CN114277041A

CN114277041A - 大豆赤霉素3β-羟化酶编码基因GmGA3ox1的应用

Info

Publication number: CN114277041A
Application number: CN202111360441.9A
Authority: CN
Inventors: 喻德跃; 黄方; 胡德洲; 王慧; 杨中义; 陆少奇; 李霄
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-11-17
Also published as: CN114277041B; WO2023087761A1; US20230313151A1

Abstract

本发明公开了大豆赤霉素3β‑羟化酶编码基因GmGA3ox1的应用。SEQ IDNO.1所示大豆赤霉素3β‑羟化酶基因GmGA3ox1在基因工程改造拟南芥和大豆粒重的应用。在拟南芥中，过表达GmGA3ox1能互补atga3ox1突变体低粒重的表型。在大豆中，过量表达该基因的优异单倍型，能够显著提高大豆的粒重。

Description

大豆赤霉素3β-羟化酶编码基因GmGA3ox1的应用

技术领域

本发明涉及大豆赤霉素3β-羟化酶编码基因GmGA3ox1的应用，属于基因工程领域。

背景技术

大豆起源于我国，双子叶植物，是重要的油料和粮食作物，为人类和动物提供丰富的蛋白和充分的油脂，具有重要的经济价值。大豆在我国国民经济发展及国际油料作物生产中均占有重要地位。作为一种重要的作物，大豆的产量一直是人们关注的重点。培育高产、优质的大豆品种一直是育种家的首要目标之一。大豆产量的构成可以从两个方面解析，一种是产量由生物量和收获指数组成，二是由单位面积株数、单株荚数、每荚粒数、百粒重构成。大豆产量相关性状是复杂的数量性状，受多基因控制，其性状表现是基因型与环境共同作用的结果。大豆产量影响因素较多，包括生长形态性状、光合生理性状以及产量组分等。其中，大豆的产量组分包括百粒重、单株荚数、单株粒数、单株产量等。

赤霉素(gibberellin，GA)是一种植物激素，对植物的生长发育过程起到至关重要的作用。很多的研究报道表明GA参与调节种子萌发、叶片扩展、开花和果实发育，以及调节环境信号，如日照长度等。在细胞水平上，GA还会刺激细胞伸长和细胞分裂。另外，目前克隆的作物产量及产量相关性状基因功能分析结果表明，多个产量相关基因主要与GA合成或与其调控途径相关。GmGA3ox1是一种大豆赤霉素3β-羟化酶(gibberellin 3β-hydroxylase，GA3ox)。在植物体内，GA3ox是GA合成途径中的关键限速酶，负责合成具有生物活性的赤霉素，是调节活性GA合成的关键因子。然而在大豆中还没有GA3ox基因功能的报道。

发明内容

本发明的目的在于公开大豆赤霉素3β-羟化酶基因GmGA3ox1基因工程改良粒重的应用，组织表达及GUS染色分析表明GmGA3ox1主要在大豆叶片和茎中表达，在其他组织里几乎不表达。GmGA3ox1基因表达量与大豆粒重呈现正相关关系。此外，亚细胞定位分析表明GmGA3ox1 定位在细胞膜及细胞质基质中。该基因可作为目的基因导入拟南芥和大豆中，表现为提高转基因拟南芥和转基因大豆的粒重。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

SEQ ID NO.1所示大豆赤霉素3β-羟化酶基因GmGA3ox1在基因工程改造拟南芥和大豆粒重的应用。

在拟南芥中，过表达GmGA3ox1能互补atga3ox1突变体低粒重的表型。在大豆中，过量表达该基因的优异单倍型，能够显著提高大豆的粒重。

有益效果

我们发现大豆GmGA3ox1基因正调控转基因拟南芥的粒重。通过表达量分析，证明GmGA3ox1 主要在大豆叶片和茎中表达，与大豆粒重呈现正相关关系。亚细胞定位分析证明GmGA3ox1为细胞膜及细胞质基质定位蛋白。过量表达GmGA3ox1发现该基因正调控转基因拟南芥的粒重。由此可见，GmGA3ox1可以作为调节大豆粒重的靶点，用于大豆的产量改造。

附图说明

图1.PCR克隆GmGA3ox1琼脂糖凝胶电泳图。目的片段大小1137bp。Marker：DL2000Plus

图2.GmGA3ox1组织表达模式。N＝3。

图3.GmGA3ox1的表达量与大豆粒重呈正相关关系。

图4.GmGA3ox1转基因拟南芥各组织的GUS染色。N＝3。(A)GmGA3ox1_pro(-1957):GUS转基因拟南芥的GUS染色。(B)GmGA3ox1_pro(-1005):GUS转基因拟南芥的GUS染色。(C)GmGA3ox1_pro (-487):GUS转基因拟南芥

图5.GmGA3ox1蛋白的亚细胞定位分析。GFP，GFP荧光；Light，明场；Merge，融合蛋白； 35S:GFP，空载对照；35S:GmGA3ox1-GFP，带GFP标签的GmGA3ox1蛋白。比例尺：20μm。

图6.atga3ox1突变体中GmGA3ox1的过量表达提高了拟南芥的粒重。(A)4周大的拟南芥野生型(Col-0)、atga3ox1突变体和三个35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因株系的莲座叶表型。 (B)7周大的Col-0、atga3ox1突变体和三个35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因株系的成熟植株表型。(C)Col-0、atga3ox1突变体和三个35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因株系的种子表型。比例尺＝1mm。(D)atga3ox1突变体和三个35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因株系的千粒重比较，N＝9。误差线表示±SEM。统计分析采用双尾t检验。**：P<0.01，***：P<0.001。

图7.过量表达GmGA3ox1的优异单倍型提高了大豆的粒重。(A)Williams 82(W82)和2个 GmGA3ox1-OE转基因株系的种子表型。(B)大豆种子长、宽、高示意图(C)GmGA3ox1在W82 和2个GmGA3ox1-OE转基因株系中的相对表达水平。N＝3。(D)W82和2个GmGA3ox1-OE转基因株系的百粒重。N＝10。(E)W82和2个GmGA3ox1-OE转基因株系的粒长。N＝10。(F)W82和2个GmGA3ox1-OE转基因株系的粒宽。N＝10。(G)W82和2个GmGA3ox1-OE转基因株系的粒高。N＝10。误差线表示±SEM。统计分析采用双尾t检验。**：P<0.01，***：P<0.001。ns：不显著。

图8.转基因拟南芥、大豆PCR检测。(A)GmGA3ox1_pro(-1957):GUS转基因拟南芥检测，目的片段大小1957bp。M：Marker DL2000，P：阳性质粒，ck：拟南芥野生型，1-6：不同的GmGA3ox1_pro (-1957):GUS转基因植株，H₂O：空白对照。(B)GmGA3ox1_pro(-1005):GUS转基因拟南芥检测，目的片段大小1005bp。M：Marker DL2000，P：阳性质粒，ck：拟南芥野生型，1-6：不同的 GmGA3ox1_pro(-1005):GUS转基因植株，H₂O：空白对照。(C)GmGA3ox1_pro(-487):GUS转基因拟南芥检测，目的片段大小487bp。M：Marker DL2000，P：阳性质粒，ck：拟南芥野生型，1-6：不同的GmGA3ox1_pro(-487):GUS转基因植株，H₂O：空白对照。(D)拟南芥atga3ox1突变体的 PCR检测。设定特定的扩增时间，在设定的时间内atga3ox1突变体不能扩增出2000bp大小的片段，而野生型植株Col-0能扩增出2000bp大小的片段。M：Marker DL2000，Col-0：拟南芥野生型Col-0，atga3ox1：拟南芥atga3ox1突变体，H₂O：空白对照。(E)GmGA3ox1转基因拟南芥的PCR检测，目的片段大小1137bp。M：Marker DL2000，Col-0：拟南芥野生型Col-0， atga3ox1：拟南芥atga3ox1突变体，H₂O：空白对照，1-6：不同的35S:GmGA3ox1/atga3ox1 转基因植株。(F)GmGA3ox1转基因大豆的PCR检测，目的片段大小800bp。M：Trans5K DNA Marker， P：阳性质粒，ck：野生型大豆W82，H₂O：空白对照，1-6：不同的GmGA3ox1转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

1)大豆赤霉素3β-羟化酶基因GmGA3ox1的克隆

以大豆品种南农1138-2为取材对象，取其叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP 管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(Total RNA Kit(天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照日本TaKaRa公司提供的反转录试剂盒(TaKaRa Primer Script^TMRT reagent kit，日本)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下PCR程序如下：95℃ 预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃ 保温5分钟，随后12℃恒温，获得南农1138-2的cDNA。

从NCBI数据库和Phytozome v12大豆数据库，找到GmGA3ox1所对应的基因(Glyma.07g033800，GeneID:100795921)，根据数据库提供的核苷酸序列设计特异引物引物，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，从大豆品种南农1138-2的基因编码区(CDS)序列扩增基因，PCR克隆后随后进行PCR产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序，测序后获得具有完整编码区的长度为1137bp的大豆GmGA3ox1基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQ ID NO.1，大小为1137bp(图1)，核苷酸序列和氨基酸序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。

2)GmGA3ox1的组织表达分析

为了鉴定GmGA3ox1在不同组织中的表达水平，采集大豆品种南农1138-2不同发育阶段的根、茎、叶、花、荚和种子：根、茎和叶为V4期；成熟花为R2期；种子和荚在开花后15天采集。样品于液氮速冻后-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以上述各组织取样获得的总RNA为模板，反转为cDNA。GmGA3ox1荧光定量引物序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，检测GmGA3ox1基因在各组织的表达量变化以大豆组成内参基因Tubulin作为内部参照，引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)。

GmGA3ox1主要在大豆叶和茎组织中表达，在根、茎、花、荚和种子中的表达量较低(图2)。

3)GmGA3ox1的表达量与粒重的相关性分析

挑取具有不同粒重的大豆材料39份。种植于温室内。在V4期采集每个大豆材料的倒三叶叶片，样品于液氮速冻后-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以上述各组织取样获得的总 RNA为模板，反转为cDNA。检测GmGA3ox1基因在各个大豆材料的表达量变化以大豆组成内参基因Tubulin作为内部参照，进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)。引物序列见 SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。利用SPSS 20.0软件计算GmGA3ox1的表达量与粒重的相关性。

GmGA3ox1的表达量与粒重的相关性系数r＝0.531，P值为0.0005。表明GmGA3ox1基因的表达量与粒重呈现显著的正相关关系(图3)。

实施例2

1)大豆赤霉素3β-羟化酶基因GmGA3ox1启动子序列的克隆

以大豆品种南农1138-2叶片DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列见SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。PCR程序如下： 95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后 72℃保温5分钟，随后4℃恒温，测序后获得长度为1957bp，1005bp和487bp的GmGA3ox1 基因启动子序列。

2)GUS染色载体的构建

将上述三种GmGA3ox1基因不同长度启动子的序列插入到pCAMBIA1381Z载体，之后通过冻融法将构建完成的载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中。

3)GmGA3ox1的转基因拟南芥GUS染色

利用沾花法转化拟南芥，分别将拟南芥花蕾浸于步骤2)含GmGA3ox1_pro(-1957):GUS， GmGA3ox1_pro(-1005):GUS和GmGA3ox1_pro(-487):GUS的根癌农杆菌菌株EHA105菌液中，侵染 30s～1min。用保鲜膜或保鲜袋包裹植株以保持湿度，暗培养24h。之后可视植株生长状况，待新的一批花序长出后再次转化。将拟南芥放于正常条件下继续生长，收获种子。选择三个纯合的T₃代GmGA3ox1_pro(-1957):GUS，GmGA3ox1_pro(-1005):GUS和GmGA3ox1_pro(-487):GUS转基因拟南芥株系的根、茎、叶、花、荚、种子进行GUS染色。染色所使用的试剂盒来自于北京索莱宝科技有限公司，货号为G3060。为检测转基因拟南芥是否为阳性，分别利用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR检测(检测引物为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)，PCR检测胶图见图8。

GUS染色结果表明，三种类型的GmGA3ox1基因启动子都具有较高的活性，且这三种类型启动子活性最高的组织均位于叶片，其次是茎，花、种子、荚和根(图4)。

实施例3

1)大豆赤霉素3β-羟化酶基因GmGA3ox1的克隆

以大豆品种南农1138-2叶片总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物序列见SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃ 恒温，测序后获得不含终止密码子的大豆GmGA3ox1基因的CDS序列。

2)亚细胞定位载体的构建

将不含终止密码子的大豆GmGA3ox1基因的CDS序列插入到含有GFP标签的pFGC5941表达载体。pFGC5941载体具有35S启动子，可强烈诱导目的基因GmGA3ox1在受体中的表达。之后通过冻融法将构建完成的载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中。同时将空载pFGC5941载体也转化到EHA105中，作为对照。

3)GmGA3ox1的亚细胞定位

将含有35S:GmGA3ox1-GFP和35S:GFP的菌液分别注射到7-8周大小的本氏烟的叶片中，培养36-48小时后用Leica TCS SP2型激光共聚焦显微镜观察报告基因GFP的定位情况。GFP 信号显示，GmGA3ox1-GFP融合蛋白定位于细胞膜及细胞质基质，而空载定位于整个烟草细胞 (图5)。

实施例4基因GmGA3ox1的基因工程应用

1)大豆赤霉素3β-羟化酶基因GmGA3ox1的克隆

分别以大豆品种南农1138-2叶片总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR 扩增，引物序列见SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18。PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃ 恒温，测序后获得具有完整编码区的长度为1137bp的大豆GmGA3ox1基因的CDS序列。另外，以大豆地方品种句容扁青豆叶片总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物序列见SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃ 变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸120秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃ 恒温，测序后获得4187bp的大豆GmGA3ox1基因组序列。

2)植物表达载体的构建

构建转化拟南芥的过表达载体时，将从南农1138-2叶片中扩增得到的GmGA3ox1基因的 CDS序列插入到pBI121表达载体，得到pBI121-GmGA3ox1植物过量表达载体，植物转化载体 pBI121含有35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmGA3ox1在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中。

构建转化大豆的过表达载体时，从大豆地方品种句容扁青豆中扩增GmGA3ox1的4187bp 基因组序列。这4187bp包括1554bp启动子和5’UTR区域、1899bp内含子和外显子区域以及539bp 3的3’UTR区域，将此4187bp片段连接到去除了CaMV 35S启动子的pCAMBIA3301 载体，得到pCAMBIA3301-GmGA3ox1植物过量表达载体。将此载体转化根癌农杆菌菌株 EHA105。

3)转基因拟南芥植株的获得

利用沾花法转化拟南芥，将atga3ox1拟南芥突变体花蕾浸于步骤2)含pBI121-GmGA3ox1 的根癌农杆菌菌株EHA105菌液中，侵染30s～1min。用保鲜膜或保鲜袋包裹植株以保持湿度，暗培养24h。之后可视植株生长状况，待新的一批花序长出后再次转化。将拟南芥放于正常条件下继续生长，收获种子。选择三个纯合的T₃代35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因拟南芥株系进行粒重表型的调查(图6)。为检测是否为atga3ox1拟南芥突变体和是否为过表达 GmGA3ox1转基因拟南芥，分别利用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR检测(SEQ ID NO.21、 SEQ ID NO.22)，PCR检测胶图见图8。

Col-0、atga3ox1突变体和三个35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因株系成熟后，收获种子，并将其在37℃的烘箱中干燥一个星期。种子干燥后，测量Col-0、atga3ox1突变体和三个 35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因株系的千粒重(N＝3)。Col-0株系的千粒重要显著高于 atga3ox1突变体植株(图6D)，证明拟南芥AtGA3ox1基因的突变可以显著降低粒重。另外，三个35S:GmGA3ox1/atga3ox1转基因株系的粒重显著大于atga3ox1突变体植株，略高于 Col-0植株(图6D)，证明在atga3ox1突变体中过量表达GmGA3ox1基因可以提高粒重。

4)转基因大豆植株的获得

利用子叶节转化法转化大豆栽培品种Williams 82，对生长5-6天的大豆叶腋处进行创伤处理，再将步骤2)获得的分别含pCAMBIA3301-GmGA3ox1载体接种到大豆叶腋的伤口处。置于25℃共培养4-5d。然后分别用灭菌的超纯水和Wish-Liquid清洗，放置不含草丁膦的 SIM培养基中，26℃光照培养15d，诱导出芽。15天后更换到加入6mg/L草丁膦的SIM培养基中。而后以15天为周期进行继代，逐步减少草丁膦的剂量。当外植体的芽生长到6cm 左右时，转入生根培养基中培养10d左右，诱导出根。待根系生长好，即可移栽。利用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR检测(SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24)，检测是否为过表达GmGA3ox1的转基因大豆。PCR检测胶图见图8。

获得的转基因大豆植株及其对照播种于花盆中，放置于自然条件下的网室内。收获后将种子在37℃的烘箱中干燥一个星期。种子干燥后，测量W82和两个GmGA3ox1转基因大豆株系的百粒重及粒长、宽、高(N＝10)。两个转基因大豆株系中GmGA3ox1的表达量都要显著高于其在对照W82植株中的表达量(图7C)(引物为SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24)，证明此启动子可以有效的驱动GmGA3ox1的表达。另外，两个GmGA3ox1转基因大豆株系的百粒重、粒长显著大于W82植株，粒宽和粒高和W82植株无明显差异(图7A,B,D-G)，证明过量表达GmGA3ox1的优异单倍型基因可以提高转基因大豆的粒重和粒长。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆赤霉素3β-羟化酶编码基因GmGA3ox1的应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1137

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atgccttctc tctccgaagc ctttagaggt caccccgtgt accttcatca caaacactcc 60

gacttcaact cacttcaaga actccctgac tcttactctt ggacacaacc ccatgatcac 120

catctcccaa attacccttc caacaataag accaagatct ttgtccccgt aatcgatttg 180

aaccacccaa atgctccaaa cctcataggc catgcatgca aaacatgggg tgtgttccaa 240

gtggtgaacc atgacatccc catgagcctc ttcagtgaca ttcagagggc tagtcttgcg 300

ttattctccc ttccccttca ccagaagctc aaagcagctc gctcccccga cggcgtctcc 360

ggctatggcc gcgctcgcat ctcctccttc ttccccaagc tcatgtggtc tgagtgcttc 420

acaattctcg attcccctct tgatcttttc ctcaaactct ggccacaaga ctatgctaaa 480

tactgtgata ttgtcgtgga atatgaagca gccatgaaaa agctagcagc gaaattaatg 540

tgcctcatgt tggcttccct tggaattaca aaggaagaca ctaaatgggc tgggccaaaa 600

ggagaattca atggggcttg tgcggccttg cacttgaatt cttacccgag ttgcccggat 660

ccggatcgag ccatgggtct ggccgcacac accgactcca ctctcctcac aatcctacac 720

caaaacaatg tcaatgggct tcaagttctc aaggaaggag aagggtgggt ggcagtgccg 780

ccgcttcacg gagggctcgt gattaacgtt ggcgatctgc tccacatttt gtcaaacggg 840

ttgtacccga gtgtgctcca tcgggttcgg gtgaaccgaa cccaacagcg gttctcggtt 900

gcttatctat atgggccccc agcaaacgtc caaatcagtc cacatgtcaa gttggtgggc 960

ccaacaaggc ccgctcttta tcgaccagtg acttggaacg agtaccttgg caccaaagca 1020

aaccttttta ataaggctct ttcagcggtt aggctttctg cgtctattaa cggtttgttt 1080

gatataaacg aggatcagaa taacgacttt caagtgggct tcaatctaga tatttag 1137

<210> 2

<211> 378

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Phe Arg Gly His Pro Val Tyr Leu His

1 5 10 15

His Lys His Ser Asp Phe Asn Ser Leu Gln Glu Leu Pro Asp Ser Tyr

20 25 30

Ser Trp Thr Gln Pro His Asp His His Leu Pro Asn Tyr Pro Ser Asn

35 40 45

Asn Lys Thr Lys Ile Phe Val Pro Val Ile Asp Leu Asn His Pro Asn

50 55 60

Ala Pro Asn Leu Ile Gly His Ala Cys Lys Thr Trp Gly Val Phe Gln

65 70 75 80

Val Val Asn His Asp Ile Pro Met Ser Leu Phe Ser Asp Ile Gln Arg

85 90 95

Ala Ser Leu Ala Leu Phe Ser Leu Pro Leu His Gln Lys Leu Lys Ala

100 105 110

Ala Arg Ser Pro Asp Gly Val Ser Gly Tyr Gly Arg Ala Arg Ile Ser

115 120 125

Ser Phe Phe Pro Lys Leu Met Trp Ser Glu Cys Phe Thr Ile Leu Asp

130 135 140

Ser Pro Leu Asp Leu Phe Leu Lys Leu Trp Pro Gln Asp Tyr Ala Lys

145 150 155 160

Tyr Cys Asp Ile Val Val Glu Tyr Glu Ala Ala Met Lys Lys Leu Ala

165 170 175

Ala Lys Leu Met Cys Leu Met Leu Ala Ser Leu Gly Ile Thr Lys Glu

180 185 190

Asp Thr Lys Trp Ala Gly Pro Lys Gly Glu Phe Asn Gly Ala Cys Ala

195 200 205

Ala Leu His Leu Asn Ser Tyr Pro Ser Cys Pro Asp Pro Asp Arg Ala

210 215 220

Met Gly Leu Ala Ala His Thr Asp Ser Thr Leu Leu Thr Ile Leu His

225 230 235 240

Gln Asn Asn Val Asn Gly Leu Gln Val Leu Lys Glu Gly Glu Gly Trp

245 250 255

Val Ala Val Pro Pro Leu His Gly Gly Leu Val Ile Asn Val Gly Asp

260 265 270

Leu Leu His Ile Leu Ser Asn Gly Leu Tyr Pro Ser Val Leu His Arg

275 280 285

Val Arg Val Asn Arg Thr Gln Gln Arg Phe Ser Val Ala Tyr Leu Tyr

290 295 300

Gly Pro Pro Ala Asn Val Gln Ile Ser Pro His Val Lys Leu Val Gly

305 310 315 320

Pro Thr Arg Pro Ala Leu Tyr Arg Pro Val Thr Trp Asn Glu Tyr Leu

325 330 335

Gly Thr Lys Ala Asn Leu Phe Asn Lys Ala Leu Ser Ala Val Arg Leu

340 345 350

Ser Ala Ser Ile Asn Gly Leu Phe Asp Ile Asn Glu Asp Gln Asn Asn

355 360 365

Asp Phe Gln Val Gly Phe Asn Leu Asp Ile

370 375

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgccttctc tctccgaagc ct 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaaatatct agattgaag 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtccacatg tcaagttggt gg 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggttaggct ttctgcgtct a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctcgttcga attcgctttt tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caactgtctt gtcacttggc at 22

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagctatgac catgattact cacatcgata aacgaggttt g 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtgccaagc ttggctgcag attgtgttga atgcttcgg 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagctatgac catgattact cacgatccca acattcgtg 39

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtgccaagc ttggctgcag attgtgttga atgcttcgg 39

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagctatgac catgattacc acctagtgag agagaaagaa gg 42

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agtgccaagc ttggctgcag attgtgttga atgcttcgg 39

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctctagaat gccttctctc tccgaagcct 30

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccgctcgaga atatctagat tgaag 25

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtcgacggta tcgataagct tatgccttct ctctccgaag cc 42

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgctctagaa ctagtggatc cctaaatatc tagattgaag cccac 45

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatatgttg aaactttcct ttgc 24

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgcatgatc aatcatttac 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgccttctc tctccgaagc ct 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagaccggca acaggattca 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agtccacatg tcaagttggt gg 22

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccggcaacag gattcaatct taa 23

Claims

1.大豆赤霉素3β-羟化酶编码基因GmGA3ox1在在基因工程改造拟南芥或大豆粒重的应用，所述的大豆赤霉素3β-羟化酶编码基因GmGA3ox1序列如SEQ ID NO.1所示。