CN116837022A - 组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719及其编码蛋白在水稻抗盐胁迫中的应用 - Google Patents
组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719及其编码蛋白在水稻抗盐胁迫中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719及其编码蛋白在水稻抗盐胁迫中的应用。本发明通过构建OsJMJ719的过表达载体并转化水稻，获得过表达OsJMJ719的转基因植株，结果显示过量表达OsJMJ719的水稻幼苗表现出比野生型具有更强的抵抗盐胁迫的能力，表明OsJMJ719正调控水稻盐胁迫抗性，可通过过表达OsJMJ719基因来提高水稻抗盐的能力，在农业生产上栽培盐胁迫抗性增强的水稻，对节能节水、盐碱地的利用、增加粮食产量等具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719及其编码蛋白在水稻抗盐胁迫中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界重要粮食作物之一，全世界半数以上的人口以其为主食，水稻生产是关系到国计民生的大事，与我国粮食安全保障密切相关。据报道，全球大约有10×108hm2的土地正遭受盐渍化侵害，因此筛选、挖掘优良水稻盐胁迫相关基因，研究其分子生物学机理以及对逆境胁迫的调控，不仅有助于了解水稻的生长发育机制，同时对提高盐渍化土地的利用率及增加水稻产量有着重要作用。
非生物胁迫严重影响植物的生长、发育和作物的产量。为了抵抗这些极端环境，植物已经演化出了错综复杂的调控网络以抵抗这些极端环境对植物的危害。在这些调控网络中，表观遗传调控因子在植物抵抗非生物胁迫抗性中起重要的作用。目前，一些组蛋白修饰基因，例如组蛋白去乙酰化酶基因，已经被证实在植物响应非生物胁迫反应中起重要的调控作用。
非核苷酸序列的改变而产生的遗传变异称之为表观遗传，常见的有组蛋白修饰和DNA甲基化。组蛋白赖氨酸甲基化/去甲基化是一种重要的表观遗传修饰。组蛋白赖氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylase，KDM)根据其结构特征分为两大类，一类是以FAD为辅因子的LSD1家族蛋白(lysine specific demethylase 1)；另一类是以亚铁离子(Fe2+)和α-酮戊二酸(α-KG)为辅因子的JmjC家族蛋白(JHDM，JmjC-domain-containing histonedemethylase)，在组蛋白的去甲基化调控过程中起主导作用。近年来的研究表明，组蛋白去甲基化酶在植物的生长发育、种子萌发和耐热方面都起着重要的作用。例如OsJMJ703的T-DNA插入突变体与野生型相比，株高降低、粒型发生变化。OsJMJ705正调控白叶枯病菌抗性基因的表达。OsJMJ706可以通过调控花发育有关基因，影响小穗发育，导致内、外稃数目改变及雄、雌蕊数改变。OsJMJ714作用于H3K9me1/2/3的去甲基化，其调控水稻中多种植物激素如生长素代谢相关基因的表达，造成水稻根系的发育过程紊乱。尽管一些组蛋白去甲基化酶基因被克隆和功能分析，但是水稻组蛋白去甲基化酶基因家族响应盐胁迫的基因仍然鲜少报道。因此，克隆水稻组蛋白去甲基化酶参与盐胁迫调控基因并对其功能进行研究，为抗盐水稻品种培育提供一个新的基因资源，为培育抗盐植物提供分子理论基础，有助于我国盐碱地得到有效的开发利用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719及其编码蛋白在水稻抗盐胁迫中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明研究获得了一个水稻组蛋白去甲基化酶基因家族中响应盐胁迫的基因OsJMJ719，所述OsJMJ719基因(LOC_Os02g01940)的编码区(LOC_Os02g01940.1)长度为2994bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码997个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明进一步通过构建OsJMJ719基因的过表达载体并转化粳稻品种中花11，获得过表达OsJMJ719的转基因水稻植株；结果显示，过表达OsJMJ719的转基因水稻株系在盐胁迫处理后，成活率显著高于野生型水稻，该基因的过表达转基因植株能够显著提高水稻对盐胁迫的抗性。表明OsJMJ719基因正调控水稻盐胁迫抗性，可通过过表达OsJMJ719基因来提高水稻盐胁迫抗性，为耐盐水稻品种的改良提供了理论指导，在农业生产中具有极其重要的价值和应用前景。
因此，本发明提供关于水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719基因及其编码蛋白OsJMJ719在水稻抗盐胁迫中的以下新应用：
核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719在提高水稻对盐胁迫抗性中的应用。
氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的组蛋白去甲基化酶OsJMJ719在提高水稻对盐胁迫抗性中的应用
核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719在培育盐胁迫抗性增强的水稻中的应用。
氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的的组蛋白去甲基化酶OsJMJ719在培育盐胁迫抗性增强的水稻中的应用。
含有SEQ ID No.1所示组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的过表达载体/质粒或原位激活载体/质粒在培育盐胁迫抗性增强的水稻中的应用。
进一步地，所述应用为提高水稻中组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719基因的表达量，获得盐胁迫抗性增强的水稻植株。
进一步地，所述应用为构建组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的过表达载体，并将其转化到水稻中，筛选获得稳定遗传的过表达OsJMJ719的转基因水稻植株，即为盐胁迫抗性增强的水稻植株。
进一步地，所述组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的过表达载体为pCAMIBA1302-OsJMJ719。
进一步地，所述转化采用农杆菌介导转化法或基因枪介导转化法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719及其编码蛋白在水稻抗盐胁迫中的应用。本发明通过构建OsJMJ719基因的过表达载体并转化粳稻品种中花11，获得过表达OsJMJ719的转基因水稻植株；结果显示，过表达OsJMJ719的转基因水稻株系在盐胁迫处理后，成活率显著高于野生型水稻，该基因的过表达转基因植株能够显著提高水稻对盐胁迫的抗性。表明OsJMJ719基因正调控水稻盐胁迫抗性，可通过过表达OsJMJ719基因来提高水稻盐胁迫抗性，为耐盐水稻品种的改良提供了理论指导。
附图说明
图1为野生型水稻中花11(WT)和过表达OsJMJ719的转基因水稻植株中OsJMJ719基因的相对表达量检测结果。
图2为野生型水稻幼苗和转OsJMJ719基因的水稻幼苗抗盐表型。
图3为盐胁迫处理后OsJMJ719转基因水稻植株与野生型水稻地上部位高度、地上部分鲜重和根长、幼苗存活率。A：苗长，B：鲜重，C：根长，D：存活率。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719过表达转基因水稻的获得
为了构建OsJMJ719过表达载体，首先扩增OsJMJ719的cDNA片段(LOC_Os02g01940.1，SEQ ID No.1)，然后将该片段插入到载体pCAMIBA1302中。将构建好的载体转化农杆菌株EHA105，然后转入水稻“中花11”成熟种子胚性愈伤组织。具体包括如下步骤：
1、水稻RNA提取：采用本领域常规的Trizol法提取水稻RNA。
2、逆转录反应(cDNA合成)
用Takara公司的反转录试剂盒进行逆转录反应，反应体系和反应条件参考试剂盒说明书。
3、目的基因的PCR扩增
根据OsJMJ719基因的CDS，保守序列，用-Primer 5.0-设计基因克隆引物。将该基因连接到T载体上，所用引物如下：
F：5'-GCCGCAATTTGATTTGATTTCCTCCTT-3'；
R：5'-GCCATCTGACTGACTCCACAATACAAT-3'
PCR反应体系：
PCR反应程序：98℃10s，55℃15s，72℃10s共32个循环。
反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD-19Tsimple载体(TakaRa)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。
4、构建基因的过表达载体
根据OsJMJ719基因的CDS，利用同源重组法将目的片段克隆到Pcambia1302表达载体上，其中所用引物如下：OsJMJ719-1302-N：5'-CTTGACCATGGTAGATCTGATGCCGCCCAAGAGGAAGCG-3'，OsJMJ719-1302-C：5'-GTTCTTCTCCTTTACTAGTACTAACACTTGGGGCAGACG-3'。
PCR反应体系：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTPs 10μL(0.4mM)，Primer F(10μmol/L)1.5μL，Primer R(10μmol/L)1.5μL，DNA模板1μL(200ng)，KODFX(1U/μL)1μL，ddH2O补充至50μL；
PCR反应程序：94℃变性2min；98℃10s，68℃1min共30个循环。
PCR反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并进行胶回收及纯化。胶回收及纯化按照生工生物工程(上海)股份有限公司的试剂盒说明书进行。将胶回收产物与1302载体进行连接，反应体系:胶回收产物3.5μL，酶切载体1.5μL，Master Assemly Mix 5μL；PCR反应程序：50℃变性40min；按4℃10min。
转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，筛选阳性克隆，进行质粒提取，获得OsJMJ719-OE重组质粒。把OsJMJ719-OE质粒转化农杆菌A.tumefaciens EHA105，在含有卡那霉素和利福平的培养基上挑取单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。
5、EHA105介导的水稻转化
用农杆菌转化野生型中花11愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有抗性的愈伤组织，分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。
(1)挑选饱满的成熟种子去壳，用2.5％NaClO溶液摇45min，180rpm。无菌水漂洗3～5次，风干，铺在诱导培养基上，26℃暗培养4周，15天继代一次。
(2)将含有过表达载体OsJMJ719-OE的农杆菌在LB培养基上划线涂板，28℃暗培养3天。
(3)挑取单菌落接种到5ml含抗生素的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。
(4)将新鲜的农杆菌菌液离心，收集(浓度适中)放入AAM液体培养基中，26℃避光培养2～5h。
(5)选择致密的愈伤组织颗粒(直径3～5mm)用于转化。将待转化的愈伤组织颗粒在准备好的AAM菌液中浸染5min，倒掉农杆菌悬浮液，利用无菌滤纸将愈伤组织上的多余菌液吸去，随后转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，28℃暗培养3天。
(6)共培养后，用无菌水洗3次，用AAM培养液润洗一次，吹干愈伤组织，然后将愈伤组织转移到筛选培养基含抗生素上筛选1个月。
(7)筛选后的抗性愈伤组织转移到分化培养基含抗生素上在光照条件下26℃继续培养至分化出绿苗。把小苗转移到生根培养基(含抗生素)中培养，将其从生根培养基中移除，洗净残留培养基，在清水中炼苗。当白色的新根长出时，将其移栽到温室或大田。
经筛选的阳性植株移至土壤生长，待成熟收集种子即得T0代植株，经过潮霉素(HPT)筛选及定量RT-PCR分析。首先提取过表达转基因株系的总的RNA，每个株系3个生物学重复，每个生物学重复取3个技术重复，以水稻Aactin为内参基因，其中RT-PCR引物序列为qOsJMJ719N：5'-GCTGGTACCCGCATCTAACA-3'，qOsJMJ719C：5'-ACCATCGGCAAACTCCTTGT-3'；Actin-QF:5'-TGAAGATCAAGGTGGTGGCAC-3'，Actin-QR:5'-TGCTGGACCCGACTCATCATA-3'。定量PCR的反应体系和条件按照qRT-PCR的反应体系和反应条件按照TaKaRa公司，编号为：RR820Q的Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行操作，反应使用LightCycler480(Roche，Germeny)定量PCR仪进行qRT-PCR，反应条件如下，反应程序为：95℃，30s；45个循环(95℃，5s；68℃，30s)。qRT-PCR反应结束后，使用2–ΔΔCt方法对所得数据进行相对定量分析。从筛选到的株系中选择三个株系OE1、OE2和OE49进行后续实验。其表达量定量结果如图1所示，该三个株系中OsJMJ719基因表达水平较野生型均明显上调，且上调非常显著，为后续实验提供了较为理想的研究材料。
OsJMJ719基因过表达株系T1代种子收成后，为了确保T1代筛选出来种植的株系的种子的纯合性，用带有潮霉素抗性的MS培养基，对OE-1、OE-2、OE-49这三个株系的T2代进行筛选，铺种完成后在培养箱中培养，随着种子的发芽、生根、生长，可以看到有些培养基中的种子正常发芽、生根、生长；而有些种子则发芽，但是不生根，也不能正常生长；还有一些种子不发芽、不生根、不生长，而且种胚还发黑了，发生3：1的分离。MS培养基中同一培养瓶所有种子能够正常发芽、生根、生长的情况下，就可以判定这一过表达株系是纯合的，通过此方法，最终筛选出OE-1、OE-2、OE-49的纯合株系，用于观察表型等生物学实验。
实施例2 OsJMJ719过表达转基因水稻的盐胁迫抗性检测
将实施例1获得的OsJMJ719过表达转基因水稻进行如下实验：分别将2周的水稻过表达株系及野生型幼苗(WT)移入含有150mM NaCl的1/2MS液体培养基中，生长4天后观察水稻的生长情况，然后在1/2MS液体培养基中恢复生长5天，统计存活率，测定植株地上部位高度、根长和地上部分鲜重。每个株系选取20个单株，3次生物学重复。
结果显示，NaCl处理4天后，WT的叶片呈黄色卷曲，然而OsJMJ719过表达转基因水稻存活率高于WT；并且过表达植株在复水5天后的存活率为48％-69％，WT为22％，OsJMJ719过表达植株的成活率明显高于WT(图2，图3D)。同时OsJMJ719过表达转基因水稻的株高、鲜重和根长高于WT植株(图3A，3B，3C)。说明过表达OsJMJ719可以提高水稻对盐胁迫的耐受性。
Claims (9)
1.组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719在提高水稻对盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.组蛋白去甲基化酶OsJMJ719在提高水稻对盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述组蛋白去甲基化酶OsJMJ719的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719在培育盐胁迫抗性增强的水稻中的应用，其特征在于，所述组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
4.组蛋白去甲基化酶OsJMJ719在培育盐胁迫抗性增强的水稻中的应用，其特征在于，所述组蛋白去甲基化酶OsJMJ719的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.含有水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的过表达载体/质粒或原位激活载体/质粒在培育盐胁迫抗性增强的水稻中的应用，其特征在于，所述组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
6.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，提高水稻中组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719基因的表达量，获得盐胁迫抗性增强的水稻植株。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，为构建组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的过表达载体，并将其转化到水稻中，筛选获得稳定遗传的过表达OsJMJ719的转基因水稻植株，即为盐胁迫抗性增强的水稻植株。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的过表达载体为pCAMIBA1302-OsJMJ719。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述转化采用农杆菌介导转化法或基因枪介导转化法。
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