CN114807181A

CN114807181A - 水稻OsCKX3基因在调控水稻叶夹角中的应用

Info

Publication number: CN114807181A
Application number: CN202210492475.1A
Authority: CN
Inventors: 张可伟; 黄鹏; 赵江哲; 洪佳乐; 朱宝; 夏帅; 朱恩高; 韩平飞
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2022-04-30
Filing date: 2022-04-30
Publication date: 2022-07-29
Also published as: JP2023164339A

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻细胞分裂素氧化酶OsCKX3基因在调控植物叶夹角中的应用。本发明公开了水稻基因OsCKX3或其编码的蛋白在水稻作物改良中的应用：调控水稻叶枕发育和叶夹角、改善水稻株型和提高水稻产量。

Description

水稻OsCKX3基因在调控水稻叶夹角中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及水稻OsCKX3基因在控制水稻叶夹角大小中的应用。

背景技术

到目前为止，我国年粮食总产量已超过6.6亿吨，其中水稻产量约占32％，但是随着我国人口增加和生活水平的提高，人们对粮食产量的需求日益增加。在耕地面积不变的现状下，粮食产量尤其是水稻产量的大幅提高迫切需要科学家培育出高产、优质作物新品种。叶夹角是指叶片和茎的倾角，其对于水稻的受光面积具有重要影响，是理想株型的重要因素，在作物培育中具有重要作用，直立的叶片适宜密植，可减少植株间的相互遮蔽，增加光合效率，提高作物产量(Tong and Chu,2018)。叶夹角的大小主要由叶枕控制，叶枕发育过程中的细胞分裂和伸长能导致叶片倾角的改变(Feng et al.,2016)。

植物激素在调节叶夹角过程中发挥重要作用，已有研究发现油菜素内酯(brassinosteroid, BR)、赤霉素(gibberellic acid,GA)和生长素(IAA)均参与调控叶夹角的形成(Tong and Chu, 2018；Duan et al.,2019)。细胞分裂素(cytokinin,CK)是调控农作物形态生理和产量的重要激素之一，与干细胞分裂、穗发育、株型、氮肥利用、环境胁迫等均密切相关(Hwang et al.,2012； Wang et al.,2018；Yang et al.,2021)。但是CK调控叶夹角的分子机制尚未见报道。作为调控 CK水平的重要酶细胞分裂素氧化酶(cytokinindehydrogenase,CKX)可以催化CK氧化分解生成腺嘌呤和侧链，使CK彻底丧失活性，此反应不可逆(Ashikari et al.,2005)，因此CKX 对于CK活性水平的调节发挥关键作用。CKX基因表达量的下降可以显著提高CK含量，促进顶端分生组织的形成，拟南芥ckx3ckx5双突变体的花数目、果荚数及种子数均明显增加，种子数量提高50％以上(Bartrina et al.,2011)；水稻ckx2和dst(OsCKX2正向调节基因)突变体中CK含量显著增加，水稻穗粒数均增加20％以上(Ashikari,2005；Li et al.,2013)。水稻 OsCKX9通过D53参与独脚金内酯(strigolactone,SL)信号途径，调节水稻分蘖芽的发育(Duan et al.,2019)；水稻CKX11参与ABA代谢途径调控叶片衰老(Zhang et al.,2021)。水稻OsCKX4 还参与调控Zn元素的吸收(Gao et al.,2019)。CK和CKX基因已被证实参与水稻顶端分生组织发育、根部发育、叶片衰老以及分蘖芽发育等过程，但是CKX调控叶夹角形成的机制以及应用还尚未研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水稻细胞分裂素氧化酶OsCKX3基因在调控水稻叶夹角大小中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供一种水稻基因OsCKX3或其编码的蛋白在水稻作物改良中的应用：调控水稻叶夹角。

作为本发明应用的改进：调控水稻叶枕发育和叶夹角、改善水稻株型和提高水稻产量。

作为本发明应用的进一步改进：所述水稻基因OsCKX3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；还包括与其互补，同源，或该序列经过插入、突变几个核苷酸而形成的具有相同功能的核苷酸序列。

作为本发明应用的进一步改进：所述基因OsCKX3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

作为本发明应用的进一步改进：敲除OsCKX3基因，使得叶夹角变小、籽粒增大。

作为本发明应用的进一步改进：过表达OsCKX3，使得水稻叶夹角增大。

作为本发明应用的进一步改进：osckx3突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4～SEQID NO： 5的任一所示。

本发明还同时提供了一种用于编辑水稻OsCKX3基因的gRNA靶序列在调控植物叶夹角中的应用：所述gRNA靶序列为水稻OsCKX3基因的CDS正义链的第332～351位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提出了一个调控水稻叶夹角的正向调控因子及其应用，利用反向遗传学方法筛选到OsCKX3基因通过参与水稻叶枕组织细胞的分裂和生长来调控叶夹角的大小。本发明研究了该基因调控水稻叶夹角的分子生物学功能及应用，为选育密植型的高产水稻新品种提供了一个潜在的新基因资源。

本发明获得了一种调控水稻叶夹角的正向调控因子，正向调控因子为基因OsCKX3，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。水稻OsCKX3基因在调控植物叶夹角中的应用具体为：OsCKX3基因通过调节叶枕处细胞的不对称生长调控叶枕发育，以调控水稻叶夹角的形成。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明通过筛选11个OsCKX基因突变体发现osckx3突变体叶夹角显著变小，不同发育时期的水稻叶夹角表型均证明OsCKX3调控叶夹角的大小。

应用时，构建OsCKX3的CRISPR/CAS9载体，并利用农杆菌介导法转入日本晴，敲除OsCKX3基因，所获得的敲除突变体叶夹角显著变小，因此可通过该方法增加叶枕组织中细胞分裂素的含量，增加叶枕处细胞层数，减小叶夹角，改善水稻株型和种植密度，提高产量。

与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：

1.OsCKX3基因在改变作物叶夹角同时，不削弱其它产量性状，可以创建株型紧凑、叶夹角小的水稻育种材料，对水稻育种具有重要的实际应用意义。

2.OsCKX3基因是改变叶夹角大小的有效基因，可以改变叶枕处细胞层数和维管束数目，进而改变水稻的叶夹角。

3.目前，尚未有细胞分裂素调控叶夹角的基因的报道，本发明的基因揭示了其通过控制叶枕细胞分裂素的含量，参与叶夹角大小的调控。

本发明的OsCKX3调控叶夹角的发现和应用，填补了CK调控叶夹角的空白，提供了一个改善水稻密植和提高水稻产量的潜在应用价值的基因。

需要说明的是：促进细胞分裂素含量的增加与调控水稻叶夹角之间并没有必然的联系。例如目前已知的OsCKX2基因、OsCKX11基因，其均具有促进细胞分裂素含量的增加的功能，但是没有任何关于与水稻叶夹角关联性的文章被报道。

综上，本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻细胞分裂素氧化酶OsCKX3基因在调控植物叶夹角中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术敲除日本晴水稻基因OsCKX3，利用转基因技术获得OsCKX3过表达材料。与野生型相比，突变体叶夹角显著减小并且株型更直立而过表达材料叶夹角显著增大。激素分析证明突变体细胞分裂素含量显著增加，而叶枕细胞学结构观察发现突变体的叶枕近轴端和远轴端的细胞层数和维管束数量显著增加，表明细胞分裂素通过增加细胞数量改变叶夹角的形成。农艺性状分析表明突变体的水稻籽粒大小显著增加，过表达材料籽粒显著变小。因此基因工程技术敲除OsCKX3基因能够改变水稻叶夹角的形成和籽粒大小，从而改善植物株型和种植密度，提高产量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明实施例提供的osckx3突变体的创制图和过表达材料OsCKX3基因表达量；

图1中：

A为OsCKX3基因结构和CRISPR靶点；

B为OsCKX3基因的突变位点；

C为OsCKX3过表达材料中OsCKX3基因表达水平。

图2是本发明提供的野生型(WT)、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料生长10天(A)和90天(B)的表型；C、D分别是A图和B图叶夹角统计数据。

图3是本发明实施例提供的野生型(WT)osckx3突变体和OsCKX3过表达材料生叶枕近轴端和远轴端表型；

图3中：

A～C：WT(A)、osckx3突变体(B)和OsCKX3过表达材料(C)叶枕切片结构；

D～F：WT(D)、osckx3突变体(E)和OsCKX3过表达材料(F)叶枕近轴端结构；

G～I：WT(G)、osckx3突变体(H)和OsCKX3过表达材料(I)叶枕远轴端结构；

J为野生型(WT，左)、osckx3突变体(中)和OsCKX3过表达材料(右)叶枕D1和D2 长度；

K为野生型(WT，左)、osckx3突变体(中)和OsCKX3过表达材料(右)叶枕D1和D2 薄壁细胞层数；

L为野生型(WT，左)、osckx3突变体(中)和OsCKX3过表达材料(右)叶枕维管束数目。

图4是OsCKX3基因的表达模式和亚细胞定位；

图4中：

A为OsCKX3基因在根、茎、叶枕和叶片中的表达量；

B～E：OsCKX3启动子驱动GUS报告基因载体转基因水稻7天幼苗(B)、叶枕切片(C)、叶片(D)和节(E)的GUS染色图；

F为OsCKX3的激素诱导表达模式；

G为OsCKX3的亚细胞定位；

IAA:3-Indoleacetic acid,吲哚乙酸；BL，brassinolide,油菜素内酯；cZ,cis-zeatin,顺式玉米素；tZ,trans-zeatin,反式玉米素；iP,isopentenyladenine,异戊二烯腺嘌呤。Mock指用0.1％乙醇处理10天幼苗，IAA、BL、cZ、tZ和iP指分别用1μM处理水稻10天幼苗。

图5是OsCKX3蛋白的催化活性；

图5中：

A为OsCKX3催化反应方程式；

B为OsCKX3催化tZ和iP反应；

C为野生型(WT)、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料细胞分裂素含量。

图6是野生型(WT)、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料的农艺性状分析图。

图6中：

A为成熟期野生型(WT)、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料表型拍照；

B～C为野生型(WT)、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料剑叶和倒二叶叶夹角；

D为野生型(WT)、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料籽粒；

E为野生型(WT)、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料株高、有效分蘖数、穗初级枝梗数、穗次级枝梗数、结实率、每穗粒数、籽粒长度、籽粒宽度、千粒重表型统计。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的调控水稻叶夹角的基因，通过鉴定水稻osckxs突变体获得。

在本发明实施例中，OsCKX3的CDS序列如SEQ ID No.1，或为：包括与SEQ ID No.1所示的CDS序列至少有70％同源性地DNA序列，以及对其中一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。

在本发明实施例中，利用OsCKX3编码的蛋白的氨基酸序列为Seq ID No.2。

本发明中涉及的野生型水稻为日本晴。

本发明中涉及常规大肠菌种DH5α、农杆菌GV3101、EHA105均可以市场中购买获得。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1、获得水稻细胞分裂素氧化酶osckx3突变体：

1.OsCKX3基因CRISPR/Cas9载体转基因

水稻OsCKX3在水稻基因组注释计划中基因编号为LOC_Os10g34230；SEQ ID NO：1为OsCKX3完整的读码框序列，其氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2。

CRISPR/Cas9基因敲除的载体pRGEB31-OsCKX3的构建及转化：选取基因OsCKX3的CDS 序列的332～351bp的序列为靶位点(GAATTCAATCTCAGAAGGCA)，连接到敲除载体pRGEB31中，构建pRGEB31-OsCKX3载体，然后按照常规方法进行遗传转化(委托武汉伯远生物科技有限公司)，获得OsCKX3基因的敲除株系。

2.水稻基因组DNA的提取

2mL离心管加入约0.05g的osckx3突变体(步骤1所得的OsCKX3基因的敲除株系)的水稻叶片，加入钢珠与500μL CTAB溶液(100mM Tris-HCl(pH8.0)(提前配好1M母液)，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％CTAB)，利用组织研磨机40Hz，60s研磨；65℃水浴20min，10000rpm离心5min；取400μL上清加入新的1.5mL离心管，加入相同体积的氯仿，混匀，室温静置5分钟，12000rpm，离心10min；小心吸取上清液300μL，加入二倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置30min，12000rpm，离心10min，弃上清，吸去残液，室温静置5～10min，小白点变透明，立即加30～50μL的水或TE溶解，轻轻地混匀、离心，于-20℃保存备用。

3.敲除材料靶序列基因型检测

以上述步骤2所得的水稻基因osckx3敲除T0代材料的基因组DNA为模板，采用引物对 OsCKX3 crispr-F(5’-CCTGCTCATCCTCATCCTTT-3’)和OsCKX3 crispr-R(5’-GGGCAAATATAAGACCTTAT-3’)进行PCR扩增。

PCR扩增体系为总体积为50μL，模板为基因组DNA 1μL(约50ng)、2×KOD酶反应缓冲液25μL、2mM dNTP 10μL、10M引物4μL(每条引物均为2μL)、KOD酶1μL，加ddH₂O(无菌去离子水)至50μL。

PCR程序为预变性95℃，5min，进入PCR循环，参数为变性95℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，30s，共35个循环。筛选得到T0代阳性转基因植株(阳性植株PCR扩增产物大小为597bp)。结果如图1所示，获得2个独立osckx3突变体，分别是插入1个碱基C和缺失25bp的突变株系并进行表型观察。

osckx3-1的序列如SEQ ID NO:4；

osckx3-3的序列如SEQ ID NO:5。

实施例2、OsCKX3过表达材料的获得

1.融合蛋白OsCKX3-GFP载体的构建

(1)水稻总RNA的提取

取野生型水稻日本晴叶片，快速研磨至粉末，并迅速将粉末(约0.1g)转移至不含RNA 酶的1.5mL离心管中(提前放有1mL Trizol)；涡旋振荡10s，室温静置5min；4℃，12000g离心10min，将上清转移到新的1.5mL离心管中；向离心管中加入200μL三氯甲烷，上下颠倒充分混匀，室温静置5min，4℃，12000g离心15min；上层水相300μL至新的1.5mL管，加入300μL异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000g离心10min；将上清液倒掉，保留沉淀，加入1mL70％(用DEPC配制)的酒精清洗沉淀，加入时将沉淀吸打重悬，4℃，7500g 离心5min；弃上清，保留沉淀，轻微离心，用枪头吸去多余的酒精，室温静置5min，干燥 RNA；加入50μL DEPC水溶解沉淀，溶解后放冰上，并将RNA进行浓度测定，用于cDNA的合成，并保存在-80℃冰箱。

(2)第一链cDNA的反转录

按照TAKARA公司的PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit的操作说明对提取的总RNA进行反转录得到第一链cDNA产物，-20℃保存。

(3)构建质粒OsCKX3-GFP

根据OsCKX3基因序列(SEQ ID NO.1)设计引物对：

OsCKX3-GFP-F(5’-GCAGGCTCCGAATTC ATGGAGGTTGCCATGGTCTG-3’)和 OsCKX3-GFP-R(5’-GAAAGCTGGGTCGAATTC TCAGCTATAGCTTGCAAA-3’)。

以日本晴的cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR扩增。扩增体系为50μL，PCR扩增体系为：模板cDNA1μL(约50ng)、2×KOD酶反应缓冲液25μL、2mM dNTP 10μL、10uM引物4μL (每条引物均为2μL)、KOD酶1μL，加ddH₂O(无菌去离子水)至50μL。

扩增条件为：94℃5min，30个循环(98℃10s，60℃30s，68℃2min，30s)，68℃10min。获得OsCKX3 CDS片段(扩增产物大小为1584bp，为SEQ ID No：1的序列)。扩增产物经过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段，利用一步克隆法连接到PCR8载体，将构建好的载体利用LR反应构建到pMDC43载体，得OsCKX3-GFP载体。

2.OsCKX3过表达材料获得

(1)构建OsCKX3过表达材料

获得OsCKX3-GFP载体后由武汉伯远生物科技有限公司负责转化日本晴材料，获得OsCKX3过表达材料。

(2)OsCKX3过表达材料OsCKX3表达量分析

提取OsCKX3过表达材料RNA并反转，利用以下引物检测OsCKX3表达量，图1C结果显示， OsCKX3在过表达材料中高量表达。

用以下引物做OsCKX3基因的表达分析：

引物F：5’-AGGCCCTTGATGGCATTGTAG-3’

引物R：5’-CCACCACCCACATCAGCATAA-3’

所用内参基因Ubiquitin5引物如下：

引物F：5’-GCACAAGCACAAGAAGGTGA-3’

引物R：5’-CCAAAGAACAGGAGCCTACG-3’。

图1C中：NIP代表日本晴野生型，OE1～OE2代表OsCKX3过表达材料的2个株系。

实施例3、水稻突变体和过表达材料的表型鉴定

分别观察野生型日本晴、osckx3敲除突变体材料和OsCKX3过表达材料的叶夹角。播种后正常生长10天至三叶一心期，对第一叶叶枕部位拍照，使用软件image J对不完全叶的叶夹角进行测量，以叶枕为交点，叶片为一边线，叶鞘为一边线。其发育表型如图2所示：可以看到osckx3突变体材料对比野生型有显著的叶夹角减小的表型，过表达材料有显著的叶夹角增大的表型。表明OsCKX3可以改变水稻的叶夹角。

叶枕组织切片(图3A～I)观察发现突变体内叶枕近轴端边缘至维管束的距离(d1)略短，叶枕远轴端边缘至维管束的距离(d2)显著变长，而过表达材料d1和d2都变短(图3D～J)。突变体远轴端细胞层数和微管数量显著增加(图3K～L)；结果表明OsCKX3通过调节叶枕长度和远轴端长度调控叶夹角的大小。

观察正常生长120d至成熟期的日本晴、osckx3突变体和OsCKX3过表达材料，农艺性状统计结果见图6。osckx3突变体籽粒变大且其他性状无显著性差异，表明osckx3突变体具有可以减小叶夹角和增大籽粒的有益性状，但不影响其它性状，这不同于许多叶夹角变小的突变体会影响产量性状。表明OsCKX3可以作为一个潜在的提高水稻产量的新基因资源。

实施例4、OsCKX3基因表达分析

1.Pro_OsCKX3::GUS载体的构建

以日本晴水稻基因组DNA为模板，采用引物对：

OsCKX3 pro-F(5’-GCAGGCTCCGAATTCGTCCATTAGCACCACCAAAT-3’)和OsCKX3 pro-R(5’-AAGCTGGGTCGAATTCGGTGTTGGAGTAGTGATTCT-3’)进行PCR扩增。PCR扩增体系为总体积为50μL，模板为基因组DNA1μL(约50ng)、2×KOD酶反应缓冲液 25μL、2mM dNTP 10μL、10uM引物4μL(每条引物均为2μL)、KOD酶1μL，加ddH₂O(无菌去离子水)至50μL。

PCR程序为预变性95℃，5min，进入PCR循环，参数为变性95℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，30s，共35个循环。获得OsCKX3启动子序列(序列为序列表中的SEQ IDNO.6)，扩增产物经过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段，利用一步克隆法连接到 PCR8载体，将构建好的载体利用LR反应构建到pMDC163载体，得Pro_OsCKX3::GUS载体。然后按照常规方法进行遗传转化(委托武汉伯远生物科技有限公司)，获得Pro_OsCKX3::GUS 转化株植物。

Pro_OsCKX3的序列如SEQ ID NO:6。

2.OsCKX3基因表达分析

将步骤1获得的Pro_OsCKX3::GUS转化株植物的幼苗、成熟叶片、节、叶枕等组织进行取样通过GUS染色法对目的基因的表达情况进行分析。将转基因植株的样品放入盛有90％丙酮的预冷的玻璃瓶中，室温放置30min。用冰水清洗2次后，将样品转移到GUS染色液中，37℃染色4～20h。染色完成的样品放入乙醇：乙酸＝3:1的脱色液中进行脱色，时间2～12h。脱色完成后使用数码相机或者显微镜对染色结果进行拍照记录。叶枕切片观察的样品需要使用FAA固定液进行固定，具体成分为1mL 38％甲醛(终浓度2％)，1mL冰醋酸，18mL 50％的酒精，之后通过树脂包埋。利用半薄切片机获得7μm厚的切片用于观察叶枕组织。OsCKX3表达分析按照TaKaRa公司SYBR Green的操作说明以不同组织为模板、以OsCKX3和内参基因Ubiquitin5 的定量引物扩增目的基因，检测OsCKX3在不同组织的表达量，图4A～E结果显示OsCKX3在叶枕中高量表达。图4F结果显示OsCKX3基因受BL、tZ和iP激素的诱导。

用以下引物做OsCKX3基因的表达分析：

引物F：5’-AGGCCCTTGATGGCATTGTAG-3’

引物R：5’-CCACCACCCACATCAGCATAA-3’

所用内参基因Ubiquitin5引物如下：

引物F：5’-GCACAAGCACAAGAAGGTGA-3’

引物R：5’-CCAAAGAACAGGAGCCTACG-3’。

实施例5、OsCKX3亚细胞定位

实施例2所得的OsCKX3-GFP载体转化至农杆菌GV3101中，在LB固体培养基上进行划线，培养1～2天后选取单菌落进行实验；挑取单克隆于5mL含有相应抗生素的LB液体培养中，28℃,200～220rpm震荡培养1天；将农杆菌转接到20mL含有卡那抗生素的LB液体培养基中，使OD₆₀₀达到0.3左右(20mL培养基中加入1.5mL菌液)，28℃震荡培养；检测菌液OD₆₀₀的值，数值达到1.5时即可；提前配置好重悬液(灭菌后的ddH₂O，0.01M MgCl₂， 0.01M MES及100μM AS)，6000rpm，5min集菌；先用2mL重悬液重悬菌液，随后加入 6～8mL重悬液，6000rpm，离心5min；倒出上清液，2mL重悬液重悬菌液，最终加入15mL 重悬液；28℃暗培养2～3h后注射烟草；将含有不同菌液的侵染液按照1:1:1的比例在5mL 离心管中进行混合，摇匀，随后装入1mL注射器内，用拇指按压注射器将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内(勿使用子叶)。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象，尽量减少注射孔的数目；烟草培养3天后观察，结果如图4G所示，OsCKX3-GFP(左一)和内质网Maker 荧光(左二)相融合(左四)，明场为左三，表明OsCKX3定位于内质网中。

实施例6、OsCKX3生化活性检测

1.OsCKX3体外活性检测

(1)OsCKX3-MBP载体构建

利用以下引物扩增OsCKX3并连接到pMAL载体上，转化到大肠杆菌BL21(DE3Invitrogen)中，加入0.5mM IPTG诱导表达，并利用Amylose Resin(New England BiolabsInc.) 纯化蛋白目的蛋白，从而获得MBP-OsCKX3融合蛋白。

构建pMAL-c2X载体的OsCKX3扩增引物：

OsCKX3-pMAL F：GAAGGATTTCAGAATTC ATGGAGGTTGCCATGGTCTG

OsCKX3-pMAL R：CTAGAGGATCCGAATTC TCAGCTATAGCTTGCAAATG

(2)活性检测

每个反应(100μL)中加入14μg MBP-OsCKX3融合蛋白、0.1mM细胞分裂素底物(iP和tZ)、0.5mM 2,6-二氯酚吲哚酚(DCIP)、75mM Tris/HCL buffer(pH 8.5)37℃水浴30min。后立即加入三氯乙酸终止反应。4℃，12000g离心10min；上清液过滤后利用HPLC定量检测底物减少量。图5A和5B结果表明OsCKX3可以催化tZ和iP。

2.体内活性检测

(1)CK的提取

取50mg样品放入2mL离心管中(Eppendorf)并加入钢珠，迅速放入液氮中，然后使用碾磨机(Tissuelyser-48，上海精鑫实验技术有限公司)粉碎样品，研磨至粉末后加入1.6mL 80％的甲醇以及相应的内标，内标具体添加量为50pg[²H₅]tZ，[²H₅]tZR，[²H₆]iP，[²H₆]iPR。将装有混合液的离心管在4℃条件下置于旋转仪上旋转混匀2小时，4℃，15000g，离心10分钟。小心吸取上清液移至新离心管中，氮气吹干。剩余的沉淀物加入0.6mL 80％甲醇溶液重新混匀，重复上述操作，最后将上清液补加至2mL离心管中，氮气吹干，加入300μL30％甲醇溶液进行重溶，使用0.22μm水相过滤膜过滤溶液备用。

(2)使用GC-MS系统测定CK含量

CK提取液通过装备Acquity UPLC BEH C18型分离柱组件的ExionLC(AB SCIEX)液相色谱系统进行分离。色谱柱首先在40℃条件下进行平衡，之后添加30μL的样品用于后续分析。在针对CK的相关分析中，流动相成分A为水，B为甲醇，采用了多步线性梯度洗脱法对其进行洗脱，具体步骤为：0～2.5min：5％A；2.5～3min：5～20％B；3～12.5min： 20～50％B；12.5～13min：50～100％B；13～15min：100％B；15～15.2min：100～5％B； 15.2～18min：5％B。流速设置为0.3mL min^-1。

CK分析通过QTRAP 5500型三重四极杆质谱系统(AB SCIEX)的多反应检测扫描模式(MRM mode)进行。根据相关资料的参考选择正确的离子对激素含量进行定量分析。 MRM的最优条件如下：气帘气气压：40psi，离子喷雾电压：正离子模式5000V，负离子模式-4500V；涡轮加热器温度：600℃；雾化气气压(Gas 1):60psi；加热气气压(Gas 2)：60psi。Analyst(版本1.6.3AB SCOEX)软件用于控制相关仪器以及获取结果数据。得到的原始数据之后被导入MultiQuant软件(版本3.0.2AB SCIEX)中进行进一步的分析和处理，CK 的结果通过内标参照进行精确定量。图5C表明OsCKX3在体内可以催化tZ和iP，突变后水稻体内tZ和iP含量增加，造成水稻叶夹角变小；而过表达后水稻体内tZ和iP含量减少，造成水稻叶夹角变大。

实施例7、农艺性状分析

将日本晴野生型、OsCKX3基因突变体和过表达材料种在田中，生长120天后对材料进行拍照和农艺性状统计分析，所有农艺性状包括株高、穗粒数、单株分蘖数、千粒重、粒长和粒宽均以单株数据为基础，利用SPSS软件进行统计分析。所得结果如图6所示。

根据图6，可获得以下总结性结论：OsCKX3基因突变后水稻叶夹角变小、千粒重增加、结实率略微减低，而其他农艺性状无显著性差异；OsCKX3基因过表后叶夹角变大、千粒重减少、结实率略微减低、株高变矮、穗粒数减少，其他农艺性状无显著性差异，表明OsCKX3基因可以作为育种改良潜在的基因资源。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 水稻OsCKX3基因在调控水稻叶夹角中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaggttg ccatggtctg cacaagagtt aacctgctca tcctcatcct ttctctctgc 60

tccccataca agtttataca gagccccatg gactttggcc ctttgaacct ccttcccacc 120

accaccactg catccagtga ctttggtaga atcctcttcc actccccatc tgcagttcta 180

aagccccaag ctccaaggga tatatccctg cttctcagct tcctctctgc ctcacctctt 240

ggcaaggtga cggtggcagc caggggagca ggtcactcca tccatggaca ggcacaggcc 300

cttgatggca ttgtagtgga gatgagctcc ttgccttctg agattgaatt ctacagaaga 360

ggagaaggag atgtttctta tgctgatgtg ggtggtggaa tcatgtggat tgagcttctg 420

gagcagagct tgaagcttgg gctggctcca aggtcttgga ctgattacct ctatctcacc 480

attggtggaa ccttgtccaa tgctggcatc agtgggcaga cattcaagca tggacctcag 540

attagcaatg ttctacagct ggaagtagtc acaggcaggg gtgagattgt gacctgttca 600

cccaccaagg atgcagagct attcaatgct gttcttggag gccttgggca gttcggcatc 660

attactaggg caaggatcct gctgcaggaa gctccacaga aagtgaagtg ggttagagcc 720

ttctatgatg atttcgccac cttcaccaaa gaccaggagt tgctggtgtc aatgccggtt 780

ttggtggact atgtggaagg tttcatcgtg ttgaatgagc aatcccttca cagctcctcc 840

attgccttcc ctacaaatgt tgacttcaac ccagattttg gcaccaagaa caaccctaag 900

atctactact gcatagagtt tgctgtccac gattaccaga acaagaacat caatgtggaa 960

caggtcgtgg aagtcatctc aaggcagatg agccacatag catcccactt gtatagcgtg 1020

gaggtgtcct actttgattt tctcaacagg gttaggatgg aggagatgag ccttaggaac 1080

agtgggctct gggaggtgca ccatccatgg ttgaacatgt tcgtgccaag cgctgggatt 1140

agtgacttca gggacctgct catggacagc atctcaccgg ataacttcga gggcctcatc 1200

ctcatctacc cactcctcag acacaagtgg gacaccaaca cgtcggtcgt gttaccggac 1260

tccgggtcga cggaccaggt gatgtacgcg gtgggcatcc tccggtcggc gaaccccgac 1320

gacgggtgct cccaccactg cctccaggag ctcctcctcc gccaccgccg cctcgccggc 1380

gccgccgcgt cgggcctcgg cgcgaagcag tacctcgccc accacccgac cccggccggc 1440

tggcgccgcc acttcggccg gcggtgggag cggttcgccg atcgcaaggc ccggttcgac 1500

ccgaggtgca tcctcgggcc aggccagggt atattcccca gggacagcag cagcagcaat 1560

ggcgcatttg caagctatag ctga 1584

<210> 2

<211> 527

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Val Ala Met Val Cys Thr Arg Val Asn Leu Leu Ile Leu Ile

1 5 10 15

Leu Ser Leu Cys Ser Pro Tyr Lys Phe Ile Gln Ser Pro Met Asp Phe

20 25 30

Gly Pro Leu Asn Leu Leu Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ser Asp Phe

35 40 45

Gly Arg Ile Leu Phe His Ser Pro Ser Ala Val Leu Lys Pro Gln Ala

50 55 60

Pro Arg Asp Ile Ser Leu Leu Leu Ser Phe Leu Ser Ala Ser Pro Leu

65 70 75 80

Gly Lys Val Thr Val Ala Ala Arg Gly Ala Gly His Ser Ile His Gly

85 90 95

Gln Ala Gln Ala Leu Asp Gly Ile Val Val Glu Met Ser Ser Leu Pro

100 105 110

Ser Glu Ile Glu Phe Tyr Arg Arg Gly Glu Gly Asp Val Ser Tyr Ala

115 120 125

Asp Val Gly Gly Gly Ile Met Trp Ile Glu Leu Leu Glu Gln Ser Leu

130 135 140

Lys Leu Gly Leu Ala Pro Arg Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr

145 150 155 160

Ile Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Lys

165 170 175

His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Gln Leu Glu Val Val Thr Gly

180 185 190

Arg Gly Glu Ile Val Thr Cys Ser Pro Thr Lys Asp Ala Glu Leu Phe

195 200 205

Asn Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala

210 215 220

Arg Ile Leu Leu Gln Glu Ala Pro Gln Lys Val Lys Trp Val Arg Ala

225 230 235 240

Phe Tyr Asp Asp Phe Ala Thr Phe Thr Lys Asp Gln Glu Leu Leu Val

245 250 255

Ser Met Pro Val Leu Val Asp Tyr Val Glu Gly Phe Ile Val Leu Asn

260 265 270

Glu Gln Ser Leu His Ser Ser Ser Ile Ala Phe Pro Thr Asn Val Asp

275 280 285

Phe Asn Pro Asp Phe Gly Thr Lys Asn Asn Pro Lys Ile Tyr Tyr Cys

290 295 300

Ile Glu Phe Ala Val His Asp Tyr Gln Asn Lys Asn Ile Asn Val Glu

305 310 315 320

Gln Val Val Glu Val Ile Ser Arg Gln Met Ser His Ile Ala Ser His

325 330 335

Leu Tyr Ser Val Glu Val Ser Tyr Phe Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg

340 345 350

Met Glu Glu Met Ser Leu Arg Asn Ser Gly Leu Trp Glu Val His His

355 360 365

Pro Trp Leu Asn Met Phe Val Pro Ser Ala Gly Ile Ser Asp Phe Arg

370 375 380

Asp Leu Leu Met Asp Ser Ile Ser Pro Asp Asn Phe Glu Gly Leu Ile

385 390 395 400

Leu Ile Tyr Pro Leu Leu Arg His Lys Trp Asp Thr Asn Thr Ser Val

405 410 415

Val Leu Pro Asp Ser Gly Ser Thr Asp Gln Val Met Tyr Ala Val Gly

420 425 430

Ile Leu Arg Ser Ala Asn Pro Asp Asp Gly Cys Ser His His Cys Leu

435 440 445

Gln Glu Leu Leu Leu Arg His Arg Arg Leu Ala Gly Ala Ala Ala Ser

450 455 460

Gly Leu Gly Ala Lys Gln Tyr Leu Ala His His Pro Thr Pro Ala Gly

465 470 475 480

Trp Arg Arg His Phe Gly Arg Arg Trp Glu Arg Phe Ala Asp Arg Lys

485 490 495

Ala Arg Phe Asp Pro Arg Cys Ile Leu Gly Pro Gly Gln Gly Ile Phe

500 505 510

Pro Arg Asp Ser Ser Ser Ser Asn Gly Ala Phe Ala Ser Tyr Ser

515 520 525

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaattcaatc tcagaaggca 20

<210> 4

<211> 1585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaggttg ccatggtctg cacaagagtt aacctgctca tcctcatcct ttctctctgc 60

tccccataca agtttataca gagccccatg gactttggcc ctttgaacct ccttcccacc 120

accaccactg catccagtga ctttggtaga atcctcttcc actccccatc tgcagttcta 180

aagccccaag ctccaaggga tatatccctg cttctcagct tcctctctgc ctcacctctt 240

ggcaaggtga cggtggcagc caggggagca ggtcactcca tccatggaca ggcacaggcc 300

cttgatggca ttgtagtgga gatgagctcc ttgcccttct gagattgaat tctacagaag 360

aggagaagga gatgtttctt atgctgatgt gggtggtgga atcatgtgga ttgagcttct 420

ggagcagagc ttgaagcttg ggctggctcc aaggtcttgg actgattacc tctatctcac 480

cattggtgga accttgtcca atgctggcat cagtgggcag acattcaagc atggacctca 540

gattagcaat gttctacagc tggaagtagt cacaggcagg ggtgagattg tgacctgttc 600

acccaccaag gatgcagagc tattcaatgc tgttcttgga ggccttgggc agttcggcat 660

cattactagg gcaaggatcc tgctgcagga agctccacag aaagtgaagt gggttagagc 720

cttctatgat gatttcgcca ccttcaccaa agaccaggag ttgctggtgt caatgccggt 780

tttggtggac tatgtggaag gtttcatcgt gttgaatgag caatcccttc acagctcctc 840

cattgccttc cctacaaatg ttgacttcaa cccagatttt ggcaccaaga acaaccctaa 900

gatctactac tgcatagagt ttgctgtcca cgattaccag aacaagaaca tcaatgtgga 960

acaggtcgtg gaagtcatct caaggcagat gagccacata gcatcccact tgtatagcgt 1020

ggaggtgtcc tactttgatt ttctcaacag ggttaggatg gaggagatga gccttaggaa 1080

cagtgggctc tgggaggtgc accatccatg gttgaacatg ttcgtgccaa gcgctgggat 1140

tagtgacttc agggacctgc tcatggacag catctcaccg gataacttcg agggcctcat 1200

cctcatctac ccactcctca gacacaagtg ggacaccaac acgtcggtcg tgttaccgga 1260

ctccgggtcg acggaccagg tgatgtacgc ggtgggcatc ctccggtcgg cgaaccccga 1320

cgacgggtgc tcccaccact gcctccagga gctcctcctc cgccaccgcc gcctcgccgg 1380

cgccgccgcg tcgggcctcg gcgcgaagca gtacctcgcc caccacccga ccccggccgg 1440

ctggcgccgc cacttcggcc ggcggtggga gcggttcgcc gatcgcaagg cccggttcga 1500

cccgaggtgc atcctcgggc caggccaggg tatattcccc agggacagca gcagcagcaa 1560

tggcgcattt gcaagctata gctga 1585

<210> 5

<211> 1559

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggaggttg ccatggtctg cacaagagtt aacctgctca tcctcatcct ttctctctgc 60

tccccataca agtttataca gagccccatg gactttggcc ctttgaacct ccttcccacc 120

accaccactg catccagtga ctttggtaga atcctcttcc actccccatc tgcagttcta 180

aagccccaag ctccaaggga tatatccctg cttctcagct tcctctctgc ctcacctctt 240

ggcaaggtga cggtggcagc caggggagca ggtcactcca tccatggaca ggcacaggcc 300

cttgatggca ttctgagatt gaattctaca gaagaggaga aggagatgtt tcttatgctg 360

atgtgggtgg tggaatcatg tggattgagc ttctggagca gagcttgaag cttgggctgg 420

ctccaaggtc ttggactgat tacctctatc tcaccattgg tggaaccttg tccaatgctg 480

gcatcagtgg gcagacattc aagcatggac ctcagattag caatgttcta cagctggaag 540

tagtcacagg caggggtgag attgtgacct gttcacccac caaggatgca gagctattca 600

atgctgttct tggaggcctt gggcagttcg gcatcattac tagggcaagg atcctgctgc 660

aggaagctcc acagaaagtg aagtgggtta gagccttcta tgatgatttc gccaccttca 720

ccaaagacca ggagttgctg gtgtcaatgc cggttttggt ggactatgtg gaaggtttca 780

tcgtgttgaa tgagcaatcc cttcacagct cctccattgc cttccctaca aatgttgact 840

tcaacccaga ttttggcacc aagaacaacc ctaagatcta ctactgcata gagtttgctg 900

tccacgatta ccagaacaag aacatcaatg tggaacaggt cgtggaagtc atctcaaggc 960

agatgagcca catagcatcc cacttgtata gcgtggaggt gtcctacttt gattttctca 1020

acagggttag gatggaggag atgagcctta ggaacagtgg gctctgggag gtgcaccatc 1080

catggttgaa catgttcgtg ccaagcgctg ggattagtga cttcagggac ctgctcatgg 1140

acagcatctc accggataac ttcgagggcc tcatcctcat ctacccactc ctcagacaca 1200

agtgggacac caacacgtcg gtcgtgttac cggactccgg gtcgacggac caggtgatgt 1260

acgcggtggg catcctccgg tcggcgaacc ccgacgacgg gtgctcccac cactgcctcc 1320

aggagctcct cctccgccac cgccgcctcg ccggcgccgc cgcgtcgggc ctcggcgcga 1380

agcagtacct cgcccaccac ccgaccccgg ccggctggcg ccgccacttc ggccggcggt 1440

gggagcggtt cgccgatcgc aaggcccggt tcgacccgag gtgcatcctc gggccaggcc 1500

agggtatatt ccccagggac agcagcagca gcaatggcgc atttgcaagc tatagctga 1559

<210> 6

<211> 2810

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtccattagc accaccaaat tccattggtg tattctcttc agtggcgcac agtcacactg 60

catgcacact atggaagggg agaaaaggca atgcaatgct ctctgttggc atgaaaactt 120

gagctgtagt agtaggtcag gaccaccatt gtactctacc agccatatgt aagatgatgc 180

gcccggcgag tgtcctgagg ctataaagcc cgaatctcct tgggcccaac cacaccatgg 240

cttttcatcc tcccaatacc aagtagttcc aaaaactaaa gggggggact cagtggaaag 300

ggtgtgcctg ctcttttcca tacagatttg tgttcatcaa tggcgtaggg gatctcatga 360

ggtcattggg ctctttgcaa gtggggagga aaagggagat ctaggaacga cttagtggcc 420

cacctttttt tctcttcctt ttttcccaca aggacgagct catggattgg agaaggaaag 480

cgattctgca tttgggtctc aaatcttggg gaagatcatg tagtgtactc tccactcaat 540

cggcaatgag gcattttgtt attgcgtgat ggcaccctga ccctgatgat catgcatagg 600

ccaaagatat cagacgtgag agacctggtc tatatgtatg tggtcactag gataggatgc 660

taacagcctt gtgcggtttt tcttttcttc aagctttcgg tttatcgtca cacctctaga 720

tatttgcagg ttacacagtt acagcactaa ttttggacgg cttggctttg cttagttagt 780

ggctggtttg caagttttaa ggtatatttg caatatgcga tggcaatgaa attattctca 840

agcgcttgat agacaatact agggtacaca tcaacatcaa gctcatgccg tatcttattt 900

tacttggaaa ctttggaatg gagatatgat tattaagtat atgttcctta gttgtttaag 960

ctcttcttag cttgggattt ctaaaggaaa aatattgtgc tgcttggagc agttgcacaa 1020

aatattgact ataggtttat gtcttctata atgatttcag tatgtgctga tgtattcagg 1080

taggcaatgt aatgttactc ttcattgtaa aagttcagtg ggatattgga cgtaatctcc 1140

actgatactt ggtctgttct tttaaaagac ttttctttca tccatggcaa acatttcagc 1200

tatttgatac tgttgtacga ttctattctt gacattggta atgacccaac tagattatat 1260

tcccttggca gcagattgct tccgaatgaa gacaagataa catattgtaa ggttctcttt 1320

tttcttgcaa actgcagttg caacgcaatt cctaaacata acaaaaagcc tgagaattaa 1380

tatcgtaagt gcggaaatgt caactgcttt ctatcaaaag aaaagtagct atagggataa 1440

gaaaaactaa tcatatatat aatagcaaca tgcttctttc caatgcacgt tggcagagaa 1500

tgaaaaagta gataaacaat ttcctggatg agtcagctaa gttttgccgc atcatcaaat 1560

tcataaggta gagaaacctt ctttcttttt tgttgaagat ctggaactca aactttgttt 1620

tgtcattagg ttatggtggt gttacttgac gatgagtgga cttcttttta tatcagagaa 1680

atgcaacaac cttctaactt caccaagaca agtaagcata tttgtcttca gttctatatt 1740

tatatatatc taatctcctt catgaaacaa atggagtagg ttttctgcgc ttgctgttaa 1800

gttgtatcca gccacacaat ccgtgggcat cctccttggc atgggtggtg gccaatcttc 1860

ttcagtgagc ctgggaccct gtgaacagta ttacacaaca gtaaccctgc aaaagatttg 1920

ggtatctaag agctgaggcc caactggtga tcggtggtca agggcaacag gaggagccat 1980

ggagattggc tctccttaaa agactggtgg atgtggatca gaacagcccg ggagaagcaa 2040

aaggtaaagg ttaatccgga tttccttgtg agctcaataa tctgagtatg atcgtcttct 2100

ccattggctg tttgaatgta ttcaacacat gcttggtata gagagttgag agggagagag 2160

aaggtgagat cgagctgatg aaaataaaat cacatggacc tctttttggt acagtcttcg 2220

gaagcaggag agagtgtgtg cagtgtgatc ttatattgtc tttgctcctt tcctttggca 2280

ggagagcctt gcttgcaggc atgcacttgc ccagttgtcc tcttcctctg tcctcattta 2340

tattgtgcgg gtttgtttca gctgttttcc cttcagagag agagagagag agagagagct 2400

agtgctccta ggaggggggg gggggagggg ttgaagatca catggtgacc tttttttggg 2460

tatgtgacag cttcttcctt tagtctttta gtgcttcctt ttatctcctc ttcctcatga 2520

aacccctttc aaaacctcat agcctcatca gctgatcact gagtgccttc tccttctcct 2580

cctcctttaa gaaccctctt ccctgcccat ccttttcttc atcccctcaa ctttgcctaa 2640

aaggcaagaa caaagccata tgattctctg atcccttctt ccaagctgca tcccaacaca 2700

acacattgtg gtgacacagc aaacataata tacacacatc ctcttcttct tctaccaccc 2760

tccatattcc tgcaagaaac aactggagga agaatcacta ctccaacacc 2810

Claims

1.水稻基因OsCKX3或其编码的蛋白在水稻作物改良中的应用，其特征在于：调控水稻叶夹角。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：调控水稻叶枕发育和叶夹角、改善水稻株型和提高水稻产量。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述水稻基因OsCKX3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；还包括与其互补，同源，或该序列经过插入、突变几个核苷酸而形成的具有相同功能的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基因OsCKX3编码的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

5.根据权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于：敲除OsCKX3基因，使得水稻叶夹角变小、籽粒增大。

6.根据权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于：过表达OsCKX3，使得水稻叶夹角增大。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：osckx3突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5的任一所示。

8.一种用于编辑水稻OsCKX3基因的gRNA靶序列在调控植物叶夹角中的应用，其特征在于：所述gRNA靶序列为水稻OsCKX3基因的CDS正义链的第332～351位，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。