CN115287290B - 组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控水稻种子活力中的应用 - Google Patents

组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控水稻种子活力中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718在调控植物种子活力中的应用。本发明通过分别构建OsJMJ718基因的过表达载体和CRISPR/Cas9敲除载体并转化水稻中花11，分别获得OsJMJ718基因的超表达和功能缺失突变体转基因植株；结果显示，突变OsJMJ718基因影响正常条件下水稻种子萌发及幼苗建成能力，表明OsJMJ718基因调控水稻种子活力，为培育高活力水稻品种奠定了基础，也有利于直播稻生产。

Description

组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控水稻种 子活力中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白OsJMJ718在调控水稻种子活力中的应用。
背景技术
高活力种子在田间具有发芽整齐、成苗快、幼苗生长强等特性。因此，挖掘水稻种子活力关键基因，阐明其调控作用机制，对保障直播稻产量具有重要意义。虽然种子活力对作物生产至关重要，但对种子活力的分子机制仍知之甚少。
人们已经使用了一系列工具来解决这个问题，包括基因图谱、转录组和蛋白质组。据报道，活性氧是种子老化过程中的主要损伤因素之一。脂质过氧化导致细胞膜完整性的丧失也会对种子活力造成损害。此外，能量代谢、RNA修复损伤和蛋白质合成以及DNA降解被认为是影响种子衰老过程中活力损失的因素。水稻种子活力研究方面已有一些报道。调控水稻种子活力、寿命等品质相关性状的数量性状位点(QTLs)已在水稻中得到鉴定。位于染色体2和8上的两个QTLs： qSL-2和qSL-8，可以增加种子的寿命。蛋白质组学和代谢组学研究发现更多与老化过程种子寿命有关的蛋白，包括谷胱甘肽水解蛋白、DNA损伤修复蛋白、胚胎发育后期富含蛋白质(LEA)。脱氢酶和酯酶活性以及抗氧化能力与水稻种子活力呈正相关。研究发现小RNA：miR164c和miR168a也参与调控水稻活力。挖掘和研究更多的种子活力功能基因，解析它们之间的内在联系和分子调控机制，对水稻培育高活力的品种具有重要的理论和现实意义。
组蛋白去甲基化酶是可以脱去组蛋白甲基化的一类酶，主要有LSD1和JmjC 家族去甲基化酶两类，而水稻中则存在着多种JmjC组蛋白去甲基酶。Sun Q等研究发现OsJMJ706参与水稻花发育的调控(Qianwen Sun,Dao-Xiu Zhou.Rice jmjC domain-containinggene JMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organ development[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2016,105(36):13679–13684)；Chen等发现OsJMJ703可特异性逆转水稻中H3K4me，该基因的功能缺失突变影响了茎的伸长和植物的生长(Chen Q,Chen X,Wang Q,Zhang F,Lou Z,Zhang Q,Zhou DX.Structural basis of a histone H3 lysine 4demethylaserequired for stem elongation in rice.PLoS Genet. 2013；9(1):e1003239.doi:10.1371/journal.pgen.1003239.Epub 2013Jan 24.PMID: 23357881；PMCID:PMC3554631.)；Tiantian Li等发现OsJMJ705过表达降低了 H3K27me2/3的静息水平，增强了水稻对细菌性枯萎病病原菌的抗性(Li T,Chen X,Zhong X,Zhao Y,Liu X,Zhou S,Cheng S,Zhou DX.Jumonji C domain protein JMJ705-mediated removal of histoneH3 lysine 27trimethylation is involved in defense-related gene activation inrice.Plant Cell.2013 Nov；25(11):4725-36.doi: 10.1105/tpc.113.118802.Epub2013Nov26.PMID:24280387；PMCID:PMC3875746.)； CN111662926A公开了组蛋白去甲基化酶JMJ708可以水稻抗倒伏性能。组蛋白去甲基化酶OsJMJ718也是JmjC组蛋白去甲基酶家族的成员之一，现有公开其能特异去除组蛋白H3K9位点的甲基化修饰从而激活基因的表达。然而目前关于组蛋白去甲基化酶OsJMJ718对水稻种子活力方面的影响还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供序列如SEQ IDNO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718或氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示组蛋白去甲基化酶OsJMJ718在调控植物种子活力中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明公开了组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控水稻种子活力中的新应用，所述组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述组蛋白去甲基化酶OsJMJ718的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。
本发明通过分别构建OsJMJ718基因的过表达载体和CRISPR/Cas9敲除载体并转化粳稻品种中花11，获得过表达OsJMJ718基因和敲除表达OsJMJ718基因的转基因水稻植株。结果显示，过表达或突变OsJMJ718基因会影响正常条件下种子萌发及幼苗建成能力，具体表现为过表达OsJMJ718基因可提高种子萌发及幼苗建成能力，突变OsJMJ718基因则降低种子萌发及幼苗建成能力；即 OsJMJ718基因功能缺失突变体转基因水稻种子比野生型种子活力低，而过表达OsJMJ718基因的转基因水稻种子比野生型种子活力高，表明OsJMJ718基因正调控水稻种子活力。
因此，本发明提供组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白的以下新用途：
SEQ ID NO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718或SEQ ID NO：2所示组蛋白去甲基化酶OsJMJ718在调控植物种子活力中的应用。
具体地，为通过调控植物中组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718或组蛋白去甲基化酶OsJMJ718的表达水平，进而调控植物种子活力。
SEQ ID NO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718或SEQ ID NO：2所示组蛋白去甲基化酶OsJMJ718在提高植物种子活力中的应用。
SEQ ID NO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718或SEQ ID NO：2所示组蛋白去甲基化酶OsJMJ718在创制高活力的植物种子中的应用。
具体地，为提高植物中去甲基化酶基因OsJMJ718的表达量。
优选地，为构建组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718的过表达载体并转化植株，获得稳定遗传的OsJMJ718过表达转基因植株。
进一步优选地，所述OsJMJ718的过表达载体为pCAMBIA1302-Os718。
具体地，所述过表达载体pCAMBIA1302-Os718的构建，包括以下步骤：
S1.提取植物RNA并逆转录得到cDNA，PCR扩增OsJMJ718基因目的片段；
S2.将上述目的片段克隆到pCAMBIA1302表达载体上，回收PCR产物并转化大肠杆菌，提取阳性克隆的质粒，获得OsJMJ718-OE重组质粒。
具体地，所述重组载体转化植株包括：用含有重组载体的农杆菌转化受体植株，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有抗性的愈伤组织，分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。
本发明还提供含有SEQ ID NO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718的过表达载体或质粒在提高植物种子活力或在创制高活力植物种质中的应用。
优选地，所述植物为水稻。
具体地，所述种子活力指种子的萌发及幼苗建成能力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控种子活力中的新应用，本发明研究显示，过表达或突变OsJMJ718基因会影响正常条件下水稻种子萌发及幼苗建成能力，表明OsJMJ718基因正调控水稻种子活力，为高活力水稻品种的改良提供了理论指导，在农业生产中具有极其重要的价值，有助于水稻品种生育期的改良，对于品种种植区域扩展具有重要意义。
附图说明
图1为野生型水稻中花11(WT)、过表达和敲除突变体中OsJMJ718基因的表达量检测结果。左图：过表达植株中OsJMJ718基因的表达量检测结果；右图：敲除突变体中OsJMJ718基因的表达量检测结果。
图2为OsJMJ718基因编辑载体的构建示意图。
图3为OsJMJ718敲除突变体T0代突变位点序列分析。
图4为野生型水稻中花11(WT)过表达和敲除突变体水稻在的种子活力表型图。A：野生型(WT)与OsJMJ718基因的过表达株系OE-4、OE-12种子萌发第5天的表型；B：野生型(WT)与OsJMJ718基因的敲除株系jmj718-1、jmj718-5 种子萌发第5天的表型；C：野生型(WT)与OsJMJ718基因的过表达株系OE-4、 OE-12、敲除株系jmj718-1、jmj718-5种子直播第7天的表型。
图5为野生型水稻中花11(WT)过表达和敲除突变体水稻在种子活力统计数据表。A：萌发率；B：成苗率；C：T50，萌发率到达50％所需要的天数；D：发芽第7天的根长；E：发芽第7天的芽长。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718过表达转基因水稻的获得
1、水稻RNA提取：采用本领域常规的Trizol法提取水稻RNA。
2、逆转录反应(cDNA合成)
用Takara公司的反转录试剂盒进行逆转录反应，反应体系和反应条件参考试剂盒说明书。
3、目的基因的PCR扩增
根据OsJMJ718基因的CDS，将该基因连接到T载体上，所用引物如下：
F：5'-ATGTCATGTTTGAGTTGGGAGC-3'；
R：5'-TTAAACTTTGTCATAACTATTTGGATGATA-3'。
PCR反应体系：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTPs 10μL(0.4mM)，Primer F(10μmol/L)1.5μL，Primer R(10μmol/L)1.5μL，DNA模板1μL(200ng)， KODFX(1U/μl)1μL，ddH2O补充至50μL；
PCR反应程序：94℃变性2min；98℃10s，68℃1min共30个循环。
反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化 PCR产物，将其连接到pMD-19Tsimple载体(TakaRa)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。
4、构建基因的过表达载体
根据OsJMJ718基因的CDS，利用同源重组法将目的片段克隆到 pCAMBIA1302表达载体上，其中所用引物如下：
OsJMJ718-1302-N：
5'-CTTGACCATGGTAGATCTGATGTCATGTTTGAGTTGGGA-3'；
OsJMJ718-1302-C：
5'-GTTCTTCTCCTTTACTAGTAACTTTGTCATAACTATTTG-3'；
PCR反应体系：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTPs 10μL(0.4mM)，Primer F(10μmol/L)1.5μL，Primer R(10μmol/L)1.5μL，DNA模板1μL(200ng)， KODFX(1U/μl)1μL，ddH2O补充至50μL；
PCR反应程序：94℃变性2min；98℃10s，68℃1min共30个循环。
PCR反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并进行胶回收及纯化。胶回收及纯化按照生工生物工程(上海)股份有限公司的试剂盒说明书进行。将胶回收产物与1302载体进行连接，反应体系：胶回收产物3.5μl，酶切载体1.5μl，Master Assemly Mix 5μl；PCR反应程序：50℃变性40min；按4℃10min。
转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，进行质粒提取，获得 OsJMJ718-OE重组质粒。把OsJMJ718-OE质粒转化农杆菌A.tumefaciens EHA105，在含有卡那霉素和利福平的培养基上挑取单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。
5、EHA105介导的水稻转化：
用农杆菌转化野生型中花11愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有抗性的愈伤组织，分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。
(1)挑选饱满的成熟种子去壳，用2.5％NaCLO溶液摇45min，180rpm。无菌水漂洗3～5次，风干，铺在诱导培养基上，26℃暗培养4周，15天继代一次。
(2)将含有过表达载体OsJMJ718-OE的农杆菌在LB培养基上划线涂板， 28℃暗培养3天。
(3)挑取单菌落接种到5ml含抗生素的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。
(4)将新鲜的农杆菌菌液离心，收集(浓度适中)放入AAM液体培养基中，26℃避光培养2～5h。
(5)选择致密的愈伤组织颗粒(直径3～5mm)用于转化。将待转化的愈伤组织颗粒在准备好的AAM菌液中浸染5min，倒掉农杆菌悬浮液，利用无菌滤纸将愈伤组织上的多余菌液吸去，随后转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，28℃暗培养3天。
(6)共培养后，用无菌水洗3次，用AAM培养液润洗一次，吹干愈伤组织，然后将愈伤组织转移到筛选培养基含抗生素上筛选1个月。
(7)筛选后的抗性愈伤组织转移到分化培养基含抗生素上在光照条件下26℃继续培养至分化出绿苗。把小苗转移到生根培养基(含抗生素)中培养，将其从生根培养基中移除，洗净残留培养基，在清水中炼苗。当白色的新根长出时，将其移栽到温室或大田。
经筛选的阳性植株移至土壤生长，待成熟收集种子即得To代植株，经过潮霉素(HPT)筛选及定量RT-PCR分析，我们从筛选到的株系中选择两个株系OE4和OE12进行后续实验。其表达量结果如图1中左图所示，该两个株系中OsJMJ718基因表达水平较野生型均明显上调，为后续实验提供了较为理想的研究材料。
实施例2组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718敲除转基因水稻的获得
1、CRISPR/Cas9水稻敲除载体的构建
利用CRISPR靶位点在线设计网站E-CRISPR (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计靶位点(图2)，用于构建单靶点敲除载体，对应引物为：
Os718-U6aF：5'-gccgTTGGGAGCCACCAGATATG-3'；
Os718-U6aR：5'-aaacCATATCTGGTGGCTCCCAA-3'。
载体具体构建流程如下：
(1)制备双链接头：靶位点接头的正反向引物Os718-U6aF、Os718-U6aR 各1μL，ddH2O 8μL，混合均匀，90℃30s后，移至室温冷却完成退火。
(2)连接g RNA载体，反应体系如下(10μL)：
PCR反应程序37℃5min，20℃5min，5个循环。
(3)g RNA表达盒扩增：
取1μL连接产物作为模板，使用KOD-Plus高保真酶构建15μL体系进行扩增：10×KOD-Plus buffer 1.5μL、dNTPs 0.6μL、MgSO4 0.6μL、KOD-Plus0.3μ L、9μL ddH2O，最后加入1μL模板，其中每个表达盒2个PCR反应，引物搭配(反应1：U-F+Os718-U6aR，反应2：Os718-U6aF+gRNA-R)，U-F:5'-C TCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'；gRNA-R:5'-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3'，该引物为所有gRNA表达盒共用。
PCR反应程序为95℃2min；95℃10s，60℃15s，68℃20s，25个循环。
反应1和反应2的PCR产物各稀释10倍，各取1μL混合为模板，进行第二轮pcr扩增，PCR体系为10×KOD-Plus buffer 3μL、dNTPs 1.2μL、MgSO4 1.2 μL、KOD-Plus 0.6μL、20μLddH2O，1μL模板，Cas-B2’和Cas-BL各1.5μL，其中Cas-B2’为表达盒中连接点的位置，序列为5'-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGA ATCGGCAGCAAAGG-3'；Cas-BL为载体右侧引物，序列为5'-AGCGTGggtctcG accgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'。PCR反应程序为95℃2min；95℃10s，58℃15s，68℃20s，20个循环。PCR反应结束后对产物进行琼脂糖电泳，对符合大小的条带进行切胶回收。
(4)连接p YLCRISPR/Cas9-MH载体：0.5μLgRNA载体连接扩增回收产物、 1.5μL 10×T4 Ligase Buffer、1μL BsaⅠ、2μLpYLCRISPR/Cas9-MH质粒、10μL ddH2O，37℃酶切10min后加入0.75μLATP和0.5μLT4 DNA ligase,混匀后放入PCR仪，37℃5min，10℃5min，20℃5min，共10个循环。
(5)转化大肠杆菌及质粒测序：将上述连接产物转化加入DH5α感受态中，涂布于具有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜培养。挑取平板上单菌落，用pYLCRISPR/Cas9-MH载体检测引物SP1和SP2在PCR中扩增，电泳出现目的条带后送往北京擎科生物科技有限公司进行测序验证，获得阳性菌株。提取质粒，为下一步做准备。
2、农杆菌介导的水稻CRISPR/Cas 9敲除载体的转化
用农杆菌转化野生型中花11愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有抗性的愈伤组织，分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。
(1)挑选饱满的成熟种子去壳，用2.5％NaCLO溶液摇45min，180rpm。无菌水漂洗3～5次，风干，铺在诱导培养基上，26℃暗培养4周，15天继代一次。
(2)将含有OsJMJ718基因CRISPR/Cas 9敲除载体的农杆菌在LB培养基上划线涂板，28℃暗培养3天。
(3)挑取单菌落接种到5ml含抗生素的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。
(4)将新鲜的农杆菌菌液离心，收集(浓度适中)放入AAM液体培养基中，26℃避光培养2～5h。
(5)选择致密的愈伤组织颗粒(直径3～5mm)用于转化。将待转化的愈伤组织颗粒在准备好的AAM菌液中浸染5min，倒掉农杆菌悬浮液，利用无菌滤纸将愈伤组织上的多余菌液吸去，随后转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，28℃暗培养3天。
(6)共培养后，用无菌水洗3次，用AAM培养液润洗一次，吹干愈伤组织，然后将愈伤组织转移到筛选培养基含抗生素上筛选1个月。
(7)筛选后的抗性愈伤组织转移到分化培养基含抗生素上在光照条件下26℃继续培养至分化出绿苗。把小苗转移到生根培养基(含抗生素)中培养，将其从生根培养基中移除，洗净残留培养基，在清水中炼苗。当白色的新根长出时，将其移栽到温室或大田。
3、转基因阳性水稻株系检测及突变植株的筛选
(1)利用农杆菌介导的水稻转基因法，转化中花11的愈伤组织，通过潮霉素选择，获得4株独立的转化株系。CTAB法提取水稻叶片的总DNA，使用2 ×Taq Master Mix和潮霉素检测引物hpt-t/F、hpt-t/R，其序列如下：
hpt-t/F：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3'；
hpt-t/R：5'-CGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAG-3'。
按如下体系进行PCR扩增：
PCR程序设置：
程序中，第二步(变性)到第四步(延伸)进行30个循环。
PCR结束后对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察每个植株对应的扩增结果是否产生一条600bp左右的条带，如果产生目的条带，则说明敲除载体已整合至该模版DNA对应植株的染色体上。
(2)突变体植株类型的鉴定
在靶位点序列上下游位置使用Primer Premier 5设计了突变体检测引物 718-F、718-R(718-F：5'-TGCCCTACATTGGATAATGG-3'；718-R： 5'-ATAGCAGCACTGATCGCTC-3')。提取阳性植株的DNA，使用2×金牌Mix (green)和引物718-F、718-R按下列体系进行PCR反应：
25μL PCR反应体系：0.5μL DNA模版，22.5μL 2×金牌Mix，1μL718-F，1μL 718-R。PCR程序设置：98℃2min；98℃10s，56℃15s，72℃10s，72℃7min； 16℃10min。第二步进行30-35个循环。PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用试剂盒纯化回收目的条带后，连接T19 simple载体，转化大肠杆菌DH5α，每个单株挑取10个单克隆，送往擎科生物技术(上海)有限公司测序；突变体和野生型的测序结果用Snapgene软件进行序列比对。
现有报道将Crispr/Cas9技术获得的突变体分为三类：双等位基因纯合突变、双等位基因杂合突变和单条染色体突变。结果发现，在转基因T0获得1个双等位基因纯合突变株JMJ718-25，3个双等位基因杂合突变株(JMJ718-1、JMJ718-5、JMJ718-18)，这些株系的突变类型包括碱基缺失和碱基突变(图3)。所有的突变均出现在gRNA区间，双等位突变株JMJ718-1分别缺失7，4bp，JMJ718-5 株缺失1bp和替换1bp，JMJ718-18分别缺失5，2bp。
4、无转基因序列的突变株鉴定
对突变株系的T1单株用引物Hpt-F/Hpt-R和Cas9-F/Cas9-R进行PCR扩增， 2对引物都不能扩增出载体目的片段的植株为无转基因序列的突变株。同时用靶位点扩增引物检测T1植株的突变情况。共筛选到Cas9和Hpt基因检测阴性的单株7株，其中JMJ718-1的T1分别检测到2株纯合单株，均表现为缺失4bp； JMJ718-5的T1分别检测到2株纯合单株，表现为缺失1bp；JMJ718-18检测到 3种纯合单株，缺失5bp。将7个筛选到的无转基因元件的纯合单株套袋收种。
5、植株的mRNA表达量的检测
将T1代的纯合无转基因原件的植株收获种子并培育成植株，即为T2代植株。利用实时荧光定量PCR来检测突变体和野生型中花11中OsJMJ718基因的表达量。qRT-PCR的反应体系和反应条件按照TaKaRa公司，编号为：RR820Q 的 Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus)试剂盒说明书进行操作，以水稻 Ubiqutin基因作为内参，OsJMJ718基因所使用的引物为
正向引物：5'-TCCTGCACCAAGATTGCCTT-3'；
反向引物：5'-ATGTGGGCTTGGGTCCATTT-3'。
反应使用LightCycler480(Roche，Germeny)定量PCR仪。反应程序为：95℃，30s；45个循环(95℃，5s；68℃，30s)。qRT-PCR反应结束后，使用 2–ΔΔCt方法对所得数据进行相对定量分析。结果如图1中右图所示，与野生型水稻相比，突变体水稻T2代株系JMJ718-1、JMJ718-5和JMJ718-18基因的表达量均显著降低。
实施例3OsJMJ718过表达/CRISPR/Cas9敲除转基因水稻的种子活力表型观察
种子收获成熟以后，以WT、OE-4、OE-12、JMJ718-1和JMJ718-5进行种子萌发实验。首先将新鲜收获的种子置于烘箱42℃条件下处理7天以破除种子休眠。种子在正常和直播条件下的发芽实验参考(He DL,Han C,Yao JL,Shen SH, Yang PF.(2011).Constructingthe metabolic and regulatory pathways in germinating rice seeds throughproteomic approach.Proteomics,11:26932693P)。将种子置于垫有三层湿润滤纸的发芽盒(12cm×12cm)中，28℃恒温条件发芽，光照设置为 16h光照/8h黑暗，光通量为350μmol·m－2·s－1。每处理3个重复，每重复30 粒种子。发芽的标准为种子胚根突破种皮2mm；当根长大于或等于种子长度，芽变绿时定义为种子成苗；种子发芽达到50％所用的时间用T50表示。每天记录发芽种子数。发芽结束后，随机取幼苗10株/盒，分别测量苗高、根长。结果如图4和5所示，在正常条件下发芽5d后，与野生型比较，过表达株系OE-4 和OE-12种子的发芽速度较快、根长和芽长较长；而敲除株系jmj718-1和jmj718-5 种子的发芽率、成苗率显著降低，发芽达到一半所需时间增加。比较直播7d后表型，与野生型相比，敲除株系的成苗率降低。以上结果说明OsJMJ718基因具有调控水稻种子活力的生物学功能，该基因表达能提高种子发芽速度，促进胚根、胚芽以及幼苗生长，可利用OsJMJ718基因培育高活力水稻品种。
序列表
<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心
<120> 组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控水稻种子活力中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
atgtcatgtt tgagttggga gccaccagat atgtggtcta aagtacatgg caccggcact 60
agtcctgaga tgaaaaacgt gaaggctatt gattgtttat cttgctgtga ggtcgagata 120
tgcactcaag acttcttcaa tgggtattat gaaggtcgga tgtatcaaaa tctatggcct 180
gaaatgctta aattgaagga ctggcctaca tcaaatcatt ttgaagagct tttgccttcc 240
catggagtta aatacatgaa ttctttacct tttcaaccat acacaaactt gaagtctggt 300
ttgctgaatg tctcaacctt gcttcctgat gacatcttaa agcttgacat gggcccaaaa 360
tcatatatag cttatggcta tgcacaggaa cttggtagag gagattctgt tacaaagctt 420
cactgcgatt tgtctgatgc agttaacgtt ttgatgcata ctgctgaagt tgacccttcc 480
gaggaacaaa tagatgcaat aaaaagtttg aaaagaagac atacagcgca aaatgaaaag 540
gagtgttctg ggaatgcaga cggaaattat acatctccta aaatctgtgg ggatgcaaat 600
gagttgtcct gtcctataaa cagtgagacc aacaagggag gtgctttatg ggatattttt 660
aggagggaag atgttccaaa actgaaattg tatctcgaca agcattctaa ggaatttcgc 720
catatatact gttctgcagt tcaaaaggta tgtaaccctg tacatgatga aacattttat 780
ctaacagaag aacacaagag aaaactcaag gaggagcatg gaattgagcc ttggacattt 840
gtacaaaaac ttggggaggc agtattcatt cctgctgggt gtcctcatca agtacggaat 900
cttaagtcct gcaccaagat tgccttggat tttgtatcac ccgagaatgt taaggagtgt 960
ctcagcttaa ccgaggactt ccgaagactt cctaagaacc acagggccaa agaagacaaa 1020
ttagagctag gtgtggttca aaatggaccc aagcccacat accctcgaga aactattcta 1080
aactctcaat gggacatctt gttgtttgca tatcatccaa atagttatga caaagtttaa 1140
<210> 2
<211> 379
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
Met Ser Cys Leu Ser Trp Glu Pro Pro Asp Met Trp Ser Lys Val His
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Ser Pro Glu Met Lys Asn Val Lys Ala Ile Asp Cys
20 25 30
Leu Ser Cys Cys Glu Val Glu Ile Cys Thr Gln Asp Phe Phe Asn Gly
35 40 45
Tyr Tyr Glu Gly Arg Met Tyr Gln Asn Leu Trp Pro Glu Met Leu Lys
50 55 60
Leu Lys Asp Trp Pro Thr Ser Asn His Phe Glu Glu Leu Leu Pro Ser
65 70 75 80
His Gly Val Lys Tyr Met Asn Ser Leu Pro Phe Gln Pro Tyr Thr Asn
85 90 95
Leu Lys Ser Gly Leu Leu Asn Val Ser Thr Leu Leu Pro Asp Asp Ile
100 105 110
Leu Lys Leu Asp Met Gly Pro Lys Ser Tyr Ile Ala Tyr Gly Tyr Ala
115 120 125
Gln Glu Leu Gly Arg Gly Asp Ser Val Thr Lys Leu His Cys Asp Leu
130 135 140
Ser Asp Ala Val Asn Val Leu Met His Thr Ala Glu Val Asp Pro Ser
145 150 155 160
Glu Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ser Leu Lys Arg Arg His Thr Ala
165 170 175
Gln Asn Glu Lys Glu Cys Ser Gly Asn Ala Asp Gly Asn Tyr Thr Ser
180 185 190
Pro Lys Ile Cys Gly Asp Ala Asn Glu Leu Ser Cys Pro Ile Asn Ser
195 200 205
Glu Thr Asn Lys Gly Gly Ala Leu Trp Asp Ile Phe Arg Arg Glu Asp
210 215 220
Val Pro Lys Leu Lys Leu Tyr Leu Asp Lys His Ser Lys Glu Phe Arg
225 230 235 240
His Ile Tyr Cys Ser Ala Val Gln Lys Val Cys Asn Pro Val His Asp
245 250 255
Glu Thr Phe Tyr Leu Thr Glu Glu His Lys Arg Lys Leu Lys Glu Glu
260 265 270
His Gly Ile Glu Pro Trp Thr Phe Val Gln Lys Leu Gly Glu Ala Val
275 280 285
Phe Ile Pro Ala Gly Cys Pro His Gln Val Arg Asn Leu Lys Ser Cys
290 295 300
Thr Lys Ile Ala Leu Asp Phe Val Ser Pro Glu Asn Val Lys Glu Cys
305 310 315 320
Leu Ser Leu Thr Glu Asp Phe Arg Arg Leu Pro Lys Asn His Arg Ala
325 330 335
Lys Glu Asp Lys Leu Glu Leu Gly Val Val Gln Asn Gly Pro Lys Pro
340 345 350
Thr Tyr Pro Arg Glu Thr Ile Leu Asn Ser Gln Trp Asp Ile Leu Leu
355 360 365
Phe Ala Tyr His Pro Asn Ser Tyr Asp Lys Val
370 375

Claims (6)

1.SEQ ID NO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718在调控水稻种子活力中的应用。
2.SEQ ID NO：2所示组蛋白去甲基化酶OsJMJ718在调控水稻种子活力中的应用。
3. SEQ ID NO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718或SEQ ID NO：2所示组蛋白去甲基化酶OsJMJ718在提高水稻种子活力中的应用，其特征在于，为提高水稻中组蛋白去甲基化酶的表达量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，构建组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718的过表达载体并转化植株，获得稳定遗传的OsJMJ718过表达转基因植株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述OsJMJ718的过表达载体为pCAMBIA1302- OsJMJ718。
6.含有SEQ ID NO：1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718的过表达载体或质粒在提高水稻种子活力或在创制高活力水稻种质中的应用。
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