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。

图1是bhlh98突变体表型；

图1中：

A，bHLH98突变体(bhlh98-704)在第二外显子处缺失一个碱基C导致蛋白表达提前终止；bHLH98突变体(bhlh98-783)在第二外显子处缺失一个碱基G导致蛋白表达提前终止；

B，生长2周后的野生型(左)和突变体bhlh98-704(右)表型；

C，野生型(上图)和突变体bhlh98-704(下图)叶枕部位侧面和正面视图；

D，生长2周后野生型和突变体(bhlh98-704)倒数第二叶夹角角度、叶枕部位近轴端以及远轴端长度统计；***表示存在极显著差异(P<0.001，Student’s t test)。

图2是OsbHLH98的表达模式；

图2中：

A至F，萌发2天的幼苗中，OsbHLH98主要表达在根尖和芽(A)；而成熟的穗中，主要在颖壳中表达，而在雄蕊和雌蕊中几乎不表达(B)；完全生长的叶片的叶枕部位有特异表达(C)；主根根尖横切表明OsbHLH98主要在表皮(ep)，外表皮(ex)，厚壁组织(scl)，内皮层(en)中表达，而分生区横切则在表皮(ep)表达(D，E，F)；G，35s-bHLH98-GFP融合蛋白转基因株系的根切片，表明OsbHLH98在细胞核和细胞质均有表达；H，35s-bHLH98-GFP融合蛋白转基因株系的叶片原生质体，表明OsbHLH98蛋白在细胞核和细胞质均有表达。

图3是OsbHLH98过表达株系叶夹角变小且对外源2,4-eBL不敏感；

图3中：

A，bHLH98-OE转基因材料中OsbHLH98相对表达量显著上升；***表示存在极显著差异(P<0.001，Student’s t test)；

B，不同浓度2,4-eBL处理离体叶枕的叶片倾角变化。图中WT为野生型；704,783分别为两个bhlh98的等位突变体；over为超表达转基因株系bHLH98-OE；

C，左图为未用外源激素2,4-eBL处理的对照图；右图为200ng/μL 2,4-eBL直接处理完整植株的倒二叶叶枕的表型；WT为野生型；704,783分别为两个bhlh98的等位突变体；over为超表达转基因株系bHLH98-OE。

图4用于构建bHLH98敲除突变体的CRISPR终载体。

图5用于构建bHLH98超表达株系bHLH98-OE的35S-pCAMBIA1300载体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、bhlh98突变体叶片倾角增大：

通过CRISPR-Cas9技术构建了bHLH98敲除载体，利用水稻转基因技术得到了2个水稻叶片倾角增大的等位突变体。经过统计，当突变体水稻在正常生长环境下培养至10天左右，倒数第二叶完全长成后，叶片与茎之间的夹角明显大于野生型(图1B)，这一现象在后续生长出来的叶片中也可以观察到。通过体视镜观察叶片叶枕部位我们发现，导致叶片倾角增大的原因是叶枕部位近轴端伸长，造成的叶片向远轴端弯曲(图1C、D)。

二、水稻OsbHLH98表达模式分析

构建了OsbHLH98启动子驱动全长OsbHLH98基因组融合GUS报告基因以及，CaMV35s启动子驱动bHLH98融合GFP标签的载体，分别转水稻成熟愈伤组织，得到转基因材料。GUS融合材料的染色结果表明，OsbHLH98主要在水稻叶片(图2C)，根尖(图2A)，颖壳(图2B)，以及叶枕(图2C)部位特异表达。根尖切片表明，OsbHLH98在表皮(ep)，外表皮(ex)，厚壁组织(scl)，内皮层(en)中表达，而分生区横切则在表皮(ep)(图2D、E、F)表达。OsbHLH98融合GFP材料的荧光显微镜观察结果表明，OsbHLH98在细胞核和细胞质均有表达(图2G、H)。其中OsbHLH98在叶枕(图2C)部位的特异表达与其在该部位发挥调控叶夹角的功能相吻合。

三、bHLH98超表达会造成水稻叶夹角变小

本发明利用CaMV 35s启动子驱动bHLH98的表达获得了超表达植株(bHLH98-OE)(图3A)，结果表明bHLH98超表达会造成水稻叶夹角变小(图3B、C中未用外源激素2,4-eBL处理时的图)。直立的叶片能够使得密集种植的作物减少相互遮蔽而捕获更多的光。因此，叶夹角变小对于农业应用的意义主要在于可以更为密集地种植作物，从而有助于提高作物单位面积的产量(Sinclair,1999)。

四、水稻OsbHLH98影响叶枕对外源2,4-eBL的响应。

根据研究结果，叶夹角是由多种植物激素和下游转录因子共同作用的结果，其中最经典的调控途径是与油菜素内酯(Brassionsteroid，BR)有关，为了探究OsbHLH98对叶夹角的影响是否与油菜素内酯有关，本发明对野生型，OsbHLH98-OE，和bhlh98突变体一起，实施了2,4-eBL(一种BR的活性形式)处理实验，结果表明，bHLH98过表达减少了水稻叶枕部位对外源2,4-eBL的敏感性，而bhlh98突变体则对2,4-eBL的敏感性增强(图3B、C)。

上述结果表明，OsbHLH98能够抑制水稻叶夹角的增大，bhlh98缺失突变体叶夹角增大，而过表达株系bHLH98-OE则表现出叶夹角变小且对高浓度外源2,4-eBL不敏感，说明OsbHLH98基因具有一定的应用价值，可以通过对该基因的超表达调控进而对水稻叶夹角直立型表型进行筛选，从而实现水稻密植，提高作物单位面积的产量(Sinclair,1999)。

实施例1、OsbHLH98敲除突变体的获得、鉴定

利用CRISPR-Cas9技术，设计并构建bHLH98的敲除载体。在OsbHLH98的基因组序列中寻找Cas9酶所识别的PAM序列NGG(N可为任意碱基)，将NGG之前的19个碱基及其反向互补序列合成双链DNA接头，在上游的5'侧添加GGCA，在反向互补序列的5'端添加CAAA作为Bsa1酶切位点，将合成的双链DNA接头连入中间载体U3，经过两轮巢式PCR，将接头与gRNA一起扩增，最终用Bsa1酶切连入终载体pYLCRISPR_Cas9Pubi-H(图4)中，转化大肠杆菌在Kan抗性条件下筛选阳性克隆。以下序列为bhlh98-704以及bhlh98-783两个突变类型构建CRISPR载体时所用的接头序列。5'-GCAGGGCGGAGCAGCCGTC-3'，5'-CCCCCACAGCATCGCGGAG-3'。将构建好的载体转入农杆菌，利用农杆菌侵染水稻转基因技术将目标基因转入日本晴(Nipponbare)的成熟愈伤组织中，经过共培养、筛选以及分化生根过程，得到转基因T0代水稻苗，设计引物，扩增包括最初CRISPR靶位点的一段400-500bp的DNA，并送测序公司测序，将测序结果与bHLH98基因组序列进行比对，发现均缺失一个碱基的两种突变类型(图1A)，命名为bhlh98-704和bhlh98-783，正常培养繁种得到转基因T1代植株，正常生长后发现bhlh98-704和bhlh98-783均有不同程度的叶片倾角增大，对其中bhlh-704叶枕处的细节如图1B-D所示。

实施例2、OsbHLH98启动子融合GUS报告载体以及OsbHLH98融合GFP载体的构建

为研究OsbHLH98在水稻不同器官和组织的表达模式，通过PCR克隆OsbHLH98启动子序列，所用引物分别加上Sal1和Xba1酶切位点(以下划线标出)；之后克隆OsbHLH98全长基因组序列，所用引物加上Xba1和Kpn1酶切位点(以下划线标出)，序列如下：

启动子引物：98-pro-U：GCGTCGACGTTTATGCCTTCTAGAAGCT

98-pro-L：GCTCTAGACCCCGGCGACGTCGACGTCG

全长基因组引物：98-genome-U：GCTCTAGAACCTCGCTTCACACTAGCCGAG

98-genome-L：GGGGTACCGACAAAAAAAAACTCAATAGTC

利用野生型日本晴(Nipponbare)基因组DNA，用上述引物扩增，扩增体系为：10xPhanta Max Buffer 5μL，dNTP Mix 1μL，upper primer 1μL，lower primer 1μL，模板5μL，Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase 1μL；扩增程序为95℃5min预变性，95℃30sec，58℃30sec，72℃2min，30次循环，72℃5min，4℃Hold，分别得到OsbHLH98的启动子和全长基因组序列。

先将OsbHLH98基因的启动子序列经PCR扩增后用Sal1/Xba1双酶切后连入pBI101.3-GUS载体(Kang et al.,2013)，之后再扩增OsbHLH98编码区的基因组序列，用Xba1和Kpn1双酶切该基因组序列连入已经连好启动子序列的pBI101.3-GUS载体中。随后利用水稻转基因方法。其中，Seq ID NO：1所示的核苷酸序列是OsbHLH98的CDS序列，是基因cDNA(仅由该基因外显子序列所组成)序列上的ORF(开放读码框)区段；而OsbHLH98编码区的基因组序列是除了外显子序列外还含有内含子序列的基因全长序列；OsbHLH98基因的启动子序列是翻译起始密码子ATG上游2400bp的基因组序列。

说明：CDS序列的最后三个碱基，即TAG是终止密码子

GUS染色及显微观察

将T₁代转基因整株苗、根、根茎结合部等器官浸泡在GUS染液内(配方如下配方表)，常温抽真空15分钟后37℃温浴6h，然后转入FAA固定液中(甲醛溶液:冰乙酸:70％乙醇＝1:1:18)，抽真空5分钟后保存。之后将含有叶片等绿色组织的材料转入乙醇中脱色4-6次，每次12h，至绿色材料呈白色为止。在LEICA MZ95体视镜下观察，用LEICA DC100摄像头拍照，样品中的蓝色位点即为GUS表达位点。对于根，不需要乙醇脱色，可直接进行拍照或切片观察。GUS染色的结果表明，OsbHLH98在水稻叶片，根尖，颖壳以及叶枕部位特异表达，根尖切片表明，OsbHLH98在表皮(ep)，外表皮(ex)，厚壁组织(scl)，内皮层(en)中表达，而分生区横切则在表皮(ep)表达。

OsbHLH98融合GFP载体的构建

将GFP的序列利用Sal1和Pst1两个酶切位点连入35s-pCAMBIA-1300载体，得到改造后的35s-1300-GFP载体，再通过PCR扩增OsbHLH98的全长CDS序列，扩增体系为：10xPhanta Max Buffer 5μL，dNTP Mix 1μL，upper primer 1μL，lower primer 1μL，模板5μL，Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase 1μL；扩增程序为95℃5min预变性，95℃30sec，58℃30sec，72℃2min，30次循环，72℃5min，4℃Hold，利用Kpn1和Xba1酶切位点连入改造后的35s-1300-GFP载体，得到OsbHLH98-OE-GFP载体。

GUS染液配方表：

实施例3、bHLH98超表达转基因水稻的获得

OsbHLH98-OE的载体设计方法如下：将3xFLAG的序列利用Sal1和Pst1两个酶切位点连入35s-pCAMBIA-1300载体(图5)，得到改造后的35s-1300-FLAG载体，再通过PCR扩增OsbHLH98的全长CDS序列，扩增体系为：10xPhanta Max Buffer 5μL，dNTP Mix 1μL，upperprimer 1μL，lower primer 1μL，模板5μL，Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase1μL；扩增程序为95℃5min预变性，95℃30sec，58℃30sec，72℃2min，30次循环，72℃5min，4℃Hold，利用Kpn1和Xba1酶切位点连入改造后的35s-1300-FLAG载体，得到OsbHLH98-OE-FLAG载体。由此获得的转基因水稻命名为bHLH98-OE。

水稻转基因及阳性转化株鉴定

使用农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化法转化，具体过程如下：

水稻成熟胚愈伤组织的准备：

野生型水稻(Oryza Sativa L.spp.japonica)成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子放入烧杯中，用70％酒精消毒2min；

倒去酒精，加入25％(v/v)次氯酸钠溶液消毒30min；

倒去次氯酸钠溶液，用无菌水清洗5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min；

倒去无菌水，将种子放在无菌滤纸上吸干，种子平放于籼稻成熟胚诱导培养基中，28℃暗培养10天左右；

在超净工作台上打开培养皿，用无菌镊子将芽和胚乳去掉，留下胚性愈伤组织(淡黄色，致密不规则)，移入籼稻继代培养基中，28℃暗培养5-10天。

农杆菌的培养：

挑取农杆菌单克隆菌斑或吸取农杆菌菌液100μl于5ml YEP(含50mg/L Kan和50mg/L Str)培养液中，28℃，250rpm摇床振荡培养过夜，至菌液OD600饱和为止；

从上述饱和的菌液中吸取500μl于30ml YEP含50mg/L Kan和50mg/L Str培养液中，28℃，250rpm在摇床上振荡培养12-16h至菌液OD600＝0.8-1.5。

共培养及抗性愈伤的筛选：

取培养好的农杆菌菌液15ml置于50ml离心管中，4℃，4000rmp，离心10min收集菌；

用含200μmol/L As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.4-0.7左右；

将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，切割成粒状，放入农杆菌悬浮液震荡培养30min；

将愈伤组织小心取出，置于无菌的滤纸上沥干30min；

然后将愈伤组织置于放有一层滤纸的共培养基上；

25℃暗培养2.5天后，将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡；

再用含250mg/L羧苄青霉素钠的无菌水清洗1-2遍；

最后置于无菌滤纸上沥干2小时；

将晾干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮抗性筛选，28℃，暗培养14天；不抗潮霉素的愈伤会褐化死亡，选择能够继续生长的愈伤转入到第二轮筛选。

将长大的初始愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素选择培养基上进行第二轮选择(筛选条件同上)，28℃，暗培养14天，此时长出的愈伤为带有潮霉素抗性基因的愈伤。

抗性愈伤的分化及成苗：

挑取从同一愈伤来的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强为2000lx)；

分化培养30天左右愈伤组织会分化出小苗，当小苗长至3-5cm左右，转入生根培养基中，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强为2000lx)。

转基因苗的锻炼和移栽：

生根14天后，将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出，打开封口膜，加入适量营养液，在培养室炼苗2-3天；

洗去琼脂，转入水稻营养液中培养，收种。

转基因植株的鉴定

T₀代阳性转基因植株的筛选

T₀代转基因苗在正常条件下(温度：白天30℃，晚上22℃；湿度>60％；光照度3万LUX，白天晚上时间分别为12小时)溶液培养一周之后，取1cm长的叶片使用快提buffer提取基因组DNA，利用抗性筛选标记基因对转基因苗进行鉴定，筛选阳性的转化株系。

基因组DNA的快提(TPS法)：

1.取1cm叶片置于2ml离心管中，加入200μL TPS抽提液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，1M KCl)，加入一枚钢珠，盖紧离心管盖，在打样仪TissueLyserⅡ(QIAGEN，U.S.A)震荡1.5min。频率为25次/秒。

2.将捣碎的组织匀浆置于70℃水浴30min。然后小心倒掉钢珠，防止样品被大量倒出。

3. 12000rpm离心10min，取上清作为PCR模板。

潮霉素抗性基因检测：

潮霉素抗性基因引物序列为：

上游引物：5’CGAGTACTTCTACACAGCCATC 3’

下游引物：5’TAGCGAGAGCCTGACCTATT 3’

PCR条件为95℃变性5min，然后进入循环反应：95℃30s，59℃30s，72℃1min，循环数为33，最后延伸5min结束。取10μL PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳检测，然后用GelDoc^TM XR+(BIO-RAD，USA)成像系统记录实验结果。能够扩增出潮霉素抗性基因条带的株系表明是转基因阳性植株。

OsbHLH98-OE株系的OsbHLH98表达定量实验

RNA提取以及逆转录实验

水稻总RNA提取采用Trizol法，将植物组织(本实验中取用叶枕部位)用液氮研磨至粉状，用液氮预冷的药匙将粉末放进1.5mL无RNA酶的EP管中，加入1mL Trizol，振荡器混匀后放置冰上10min，之后4℃，12,000rpm离心10min，将上清吸入新的1.5mL无RNA酶的EP管中，加入250μL三氯甲烷，上下颠倒混匀，冰上放置10min，之后4℃，12,000rpm离心10min，将上清吸入新的1.5mL无RNA酶的EP管中，加入400μL异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置30min，之后4℃，12,000rpm离心20min，弃上清，用DEPC处理过的蒸馏水配制70％乙醇洗涤沉淀两次，吸干乙醇，在通风橱中吹干，加适量DEPC处理过的蒸馏水溶解沉淀，就得到水稻总RNA。

逆转录实验利用Promega公司Reverse Transcription System试剂盒进行逆转录，以10μL体系为例，首先吸取1μg总RNA，加水至5μL，70℃预变性10min，之后依次加入试剂盒中MgCl₂ 2μL，10xReverse Transcription Buffer 1μL，dNTP Mix 1μL，RNaseinhibitor 0.3μL，AMV reverse transcriptase 0.2μL，Oligo dT 0.5μL。反应条件：42℃50min，95℃5min，4℃hold。

qRT-PCR实验

实时定量PCR反应利用罗氏LightCycler 480 SYBR Green 1Master试剂进行PCR，使用罗氏LightCycle 480荧光定量仪进行反应。

实施例4、水稻叶夹角对外源油菜素甾醇(2,4-eBL)敏感性测试实验

将野生型、bHLH98-OE以及bhlh98-704、bhlh98-783种子浸泡在0.8％硝酸水溶液中，常温放置18-20小时，之后换清水，37℃放置约2天至露白，期间每12小时换一次水。之后，将露白的种子播在全素营养液上，待其生长至8天后，对于离体处理则将倒数第二叶从叶枕上下各一公分处剪下，放入分别含有0、10^-8、10^-7、10^-6M/L 2,4-eBL水溶液的培养皿中，避光室温放置3天，之后拍照(图3B)。对于完整植处理则待水稻幼苗生长至10天左右，第三片叶片长出时，将200ng/μL的2,4-eBL溶液1μL点在第二叶的叶枕部位，同时在对照组的叶枕部位滴1μL蒸馏水，正常生长(无须避光)三天后观察并拍照(图3C)。结果表明OsbHLH98过表达株系叶夹角变小且对外源2,4-eBL不敏感。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> OsbHLH98在调控水稻叶夹角中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccgggc agcagccgca gcagcagggc ccaccggagg acgacttttt cgaccagttc 60

ttctccctga ccagctcctt ccctggcgcc gcgccgggcg gccgcgccgc cggtgaccag 120

cccttctccc tcgcgctcag cctcgacgcc gccgcggcgg ccgaggcgtc cgggagcggg 180

aagaggctcg gggtcggcga tgacgccgag ggtggcggca gcaaggcgga tcgggagacc 240

gtgcagctca ccggactctt cccgccggtg ttcggcggcg gcggcgtgca gccgccgaac 300

ctccgcccca ccccgcctac ccaggtgttc cacccgcagc agtcgaagca gggcggagca 360

gccgtcgggc cgcagccgcc ggcgccgagg ccgaaggtgc gagcgcggcg tgggcaggcg 420

accgaccccc acagcatcgc ggagaggcta agaagagaga gaatagcaga aaggatgagg 480

gccctacagg aattggtccc caatacaaac aagacagata gggcagctat gctagatgag 540

atccttgatt atgtgaaatt cctgaggctg caagtaaagg ttttaagcat gagcaggctg 600

ggtggcgcgg gtgctgttgc acagctggtt gctgatattc cactttcagt taagggggaa 660

gcaagcgata gtgggggcaa ccaacagatt tgggaaaagt ggtcaacgga tggcacagaa 720

agacaggtag cgaagctgat ggaagaagac atcggggcag cgatgcaatt tctccaatcc 780

aaagcactct gcatgatgcc aatctcgctc gccatggcaa tctatgacac acaacaaaca 840

caggatggac aaccagtgaa gcacgaaccc aacactcctt cctag 885

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Gly Gln Gln Pro Gln Gln Gln Gly Pro Pro Glu Asp Asp Phe

1 5 10 15

Phe Asp Gln Phe Phe Ser Leu Thr Ser Ser Phe Pro Gly Ala Ala Pro

20 25 30

Gly Gly Arg Ala Ala Gly Asp Gln Pro Phe Ser Leu Ala Leu Ser Leu

35 40 45

Asp Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ser Gly Ser Gly Lys Arg Leu Gly

50 55 60

Val Gly Asp Asp Ala Glu Gly Gly Gly Ser Lys Ala Asp Arg Glu Thr

65 70 75 80

Val Gln Leu Thr Gly Leu Phe Pro Pro Val Phe Gly Gly Gly Gly Val

85 90 95

Gln Pro Pro Asn Leu Arg Pro Thr Pro Pro Thr Gln Val Phe His Pro

100 105 110

Gln Gln Ser Lys Gln Gly Gly Ala Ala Val Gly Pro Gln Pro Pro Ala

115 120 125

Pro Arg Pro Lys Val Arg Ala Arg Arg Gly Gln Ala Thr Asp Pro His

130 135 140

Ser Ile Ala Glu Arg Leu Arg Arg Glu Arg Ile Ala Glu Arg Met Arg

145 150 155 160

Ala Leu Gln Glu Leu Val Pro Asn Thr Asn Lys Thr Asp Arg Ala Ala

165 170 175

Met Leu Asp Glu Ile Leu Asp Tyr Val Lys Phe Leu Arg Leu Gln Val

180 185 190

Lys Val Leu Ser Met Ser Arg Leu Gly Gly Ala Gly Ala Val Ala Gln

195 200 205

Leu Val Ala Asp Ile Pro Leu Ser Val Lys Gly Glu Ala Ser Asp Ser

210 215 220

Gly Gly Asn Gln Gln Ile Trp Glu Lys Trp Ser Thr Asp Gly Thr Glu

225 230 235 240

Arg Gln Val Ala Lys Leu Met Glu Glu Asp Ile Gly Ala Ala Met Gln

245 250 255

Phe Leu Gln Ser Lys Ala Leu Cys Met Met Pro Ile Ser Leu Ala Met

260 265 270

Ala Ile Tyr Asp Thr Gln Gln Thr Gln Asp Gly Gln Pro Val Lys His

275 280 285

Glu Pro Asn Thr Pro Ser

290

Claims (3)

1.基因OsbHLH98的用途，其特征在于：用于减小水稻叶夹角；基因OsbHLH98的DNA序列如Seq ID NO：1 所示。

2.根据权利要求1所述的基因OsbHLH98的用途，其特征在于：提高水稻的种植密度和单位种植面积的光合利用率。

3.根据权利要求1或2所述的基因OsbHLH98的用途，其特征在于：增加OsbHLH98的表达量，筛选叶夹角变小的水稻。

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