CN112795573A

CN112795573A - 水稻OsPPR34的基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN112795573A
Application number: CN202011480321.8A
Authority: CN
Inventors: 夏辉; 熊杰; 侯桂花; 罗志; 李天菲; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112795573B

Abstract

本发明提供了本一种从水稻DNA中分离克隆的与水稻株型与避旱性相关的OsPPR34基因。该基因编码的蛋白含有PPR(pentatricopeptide repeat)家族保守的P结构域，参与线粒体基因的RNA编辑。OsPPR34基因通过赤霉素途径调控水稻株高，同时改变根的向重性，其敲除突变体的深根比显著提高，并在根管实验中表现出较高的避旱性。本发明的OsPPR34基因调控水稻株高与避旱性，其敲除突变体株高下降，并且具有较高的深根比，可应用于改良栽培稻株型与提高栽培稻避旱性。

Description

水稻OsPPR34的基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种与水稻生产及抗逆性相关的基因，具体涉及一种新的与水稻株高及避旱性相关的基因OsPPR34及其应用。

背景技术

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物，为全球超过50％的人口提供粮食，也是我国最主要的口粮。因此如何在全球环境变化的形势下，提高水稻的产量与抗逆能力，是保障我国粮食安全的有效手段。株高，是水稻的重要农艺性状之一。栽培稻的驯化史中，降低水稻株高、减少水稻倒伏危害、提高收获指数，是一个很重要内容。上个世纪60年代的“绿色革命”中水稻半矮杆基因资源的应用，使当时的水稻产量提高了一倍以上。在水稻株高的调控中，赤霉素(GA)，特别是赤霉素的活性形式(GA4)发挥着重要的正调控作用；许多基因，都是通过赤霉素途径影响水稻株高。所以，调控株高的基因，是水稻育种中重要的基因资源，有着重大的应用前景。

另一方面，水稻长期适应于水田种植环境，需水量大，对干旱敏感，干旱缺水严重影响了水稻的生长、发育和生产，导致水稻减产甚至绝收。利用现代生物学技术研究作物抗旱的生理、生化反应及其遗传学机制，克隆重要的抗旱基因，进而通过传统育种方式或现代生物技术转入到作物中改良其抗旱性，培育抗旱水稻新品种，是在全球日益严峻的干旱缺水问题下保障水稻生产、缓解粮食安全问题的有效途径。基于水稻根系构形的避旱性是水稻抗旱性的重要组成部分。其中深根性是避旱性的重要性状之一，深根性受根尖向重性影响，较高的深根性有利于水稻在遭遇干旱时根系向下发展，吸取更多的水分，使水稻避开干旱，实现稳产。

线粒体是植物细胞内最重要的能量代谢场所之一，调控植物的生长发育与环境适应。有研究表明，与线粒体呼吸作用相关的基因表达与水稻深根比之间存在关联。另外，水稻线粒体功能缺陷的突变体，也经常会出现株高变矮的表型，因此与线粒体功能相关的基因，可能会参与到水稻株高调控与根系构形。

线粒体的成熟与行使正常功能很大程度上依赖于线粒体基因转录后的RNA编辑。RNA编辑是指在基因转录产生的mRNA分子水平上发生的碱基变化，包括核苷酸的插入、缺失和置换等不同方式，导致其翻译产生的蛋白质氨基酸组成也发生变化的现象。在高等植物中，线粒体基因的RNA编辑主要以C-U的变化为主。目前已在水稻线粒体上发现了491个编辑位点，涉及几乎所有重要蛋白编码基因。线粒体基因的RNA编辑通常需要核编码的PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白的参与。PPR蛋白是一个保守的蛋白家族，具有35个简并氨基酸作为重复单元串联排列组成的蛋白。它是一种RNA结合蛋白，由核基因编码，转录后进入线粒体参与线粒体基因转录后的编辑、剪接。目前，已在水稻基因组中鉴定出491个编码PPR蛋白的基因。这些PPR基因中，分别有下75个和73个在盐胁迫和干旱胁迫下表达上调，说明水稻中的PPR蛋白可能参与环境适应。目前已经证实有至少7个PPR基因通过ABA通路或ROS通路影响到植物的环境适应，包括5个拟南芥PPR基因与2个水稻PPR基因。除此之外，目前已报道的可以影响植物株高的PPR基因多达十多个，但是否与赤霉素途径相关，未见相关报道。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种用于水稻OsPPR34的基因，并寻求其在抗逆性中的应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

水稻OsPPR34基因在调控水稻抗逆性中的应用，所述水稻OsPPR34基因的序列选自：

SEQ ID NO:3所示的DNA序列；或

与SEQ ID NO:3至少90％同源的DNA序列；或

功能相当于SEQ ID NO:3所示序列的亚片段。

在其中一些实施例中，所述水稻OsPPR34基因为SEQ ID NO:3所示的DNA序列基于CRISPR-Cas9技术的敲除突变体。

在其中一些实施例中，所述敲除突变体选自突变体A、突变体B或突变体C；

所述突变体A在水稻OsPPR34基因转录起始子后第520处有10个碱基的缺失；

所述突变体B在水稻OsPPR34基因转录起始子后第527处有1个碱基的插入；

所述突变体C在水稻OsPPR34基因转录起始子后第527处有1个碱基的缺失。

在其中一些实施例中，所述调控水稻抗逆性为：降低水稻的株高和/或提高水稻的避旱性。

在其中一些实施例中，通过降低水稻的活性赤霉素含量所述降低水稻的株高。

在其中一些实施例中，通过影响水稻根尖向重性所述提高水稻的避旱性。

本发明的目的还在于提供一种用于水稻OsPPR34的基因编码的蛋白，具体技术方案如下：

水稻OsPPR34基因编码的蛋白在调控水稻抗逆性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者为所述SEQ ID NO:4序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体中的一种，或者所述蛋白由上述任一项所述的水稻OsPPR34基因编码得到。

本发明的目的还在于提供一种用于水稻OsPPR34的基因的定点编辑系统，具体技术方案如下：

一种水稻OsPPR34基因的定点编辑系统，其特征在于，包括：sgRNA靶点序列、靶序列引物、边切边连反应体系和重组载体；

所述sgRNA靶点序列为：SEQ ID NO:5；

所述靶序列引物包括：SEQ ID NO:6-9。

在其中一些实施例中，所述重组载体为Ti质粒或植物病毒载体。

在其中一些实施例中，所述重组载体为线性化pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体

本发明的目的还在于提供一种用于水稻OsPPR34的基因的定点编辑的工程菌，具体技术方案如下：

一种工程菌，所述工程菌为含有如上述的水稻OsPPR34基因的定点编辑系统。

在其中一些实施例中，所述工程菌为农杆菌EHA105。

本发明的目的还在于提供一种具有抗逆性的水稻，具体技术方案如下：

一种具有抗逆性的水稻，其特征在于，包含如上所述的水稻OsPPR34基因，或如上所述的水稻OsPPR34基因编码的蛋白。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明中的OsPPR34基因，克隆自水稻第7号染色体。利用的CRISPR-Cas9技术创制的OsPPR34功能缺失突变体内活性赤霉素(GA4)含量下降，株高显著变矮，根的向重性减弱，但深根比更高。因此，OsPPR34基因具有调控株高与避旱性的双重作用，在水稻育种中有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明利用ClustalW2软件将OsPPR34(基因号：Os07g0598500或LOC_Os07g40750)基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果。

图2为本发明的OsPPR34基因基于Crisper-Cas9技术创制的敲除突变体的基因序列(a)与蛋白质序列(b)变化。

图3为本发明的OsPPR34基因的线粒体定位结果。

图4为本发明OsPPR34基因敲除突变体相对于野生型在线粒体基因ccmFc编辑位点上RNA编辑效率的变化。

图5为本发明OsPPR34基因敲除突变体与野生型在株高及活性赤霉素(GA4)含量的差异。

图6为本发明OsPPR34基因敲除突变体与野生型的根尖向重性(a)、深根比(b)及根管干旱胁迫实验中的抗旱表型(c，d)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下面通过实施例对本发明进行详细介绍：

实施例1水稻OsPPR34基因的克隆

1.幼苗培育

将水稻品种日本晴置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA分离：

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A+试剂的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μL RNase-free ddH2O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.逆转录合成第一链cDNA

(1)反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如下：

37℃反应15min后，加入0.25μL 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

(2)第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：

DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系：

将上反应体系于42℃温育15min；然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。4.水稻OsPPR34基因编码区(CDS)扩增

通过对水稻基因组及全长基因数据库进行搜索，获得水稻OsPPR34(基因号：Os07g0598500/LOC_Os07g40750)编码区(CDS)序列。根据预测信息设计PCR扩增引物。引物序列为：

PPR34-F:ATGGCCGCCTCCTCTTCCT，SEQ ID NO:1

PPR34-R:TTACACTGCATCTTTAACCTTCTTTTCTTCTCTC，SEQ ID NO:2

从cDNA中直接克隆获得OsPPR34基因CDS，凝胶回收，连接到pEASY-Blunt载体上，鉴定后进行序列测定，测序结果经拼接与BLAST比对确认。结果显示本发明中的水稻OsPPR34全长CDS的长度为1521bp，详细序列见SEQ ID NO:3。

实施例2水稻OsPPR34的蛋白序列信息与同源性分析

根据本发明新的水稻OsPPR34(基因号：Os07g0598500/LOC_Os07g40750)的ORF推导出水稻OsPPR34的氨基酸序列，共506个氨基酸，分子量为56520道尔顿，详细序列见SEQID NO:4。通过NCBI网站的BLASTP程序比对得出(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，OsPPR34蛋白具有典型的P结构域，属于PPR蛋白家族中的P亚家族。

通过对植物中的部分PPR编码蛋白进行多序列比对，我们发现该类蛋白都含有保守的PPR结构域(图1)。

实施例3水稻基因OsPPR34敲除突变体创制

1.利用CRISPR-Cas9技术构建含有OsPPR34多靶点敲除载体：

(1)引导RNA靶点序列选择与引物设计

根据OsPPR34的基因组序列(基因号：Os07g0598500/LOC_Os07g40750)，设计2个sgRNA。20nt的核苷酸sgRNA靶点序列按照5’-GN₁₉NGG-3’(SEQ ID NO:5)序列进行设计，同时设计靶点序列引物PPR34-gRT+和PPR34-OsU6aT-，其3’端有15-17nt分别与sgRNA和U6a启动子配对。将设计好的sgRNA靶点序列进行水稻基因组数据库比对排除非特异性的靶切位点，具体靶点核苷酸序列如下。

PPR34-1-gRT+:5’-AAGGATCACGCTGTTCACCgttttagagctagaaat-3’，SEQ ID NO:6；

PPR34-1-OsU6aT-:5’-GGTGAACAGCGTGATCCTTCggcagccaagccagca-3’，SEQ ID NO:7；

PPR34-2-gRT+:5’-CTTCTTAACTGCTACACACgttttagagctagaaat-3’，SEQ ID NO:8；

PPR34-2-OsU6aT-:5’-GTGTGTAGCAGTTAAGAAGCggcagccaagccagca-3’，SEQ ID NO:9；(2)接头引物变性退火，将引物稀释到10umol的工作浓度，待用；，

反应体系：1ul PPR34-1-gRT(PPR34-2-gRT)引物+1ul PPR34-1-OsU6aT(PPR34-2-OsU6aT)引物+8ul H₂O；

反应条件：90℃30s，然后自然冷却。

两对引物分别完成。

(3)边切边连反应体系：

反应条件：37℃5min，20℃5min，5个循环；

两对引物分别完成。

(4)边切边连产物作为模板，进行第一轮PCR。采用东洋纺的KOD NEO-plus

此PCR产物命名为u1

此PCR产物命名为g1

反应条件为：98℃，3min；98℃，15s；58℃，20s；68℃，20s；68℃，2min；12℃，10min。30个循环。

第二个靶标重复以上实验，注意引物配对即可(U-F+PPR34-1-OsU6aT；PPR34-1-gRT+gRNA-R)命名为u2，g2。

引物序列为：

U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’，SEQ ID NO:10；

gR-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’，SEQ ID NO:11；

(5)重叠延伸，第4步产物作为模板，用的也是东洋纺的KOD NEO-plus

取2ul u1+2ul g1+16ul ddH₂O混匀(其目的是把第4步产物稀释10倍)，命名为u1+g1

此PCR产物命名为6-T1

第二个靶标重复以上实验，模板为u2+g2

反应条件：同上。

此PCR产物命名为6-T2

反应体系中所需用到的引物序列：

U-GAL:5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATC

GGCAGCAAAGG-3’，SEQ ID NO:12；

Pgs-GAR:5’-TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTATCCA

TCCACTCCAAGCTCTTG-3’，SEQ ID NO:13；

(6)重叠延伸产物纯化(用得是自配的醋酸钠3mol/L,pH5.2)

20ul重叠延伸产物+70ul ddH₂O+10ul 3M醋酸钠，混匀加200ul冰无水乙醇(无水乙醇要在-20℃低温保存一段时间的，离心去上清，75％乙醇洗一遍、离心去上清、风干，加ddH₂O15ul。

(7)边切边连终载体，其体系为：

37℃，酶切10min

再加

T4 DNA连接酶Buffer(NEB) 0.5ul

T4 DNA连接酶(NEB) 0.1ul

反应条件：37℃2min，10℃3min，20℃5min，12-15个循环。

(8)结束后直接进行转化，涂布含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性单克隆进行测序验证。

2.农杆菌转化

(1)根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500μL、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100μL，0.1mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

(2)农杆菌转化，采取冻融法：

向农杆菌感受态细胞(100μL)中加入5μL植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；加入400-800μL YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；室温离心(5000r/min，5min)，保留100μL上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落，挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用1.5％有效浓度次氯酸钠溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

4.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌，挑取阳性单菌落，在1mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成100mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。

6.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mL Hn和1mL Cn(100ppm)。

7.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

8.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

9.转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表1基本培养基成分1

表2基本培养基成分2

10.敲除突变体植株阳性株系的检测

(1)基因组DNA提取：液氮浸泡代测样品叶片，研磨成细粉，装入10mL离心管中，加4mL 56℃预热的1.5×CTAB混匀；快速置于56℃的水浴30min，中间颠倒数次；加入氯仿/异戊醇(24:1)4mL，轻摇30min；4000rpm离心20min，吸取上清3mL至新离心管中(10mL)，加300μL 10％的CTAB(56℃水浴预热)，以及3.3mL的氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒数次；4000rpm离心20min，吸取上清2.7mL至新离心管中(10mL)，加5.4mL 1％CTAB(56℃预热)，轻摇沉淀DNA，4000rpm离心20min，弃上清，加入2mL含1μL RNA酶的1M NaCl溶液，56℃水浴过夜溶解，加入2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA，4000rpm离心5min，弃上清，75％乙醇清洗沉淀，晾干，加100μL灭菌水溶解DNA。

(2)敲除突变体OsPPR34基因的PCR扩增与克隆测序：同实施例1-4。

结果显示：针对3个敲除突变体OsPPR34基因的序列分析，我们发现突变体1在基因转录起始子后第520处有10个碱基的缺失，突变体2在基因转录起始子后第527处有1个碱基的插入，突变体3在基因转录起始子后第527处有1个碱基的缺失(图2a)。3个突变体DNA序列的碱基缺失，均会导致翻译过程提前终止，形成不完整的PPR34蛋白(图2b)。突变体中的OsPPR34成功被敲除。

实施例4.OsPPR34的亚细胞定位

(1)水稻RNA的提取及cDNA反转同实施例1。

(2)针对PPR34的基因序列设计引物PPR34-F和PPR34-R

PPR34-F GGACAGCCCAGATCAACTAGTATGGCCGCCTCCTCTTCC，SEQ ID NO:14

PPR34-R AGCTCCGGACTTAAGACTAGTCACTGCATCTTTAACCTT，SEQ ID NO:15

(3)以步骤1中的cDNA为模板，扩增OsPPR34的cDNA片段并连接到pAN580载体上，使OsPPR34与GFP融合，将OsPPR34-GFP表达载体和线粒体标记基因GmAOX1-RFP在水稻原生质体中瞬时表达后，用激光共聚焦显微镜(FV10)观察荧光。。

结果显示：带绿色荧光的OsPPR34蛋白与带红色荧光标记的GmAOX1蛋白有部分重合(图3)，因此OsPPR34可以进入水稻线粒体。

实施例5敲除突变体材料线粒体基因RNA编辑效率的检测

(1)水稻RNA的提取及cDNA反转同实施例1。

(2)以步骤1中的cDNA为模板，将线粒体基因ccmFc分为4段进行PCR扩增。相关引物如下表所示：

PCR扩增，采用20ul体系：

PCR扩增条件为：95℃ 3min，95℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 1min，72℃ 5min，10℃保存。

(3)针对扩增产物凝胶回收，连接到pEASY-Blunt载体上，转化大肠杆菌后挑30个单克隆进行一代测序。在水稻中发生的RNA编辑均为胞嘧啶到尿嘧啶的改变，即C-U，因此我们统计的编辑效率即为同一位点发生编辑后尿嘧啶所占的比例，编辑效率计算公式为：编辑效率＝检测到为U的克隆数量/(检测到为U+检测到为C的克隆的数量)。

结果显示：在3个敲除突变体中，线粒体ccmFc上均有多个编辑位点C-U的编辑效率发生了显著下降(图4)，表明OsPPR34参与调控ccmFc的RNA编辑。

实施例6 OsPPR34敲除突变体通过影响活性赤霉素(GA4)含量降低水稻株高

(1)OsPPR34敲除突变体对株高的影响：将敲除突变体家系与野生型种子去壳消毒(75％酒精处理1min，1.5％NaClO处理20min，无菌水清洗5次)。然后用清水浸种24h，37℃催芽48小时，挑选发芽好且长势一致的种子，播入秧田，播种20天后插秧。分别在插秧后20天与插秧后50天测量植株株高(10个单株重复以上)。

(2)OsPPR34敲除突变体与野生型活性赤霉素(GA4)含量的测定

2.1赤霉素提取：将插秧后20天的水稻新鲜叶片于液氮中研磨至粉碎，准确称量1g后加入10ml乙腈溶液；4℃提取过夜，4℃，12000g离心5min，取上清；沉淀再次加入5ml乙腈溶液，提取两次，合并所得上清液，加入适量C18及GCB净化其中杂质，4℃，12000g离心5min，取上清；用水浴氮吹仪氮气吹干，以400μl甲醇复溶，过0.22μm有机相滤膜，保存待测。突变体与野生型均设置4个生物学重复。

2.2标准曲线绘制：取甲醇溶液964μl加入1.5ml离心管，加入500μg/ml每种激素标准品储备液各2μl，震荡均匀，配置为终浓度1μg/ml的使用母液以备后续使用。以甲醇溶液配制梯度为0.1、0.2、0.5、2、5、20、50和100ng/mL的GA4标准溶液。GA4的标准品分别购自TRC公司。

2.3对样品与标准品的液相色谱-质谱检测：其中液相色谱实验中，色谱柱采用poroshell120SB-C18反相色谱柱(2.1mm×150mm，2.7μm)；柱温：30℃；流动相：A﹕B＝(甲醇/0.1％甲酸):(水/0.1％甲酸)；洗脱梯度：0-1min，A＝20％；1-3min，A递增至50％；3-9min，由50％递增至80％；9-10.5min，A＝80％；10.5-10.6，A递减至20％；10.6—13.5min，A＝20％；进样体积：2μL。质谱测试中：气帘气为15psi；喷雾电压：4500V；雾化气压力：65psi；辅助气压力：70psi；雾化温度：400℃。最后用高效液相色谱(Aglient1290，美国Aglient)-质谱(SCIEX-6500Qtrap，美国AB)联仪分析赤霉素含量。

结果显示：在插秧后第20天(图5a)与第50天(图5b)，OsPPR34突变体的株高都低于野生型。开花成熟以后，突变体的株高也显著低于野生型(图5c)。同时，在插秧后第20天的新鲜叶片样品中，OsPPR34突变体的GA4含量显著低于野生型(图5d)。上述结果表明，OsPPR34通过影响赤霉素代谢与活性赤霉素GA4的含量调控水稻株高。

实施例7 OsPPR34敲除突变体对避旱性影响的评价

(1)OsPPR34敲除突变体影响水稻根尖向重性：挑选WT和PPR34饱满的种子，放入直径7cm并铺有滤纸的培养皿中，浸种1天后，于30℃培养箱中催芽，将刚刚露白的种子播种在装有0.8％琼脂凝胶的垂直板中。在30℃培养箱中黑暗培养，生长约2天。待同一材料的种子胚根长至2cm左右时，对种子胚根顶端生长方向做切线，记录时间，标记根尖生长位置，并把垂直板旋转90°后立即放入培养箱，2小时后测量根尖弯曲角度以根尖衡量向重性。根尖向重性测量自至少6个生物学重复。

(2)OsPPR34敲除突变体增加了深根比:深根比采用大田“篮子法”进行检测，篮子规格为：顶部直径为17cm，底部直径为10cm，高度为7cm；种植密度为30cm×30cm(两个篮子中心相距的距离)。挑选WT和PPR34饱满的种子播种于96孔PCR板进行种子萌发，萌发一周之后将幼苗移栽至篮子中，每个篮子种植一株水稻。长至50天左右进行深根比的测定，统计浅根数、深根数。数根时，小心地将篮子从田里拔起，在水里去除篮子外的泥土，要避免损伤根系。将穿透篮子底部的根系定义为深根(根系与篮子所在平面角度为50-90°)，将穿透篮子四壁的根系定义为浅根(根系与篮子所在平面角度为0-50°)，深根比即为深根数占总根数的比值。本实施例深根比测定取自6个生物学重复。

(3)OsPPR34突变体的根管抗旱性实验：根管材质为PVC，根管高95cm，直径20cm，从上到下有4对排水孔，分别是第5cm处、30cm处、60cm处和90cm处。根管内栽培介质为细土、细沙和硫酸钾复合肥的混合物，混合比例为25kg：12.5kg：25g。挑选WT和PPR34饱满的种子播种于96孔PCR板进行种子萌发，萌发一周之后将幼苗移栽至根管，每个根管种植一株水稻，移苗前用水将根管灌透，植株分蘖期开始断水处理，断水前将根管一直保水，断水时将两侧的排水孔全部打开。断水后定期测量土壤含水量及植株叶片相对含水量，卷叶5级后复水。本实施例的根管抗旱性实验设置了6个以上生物学重复。

结果显示：相比于野生型，OsPPR34敲除突变体根尖向重性减弱(图6a)，但是深根比增加(图6b)，同时在根管中OsPPR34敲除突变体的卷叶率低于野生型(图6c)，叶片相对含水量要显著高于野生型(图6d)，表明OsPPR34敲除突变体的避旱性增加。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 水稻OsPPR34的基因及其编码蛋白与应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccgcct cctcttcct 19

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttacactgca tctttaacct tcttttcttc tctc 34

<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

atggccgcct cctcttcctt cctcgccgcc ggccgccgcc tgatccgcct cggctgcggc 60

aggctcctcc ccgccggcca cgcgcgatcc catggctcca cccctgccct cattcgagcc 120

gccgccgccg cctcctcccc cgcctctcct cgcggccaca gcggggggag gaagccggcg 180

cggcccccga gcctgcagtc cacgctgtgg ccgctgggcc acccgggcac gctcctggtg 240

ccggagatcg agcggtgggc ggccaagcca ggcaaccgcc tccgccacgt cgagctcgag 300

cgcatcgtca aggagctccg caagcgacgc cgccaccgcc aggccctcga ggtctctgaa 360

tggatgaatg ccaagggaca tgtaaaattt ctgccaaagg atcacgctgt tcacctggat 420

ttgattggtg aaattcatgg aagcagtgca gccgagactt acttcaacaa cctgccagat 480

aaagataaga cagaaaaacc ctatggtgca cttcttaact gctacacacg ggaactcctg 540

gttgaaaaat cgttggctca ttttcagaag atgaaagagt tgggttttgt gttttccaca 600

ctcccctaca acaacatcat gggtctgtat acgaacctag ggcagcatga aaaggttcct 660

tcagtaattg cagagatgaa aagcaatggt atcgttcctg acaatttcag ctacagaata 720

tgcattaact cttatggcac aagggctgat tttttcggga tggaaaacac ccttgaagag 780

atggagtgtg aacctaaaat cgttgttgat tggaacacgt atgctgtcgt ggcaagcaac 840

tacattaagg gcaacataag ggagaaagca ttctctgcct taaagaaagc agaagcaaaa 900

ataaatataa aagattcaga ttcctataac cacctgattt ccttgtatgg acatctgggg 960

gacaaatcag aggtcaatag gctgtgggcg ctccaaatgt cgaactgcaa taggcatatt 1020

aataaggatt acactacaat gcttgcagtg ctcgtgaaac ttaatgagat tgaagaagct 1080

gaagtgttgc tgaaagagtg ggagtcgagc ggaaatgcat ttgacttcca agttccaaat 1140

gtcctgctca ctggataccg ccagaaggac ttgctggaca aggctgaggc acttctggat 1200

gatttcttga agaagggaaa gatgcctcct tcaaccagct gggcaattgt ggcagctggc 1260

tatgcggaga aaggtgatgc tgcgaaagca tatgagctga caaagaatgc cctatgtgta 1320

tatgctccaa atactggttg gatccctagg cctgggatga ttgagatgat acttaagtat 1380

cttggagatg aaggtgatgt cgaggaggtt gaaattttcg ttgatctgct gaaagttgct 1440

gtgccactga actcagatat gactgacgct ttgtcaaggg ctcgaatgag agaagaaaag 1500

aaggttaaag atgcagtgta a 1521

<210> 4

<211> 506

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 4

Met Ala Ala Ser Ser Ser Phe Leu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ile Arg

1 5 10 15

Leu Gly Cys Gly Arg Leu Leu Pro Ala Gly His Ala Arg Ser His Gly

20 25 30

Ser Thr Pro Ala Leu Ile Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ala

35 40 45

Ser Pro Arg Gly His Ser Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Pro Pro Ser

50 55 60

Leu Gln Ser Thr Leu Trp Pro Leu Gly His Pro Gly Thr Leu Leu Val

65 70 75 80

Pro Glu Ile Glu Arg Trp Ala Ala Lys Pro Gly Asn Arg Leu Arg His

85 90 95

Val Glu Leu Glu Arg Ile Val Lys Glu Leu Arg Lys Arg Arg Arg His

100 105 110

Arg Gln Ala Leu Glu Val Ser Glu Trp Met Asn Ala Lys Gly His Val

115 120 125

Lys Phe Leu Pro Lys Asp His Ala Val His Leu Asp Leu Ile Gly Glu

130 135 140

Ile His Gly Ser Ser Ala Ala Glu Thr Tyr Phe Asn Asn Leu Pro Asp

145 150 155 160

Lys Asp Lys Thr Glu Lys Pro Tyr Gly Ala Leu Leu Asn Cys Tyr Thr

165 170 175

Arg Glu Leu Leu Val Glu Lys Ser Leu Ala His Phe Gln Lys Met Lys

180 185 190

Glu Leu Gly Phe Val Phe Ser Thr Leu Pro Tyr Asn Asn Ile Met Gly

195 200 205

Leu Tyr Thr Asn Leu Gly Gln His Glu Lys Val Pro Ser Val Ile Ala

210 215 220

Glu Met Lys Ser Asn Gly Ile Val Pro Asp Asn Phe Ser Tyr Arg Ile

225 230 235 240

Cys Ile Asn Ser Tyr Gly Thr Arg Ala Asp Phe Phe Gly Met Glu Asn

245 250 255

Thr Leu Glu Glu Met Glu Cys Glu Pro Lys Ile Val Val Asp Trp Asn

260 265 270

Thr Tyr Ala Val Val Ala Ser Asn Tyr Ile Lys Gly Asn Ile Arg Glu

275 280 285

Lys Ala Phe Ser Ala Leu Lys Lys Ala Glu Ala Lys Ile Asn Ile Lys

290 295 300

Asp Ser Asp Ser Tyr Asn His Leu Ile Ser Leu Tyr Gly His Leu Gly

305 310 315 320

Asp Lys Ser Glu Val Asn Arg Leu Trp Ala Leu Gln Met Ser Asn Cys

325 330 335

Asn Arg His Ile Asn Lys Asp Tyr Thr Thr Met Leu Ala Val Leu Val

340 345 350

Lys Leu Asn Glu Ile Glu Glu Ala Glu Val Leu Leu Lys Glu Trp Glu

355 360 365

Ser Ser Gly Asn Ala Phe Asp Phe Gln Val Pro Asn Val Leu Leu Thr

370 375 380

Gly Tyr Arg Gln Lys Asp Leu Leu Asp Lys Ala Glu Ala Leu Leu Asp

385 390 395 400

Asp Phe Leu Lys Lys Gly Lys Met Pro Pro Ser Thr Ser Trp Ala Ile

405 410 415

Val Ala Ala Gly Tyr Ala Glu Lys Gly Asp Ala Ala Lys Ala Tyr Glu

420 425 430

Leu Thr Lys Asn Ala Leu Cys Val Tyr Ala Pro Asn Thr Gly Trp Ile

435 440 445

Pro Arg Pro Gly Met Ile Glu Met Ile Leu Lys Tyr Leu Gly Asp Glu

450 455 460

Gly Asp Val Glu Glu Val Glu Ile Phe Val Asp Leu Leu Lys Val Ala

465 470 475 480

Val Pro Leu Asn Ser Asp Met Thr Asp Ala Leu Ser Arg Ala Arg Met

485 490 495

Arg Glu Glu Lys Lys Val Lys Asp Ala Val

500 505

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaggatcacg ctgttcaccg ttttagagct agaaat 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtgaacagc gtgatccttc ggcagccaag ccagca 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttcttaact gctacacacg ttttagagct agaaat 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgtgtagca gttaagaagc ggcagccaag ccagca 36

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accggtaagg cgcgccgtag tgctcgacta gtatggaatc ggcagcaaag g 51

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tagctcgaga ggcgcgccaa tgataccgac gcgtatccat ccactccaag ctcttg 56

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggacagccca gatcaactag tatggccgcc tcctcttcc 39

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agctccggac ttaagactag tcactgcatc tttaacctt 39

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcagcacccg tactattgaa atgg 24

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccccatggat tcgataataa rgaaatga 28

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gccgccctat tctattacca gaca 24

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtgtttggcc tttacttcgg agc 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctttaccac gcgataggtc agc 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtagtcgtga ccaacagcca tca 23

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tctcgatcat ttacatggac ccact 25

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acttcagtcg tgctcctcgt ttc 23

Claims

1.水稻OsPPR34基因在调控水稻抗逆性中的应用，其特征在于，所述水稻OsPPR34基因的序列选自：

SEQ ID NO:3所示的DNA序列；或

与SEQ ID NO:3至少90％同源的DNA序列；或

功能相当于SEQ ID NO:3所示序列的亚片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻OsPPR34基因为SEQ ID NO:3所示的DNA序列基于CRISPR-Cas9技术的敲除突变体。

3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述敲除突变体选自突变体A、突变体B或突变体C；

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述调控水稻抗逆性为：降低水稻的株高和/或提高水稻的避旱性。

5.水稻OsPPR34基因编码的蛋白在调控水稻抗逆性中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者为所述SEQ ID NO:4序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体中的一种，或者所述蛋白为由权利要求1-3任一项所述的水稻OsPPR34基因编码得到。

6.一种水稻OsPPR34基因的定点编辑系统，其特征在于，包括：sgRNA靶点序列、靶序列引物、边切边连反应体系和重组载体；

所述sgRNA靶点序列为：SEQ ID NO:5；

所述靶序列引物包括：SEQ ID NO:6-9。

7.根据权利要求6所述的水稻OsPPR34基因的定点编辑系统，其特征在于，所述重组载体为Ti质粒或植物病毒载体。

8.根据权利要求6或7所述的水稻OsPPR34基因的定点编辑系统，其特征在于，所述重组载体为线性化pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体。

9.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌为含有如权利要求6-8任一项所述的水稻OsPPR34基因的定点编辑系统。

10.一种具有抗逆性的水稻，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的水稻OsPPR34基因，或权利要求5所述的水稻OsPPR34基因编码的蛋白。