CN111979253B - TrFQR1基因及其克隆、表达载体构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提供一种能够提高白花三叶草生长过程中对高温和干旱的抗逆能力，同时可以增加其须根数量的TrFQR1基因。该TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。通过荧光定量PCR验证了TrFQR1在高温，干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在高温和干旱胁迫下，TrFQR1基因在根与叶中的表达量均发生了显著的变化，各胁迫条件及时间点下有所差异，能够有效提高白花三叶草生长过程中对高温和干旱的抗逆能力，将TrFQR1基因通过基因工程的手段转入到拟南芥中，转基因植株较野生型的须根数量显著增加，说明TrFQR1具有促进植物根系生长的作用。适合在生物技术领域推广运用。

Description

TrFQR1基因及其克隆、表达载体构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种TrFQR1基因及其克隆、表达载体构建方法和应用。

背景技术

白三叶(Trifolium repens)作为一种广泛栽培的豆科牧草，品质优良，为多种畜禽所喜食。其匍匐茎发达、生长低矮、生长适应性和扩展能力强、再生速度快，竞争能力强，也作为温带地区观赏性草坪和绿地建植的主要草种，在国内外城镇绿化、水土保持等方面起着发挥重要作用。然而，白花三叶草虽然品质好，但产量有待提高；且白三叶喜冷凉湿润的气候，根系生长短，调控蒸腾能力差，因此抗旱性较弱，不耐高温，在栽培种植过程中经常会因干旱和高温胁迫抑制白三叶的生长。近年来，受全球气候变暖的影响，部分地区降雨偏少或降雨分布不均影响了白三叶的生长和利用。因此，发掘提高白三叶抗旱及耐热相关基因并进行功能验证将为提高白三叶产量及其抗逆性奠定重要基础。

TrFQR1属于依赖FMN的还原酶家族，即是一个以FMN(flavin mononucleotide)为辅基且依赖于NADPH的醌氧化还原酶家族蛋白[FMN-dependent NADPH quinone reductasefamily(FMN_red)。FMN是黄素蛋白的辅基，参与氧化还原反应、催化脱氢、氧化和电子转移或羟基化过程，在呼吸等生物氧化过程的电子传递中具有重要作用。醌作为一种自然界中广泛存在的有毒物质，能诱发哺乳动物细胞癌变和坏死。NAD(P)H：醌氧化还原酶能减少醌类转化可能引起的细胞器及遗传物质损伤，保证机体的正常生理功能，因而受到广泛关注。已有研究表明，该类基因及其相关产物与人类多种疾病的发生有着紧密的关系，对于醌类物质能起到解毒的作用。因此，对白三叶TrFQR1基因克隆及功能验证具有重要的理论意义与实际价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高白三叶生长过程中对高温和干旱的抗逆能力，同时可以增加其须根数量的TrFQR1基因。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。

进一步的是，所述TrFQR1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQUENCE IDNO.2所示。

本发明还提供了一种TrFQR1基因的克隆方法，其克隆方法包括以下步骤：

1)、材料选择：选取白花三叶草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒后用Hoagland全营养液水培于光照培养箱中12h光照(23℃)，12h无光(19℃)，相对湿度75％，光照强度250umol·m^-2·s^-1，培养30d；

2)、白花三叶草总RNA的提取：首先，取步骤1)得到的白花三叶草叶片，然后采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒提取白花三叶草叶的RNA；

3)、cDNA的合成；首先，在微型管中配制反应混合液，随后42℃反应2min，冰上迅速冷却，所述反应混合液体系如表1所示：

表1反应混合液体系表

接着，在另一微型管中配制反转录反应液总量为20μL，缓慢混匀后采用PrimeScript^TMIII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录反应，反应过程如下：先在37℃下反应15min后，再85℃5sec，冰上冷却，所述反转录反应液体系如表2所示：

表2反转录反应液表

4)、扩增：使用

Max DNA Polymerase进行PCR反应，所述PCR反应体系如表3所示：

表3 PCR反应体系表

PCR反应过程如下：(1)95.0℃，30sec；(2)95.0℃，5.0sec；60.0℃，34sec；共40cycles；(3)95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec。

PCR反应引物为：

Forward primer(5'--3'):ATGGCTGTCAAACTTTACATTGTAT；

Reversed primer(5'--3'):ATTATGCAGCTTCCTTGAGCTTCTT；

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用TIANGEN Mid Purification Kit普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶回收纯化后，得到TrFQR1基因的3’和5’端序列，利用NCBI Blast N和DNAman 6.0拼接得到TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE IDNO.1所示。

本发明还提供了一种TrFQR1基因的表达载体构建方法，首先，提取表达载体pBI121-35S的质粒，通过BamHI和SacI双酶切进行双酶切，将TrFQR1基因的开放阅读框链接到酶切之后的pBI121-35S载体上，转化感受态细胞后，进行Kan抗性筛选，最后对菌液进行PCR验证，并对阳性菌落进行测序，若测序序列与原序列不相同，则表明转化不成功，重复上述步骤再次进行TrFQR1基因的过表达载体构建，若测序序列与原序列相同，则表明转化成功，保存结果正确的菌液至超低温冰箱(-80℃)。

本发明还发现TrFQR1基因在高温和干旱胁迫中的应用。

本发明还发现TrFQR1基因在促进植物须根生长中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明所述的TrFQR1基因通过荧光定量PCR验证了TrFQR1在高温，干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在高温和干旱胁迫下，TrFQR1基因在根与叶中的表达量均发生了显著的变化，各胁迫条件及时间点下有所差异，能够有效提高白花三叶草生长过程中对高温和干旱的抗逆能力，将TrFQR1基因通过基因工程的手段转入到拟南芥中，转基因植株较野生型的须根数量显著增加，说明TrFQR1具有促进植物根系生长的作用。

附图说明

图1为TrFQR1 cDNA全长及其编码氨基酸序列；

图2为TrFQR1基因编码蛋白的疏水结构分析图；

图3为TrFQR1基因编码蛋白的信号肽分析图；

图4为TrFQR1基因编码蛋白的跨膜区段结构分析图；

图5为TrFQR1基因编码蛋白的无序化特征分析图；

图6为TrFQR1基因编码蛋白的磷酸化位点分析图；

图7为TrFQR1基因编码蛋白的二级结构图；

图8为TrFQR1基因编码蛋白的三级结构图；

图9为TrFQR1在非生物胁迫下的相对表达量；

图10为TrFQR1亚细胞定位；

图11为野生型拟南芥(Col-0)、转基因植株T1、转基因植株T2和转基因植株T3在筛选培养基上的生长情况；

图12为不同株系的拟南芥T3进行PCR验证图；

图13为TrFQR1在不同株系中的相对表达量；

图14为TrFQR1转基因拟南芥与野生型拟南芥表地上部分的形态差异对比图；

图15为TrFQR1转基因拟南芥与野生型拟南芥根系生长情况对比图；

图16为TrFQR1转基因拟南芥与野生型拟南芥过表达株系须根数目的变化对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

该TrFQR1基因的cDNA全长及其编码氨基酸序列如图1所示：ATG.-起始密码子；TAA-终止密码子；横线标出FMN结合位点。

具体的，该TrFQR1基因的cDNA全长序列如下所示：

TrFQR1基因的cDNA全长为1003bp，包含一个612bp的开放阅读框，编码203个氨基酸。将该基因的核苷酸序列在NCBI网站上通过BlastN分析后发现该基因核苷酸序列与蒺藜苜蓿soluble inorganic pyrophosphatase 4(LOC11429557)同源性近94.96％，在NCBI网站上通过BlastP分析后发现该基因编码的氨基酸序列与蒺藜苜蓿soluble inorganicpyrophosphatase(KEH42359.1)同源性近95.57％。

进一步的是，所述TrFQR1基因编码的蛋白序列共有203个氨基酸，其氨基酸序列如下所示：

Met Ala Val Lys Leu Tyr Ile Val Tyr Tyr Ser Met Tyr Gly His Val

Glu Lys Leu Ala Glu Glu Ile Lys Lys Gly Ala Ala Ser Val Glu Gly

Val Glu Ala Lys Leu Trp Gln Val Pro Glu Thr Leu His Glu Glu Val

Leu Gly Lys Met Ser Ala Pro Pro Lys Ser Asp Val Gln Ile Ile Thr

Pro Asp Glu Leu Ala Glu Ala Asp Gly Phe Val Phe Gly Phe Pro Thr

Arg Phe Gly Met Met Ala Ala Gln Phe Lys Ala Phe Leu Asp Ala Thr

Gly Gly Leu Trp Arg Thr Gln Lys Leu Ala Gly Lys Pro Ala Gly Ile

Phe Tyr Ser Thr Gly Ser Gln Gly Gly Gly Gln Glu Thr Thr Ala Leu

Thr Ala Ile Thr Gln Leu Val His His Gly Met Ile Phe Val Pro Ile

Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Met Phe Glu Met Glu Gln Val Lys Gly

Gly Ser Pro Tyr Gly Ala Gly Thr Tyr Ala Gly Asp Gly Ser Arg Gln

Pro Ser Glu Leu Glu Leu Gln Gln Ala Phe His Gln Gly Lys Tyr Leu

Ala Thr Ile Thr Lys Lys Leu Lys Glu Ala Ala

通过ProParam工具预测该蛋白分子式为C993H1529N251O290S8，分子量(MW)为21.88kDa，理论等电点为5.96，带有负电残基(Asp+Glu)21个，带有正电氨基酸残基(Arg+Lys)18个，肽链中Gly含量最多，共26个，占总量的12.8％；其次是Ala，共23个，占11.3％。不稳定指数为32.77，低于40的阈值，预测此蛋白较稳定。用ProtScale程序预测蛋白质疏水性，如图2所示，图2为TrFQR1基因编码蛋白的疏水结构分析图；由图2可知，总平均疏水指数(grand average of hydropathicity,GRAVY)为-0.116，表明该蛋白为亲水性蛋白。用Signal P4程序预测TrFQR1不含信号肽，如图3所示，图3为TrFQR1基因编码蛋白的信号肽分析图，由图3可知，该蛋白不属于分泌蛋白。用TMpred程序预测跨膜区段，如图4所示，图4为TrFQR1基因编码蛋白的跨膜区段结构分析图；由图4可知，TrFQR1无跨膜结构。用FoldIndex预测蛋白无序化特征，如图5所示，图5为TrFQR1基因编码蛋白的无序化特征分析图；由图5可知，TrFQR1蛋白进行固有无序化分析的结果显示，TrFQR1蛋白没有无序化特征，预测该蛋白有较强的刚性结构，行使功能时其构象不会发生改变。用NetPhos 3.1Server预测磷酸化位点，如图6所示，图6为TrFQR1基因编码蛋白的磷酸化位点分析图；由图6可知，磷酸化位点预测发现TrFQR1的11、29、53、58、118、162、178位氨基酸为丝氨酸(Ser)磷酸化位点，13、114位为络氨酸(Tyr)磷酸化位点，43、64、102、116、126、168、194、196位为苏氨酸(Thr)磷酸化位点。用ExPASy-PROSITE预测发现TrFQR1具有Flavodoxin-like结构域，在N端11～15位氨基酸和C端112～165位氨基酸是FMN结合区域。用SOPMA工具分析氨基酸序列二级结构，如图7所示，图7为TrFQR1基因编码蛋白的二级结构图；由图7表明，该蛋白中，α-螺旋(α-helix)有100个氨基酸，占总量的49.26％；无规则卷曲有54个氨基酸，占26.6％；延伸链和β-转角各29和20个，分别占14.29％和9.85％。图8为TrFQR1基因编码蛋白的三级结构图。

实施例1

1)、材料选择：选取白花三叶草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒后用Hoagland全营养液水培于光照培养箱中12h光照(23℃)，12h无光(19℃)，相对湿度75％，光照强度250umol·m^-2·s^-1，培养30d；然后取0.1g离体根和叶片分别进行如下处理：1)200mmol/L NaCl；2)15％PEG；3)4℃低温；4)35℃高温；5)600μmol/L CdSO₄；6)5mmol/LCaCl₂；7)10mmol/L H₂O₂；8)25μmmol/L SNP；9)100mM ABA；10)20μM Spm；11)1mM IAA；在处理时间0h、1.5h、3h、6h、12h和24h后取样，

2)、白花三叶草总RNA的提取：首先，取步骤1)得到的白花三叶草叶片，然后采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒提取白花三叶草叶的RNA；

3)、cDNA的合成；首先，在微型管中配制反应混合液，随后42℃反应2min，冰上迅速冷却，所述反应混合液体系如表1所示：

表1反应混合液体系表

接着，在另一微型管中配制反转录反应液总量为20μL，缓慢混匀后采用PrimeScript^TMI II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录反应，反应过程如下：先在37℃下反应15min后，再85℃5sec，冰上冷却，所述反转录反应液体系如表2所示：

表2反转录反应液表

3)荧光定量qRT-PCR：荧光定量qRT-PCR反应体系及程序参考SYBR Premix ExTaqTM试剂盒说明书进行，反应程序为：(1)95.0℃，30sec；(2)94.0℃，30.0sec；58.0℃，30.0sec；58.0℃，30.0sec；72.0℃，60.0sec；共30cycles；(3)72.0℃，5.0min；4.0℃∞。

检测TrFQR1与内参基因β-Actin的Ct值，样品设3个独立的生物学重复。采用2^–ΔΔCt方法计算，相对表达量(Relative quantification)＝2^{–ΔΔCt目的基因}。

TrFQR1引物序列为：

Forward primer(5'--3'):CTCCTTCCATACTGGTCTCCTCCGC；

Reversed primer(5'--3'):GCCCAAACATTAGGTGGTCTT。

β-Actin引物序列为：

Forward primer(5'--3'):TTACAATGAATTGCGTGTTG；

Reversed primer(5'--3'):AGAGGACAGCCTGAATGG。

图9为TrFQR1在非生物胁迫下的相对表达量；由图9可看出，在5种胁迫处理下，高温胁迫诱导白三叶TrFQR1基因表达的程度最高，在其它的胁迫中也都有显著的升高或降低。胁迫处理的时间不同，植物组织部位不同，白三叶TrFQR1基因的相对表达量也会有差异。在高温胁迫中，白三叶叶片TrFQR1基因相对表达量随胁迫处理的时间，先升高后降低，在高温胁迫处理3h时，显著升高，且达到最大值，约为对照组的134.31倍；根中TrFQR1基因相对表达量随胁迫处理的时间，先降低后升高，在胁迫处理1.5h时，显著降低，且达到最小值，约为对照组的0.14倍，各个胁迫时间点的TrFQR1基因相对表达量很低，显著低于对照组。在PEG胁迫下，白三叶TrFQR1基因在叶片和根中的相对表达量，变化趋势相似，在胁迫处理3h时，其相对表达量显著增加，且达到最大值，分别约为对照组的8.58倍。在盐胁迫下，白三叶叶片中TrFQR1基因的相对表达量随着盐胁迫处理时间的增加而增加，在胁迫处理6h时，显著升高；而根中TrFQR1基因的相对表达量随着盐胁迫处理时间的增加，出现先升高随后降低的趋势，在胁迫处理1.5h时，其相对表达量显著增加，在胁迫处理6h时，达到最大值，约为对照组的11.78倍。在低温胁迫处理中，叶与根中TrFQR1基因的相对表达量变化趋势恰恰相反。在白三叶叶片中，TrFQR1基因相对表达量随低温胁迫处理的时间，先降低后升高，在胁迫处理6h时，显著降低，且达到最小值，约为对照组的0.34倍，整个胁迫处理中TrFQR1基因相对表达量未超过1；在根中，TrFQR1基因相对表达量随低温胁迫处理的时间，先升高后降低，在胁迫处理3h时，显著升高，且达到最大值，约为对照组的3.06倍。在重金属镉的胁迫处理中，白三叶叶片中TrFQR1基因相对表达量随镉胁迫处理时间的增加而增加，在胁迫处理12h时，显著升高；根中TrFQR1基因相对表达量随胁迫处理的时间，先升高后降低再升高，在镉胁迫处理1.5h时，显著升高，且达到最大值，约为对照组的14.7倍。以上结果表明TrFQR1白花三叶草对逆境胁迫的抵抗中发挥了重要作用。

本发明所述的TrFQR1基因通过荧光定量PCR验证了TrFQR1在低温，高温，盐胁迫、干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在低温，高温，盐胁迫、干旱胁迫下，TrFQR1基因在根与叶中的表达量均发生了显著的变化，各胁迫条件及时间点下有所差异。

为了解白三叶TrFQR1在细胞中的部位，将目的基因与绿色荧光蛋白(GFP)通过融合表达载体转化拟南芥原生质体，高效瞬时表达后在蓝光激发下产生绿色荧光。如图9所示，图9为TrFQR1亚细胞定位，图中，上面一排为目标蛋白，下面一排为空载体对照；结果预测大多目标蛋白荧光呈现圆点分布在叶绿体或线粒体的细胞器中。因此，白三叶TrFQR1蛋白质大多数存在于小型细胞器内，没有在液泡和细胞核等大型细胞器中检测到。

本发明还提供了一种TrFQR1基因的克隆方法，其克隆方法包括以下步骤：

1)、材料选择：选取白花三叶草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒后用Hoagland全营养液水培于光照培养箱中12h光照(23℃)，12h无光(19℃)，相对湿度75％，光照强度250umol·m^-2·s^-1，培养30d；

2)、白花三叶草总RNA的提取：首先，取步骤1)得到的白花三叶草叶片，然后采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒提取白花三叶草叶的RNA；

3)、cDNA的合成；首先，在微型管中配制反应混合液，随后42℃反应2min，冰上迅速冷却，所述反应混合液体系如表1所示：

表1反应混合液体系表

接着，在另一微型管中配制反转录反应液总量为20μL，缓慢混匀后采用PrimeScript^TMIII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录反应，反应过程如下：先在37℃下反应15min后，再85℃5sec，冰上冷却，所述反转录反应液体系如表2所示：

表2反转录反应液表

4)、扩增：使用

Max DNA Polymerase进行PCR反应，所述PCR反应体系如表3所示：

表3 PCR反应体系表

PCR反应过程如下：(1)95.0℃，30sec；(2)95.0℃，5.0sec；60.0℃，34sec；共40cycles；(3)95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec。

PCR反应引物为：

Forward primer(5'--3'):ATGGCTGTCAAACTTTACATTGTAT；

Reversed primer(5'--3'):ATTATGCAGCTTCCTTGAGCTTCTT；

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用TIANGEN Mid Purification Kit普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶回收纯化后，得到TrFQR1基因的3’和5’端序列，利用NCBI Blast N和DNAman 6.0拼接得到TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE IDNO.1所示。

本发明还提供了一种TrFQR1基因的表达载体构建方法，首先，提取表达载体pBI121-35S的质粒，通过BamHI和SacI双酶切进行双酶切，将TrFQR1基因的开放阅读框链接到酶切之后的pBI121-35S载体上，转化感受态细胞后，进行Kan抗性筛选，最后对菌液进行PCR验证，并对阳性菌落进行测序，若测序序列与原序列不相同，则表明转化不成功，重复上述步骤再次进行TrFQR1基因的过表达载体构建，若测序序列与原序列相同，则表明转化成功，保存结果正确的菌液至超低温冰箱(-80℃)。

实施例2

1)、选择pBI121为表达载体，载体质粒提取采用TIANgen质粒小提试剂盒并按照其操作说明进行，后利用BamH I和SacI对载体进行双酶切，使之与TrFQR1开放阅读框完整相连，转化农杆菌并挑取单克隆菌落测序检测阳性菌株。将连接成功的阳性单菌落菌液与50％甘油混匀保存于-80℃；

2)、拟南芥的种植与培养：称取一定量的灭菌营养土装入塑料盆钵中置于托盘内；将拟南芥种子小心倒于湿润的滤纸上，置于4℃冰箱春化2-3天；使用镊子均匀地将春化后的种子于与装满营养土的盆钵内，在21℃、光照/黑暗8h/16h条件下(1月后调整为光照/黑暗16h/8h)培养；每隔3-4天浇水一次，待其发芽一月以后，每半个月浇一次1/2Hoagland营养液。

3)、花序浸染法转化拟南芥；将含有目的基因的农杆菌于2mL Kan抗性的液体LB培养基中(28℃200r/min)过夜培养；将培养后的菌液(0.5％)于200mL Kan抗性的液体LB培养基中(28℃200r/min)过夜培养；将上述菌液取50mL于4℃8000r/min离心10min，后取上清液悬浮于5％蔗糖溶液(称取35g蔗糖于ddH₂O定容至700mL，加入140μl silwet混匀)；测定菌液OD₆₀₀值为0.8(5％蔗糖溶液调零)；剪去拟南芥已开花的花序及荚果，将未开花但是露白的花序浸入农杆菌菌液中15sec左右；浇水后在黑暗条件下培养48h后正常培养，收取T0代种子。选取饱满的T0代种子消毒后均匀置于Kan抗性的1/2MS培养基中，4℃春化2d后正常条件培养；培养两周后，选取生长良好、长势正常的拟南芥移栽至装满营养土的盆钵中；提取拟南芥叶片DNA，以此为模板，进行PCR验证，将与目标条带一只的产物送华大基因测序比对。经过鉴定，共鉴定出10株转基因植株，随机选取第3和8株进行后续试验。将验证正确的拟南芥收取种子后继续培养。干旱胁迫处理方法为移栽时浇足水后自然干旱，观察其表型变化。

4)、拟南芥指标测定：分别选择长势正常且相近的转基因植株和野生型植株进行相关指标的测定。在拟南芥移栽1周后分别采用自然干旱，300mM NaCl和放于40℃高温培养箱进行干旱胁迫，盐胁迫和高温。待有显著差异后取样测试相关生理指标：叶片相对含水量(RWC)，电解质渗透率(EL)和丙二醛(MDA)含量。

图11为野生型拟南芥(Col-0)、转基因植株T1、转基因植株T2和转基因植株T3在筛选培养基上的生长情况，其中，A-野生型拟南芥；B-T1代植株；C-T2代植株；D-T3代植株；由此可看出转基因白三叶筛选到T3代时，几乎所有种子都能在筛选培养基上生长。将得到的不同株系的拟南芥T3进行PCR验证，确定拟南芥阳性植株，把得到的阳性植株株系分别表示为OE1、OE3、OE4、OE5、OE7，如图12所示，图12为不同株系的拟南芥T3进行PCR验证图。再由实时荧光定量PCR检测目的基因在不同株系中的表达量，如图13所示，图13为TrFQR1在不同株系中的相对表达量，选择TrFQR1基因相对表达量较高，含量相近的两个株系OE3、OE7作为后续非生物胁迫的材料。

本试验设计3种非生物胁迫来初步验证白三叶TrFQR1的基因功能。在盐胁迫、干旱胁迫和高温胁迫中，过表达植株表现出显著的抗旱性和耐高温能力，而耐盐性没有明显提高。基于醌还原酶的生物学特性来看，醌还原酶能够传递电子，还原底物，推测TrFQR1基因能够清除活性氧，减缓白三叶在干旱、高温胁迫下的氧化伤害。

图14为TrFQR1转基因拟南芥与野生型拟南芥表地上部分的形态差异对比图；图15为TrFQR1转基因拟南芥与野生型拟南芥根系生长情况对比图；图16为TrFQR1转基因拟南芥与野生型拟南芥过表达株系须根数目的变化对比图。由图14-16可以看出，转基因植株较野生型的须根数量显著增加，说明TrFQR1具有促进植物根系生长的作用。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> TrFQR1基因及其克隆、表达载体构建方法和应用

<130> 2020

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1003

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

cctttgaaga cttcatcaat ggctgtcaaa ctttacattg tatactactc catgtatgga 60

catgttgaga aactagcaga agaaataaag aaaggagctg cttctgtgga aggtgtcgag 120

gccaaattat ggcaggtacc tgagacactg catgaggaag tgctaggtaa gatgagtgca 180

ccaccgaaga gtgatgtaca aatcatcacc ccagatgaac tcgctgaggc tgatggtttt 240

gtgtttggat tcccaacaag atttggaatg atggctgctc aattcaaagc ttttctagat 300

gctactggtg gtttatggag aacacaaaag cttgcaggca agcctgccgg aatcttctac 360

agcaccggtt ctcaaggcgg tggacaagag actacagcgc ttaccgctat tactcagctg 420

gttcatcatg gaatgatatt tgtcccaatc ggttatacat tcggagcagg aatgttcgag 480

atggagcaag tgaaaggtgg aagtccatat ggtgcaggaa catatgccgg agacggctca 540

agacagccaa gtgagcttga actgcagcaa gcattccatc aagggaaata tcttgccacc 600

atcacaaaga agctcaagga agctgcataa tgtcgaaatc agatattata tagacaatat 660

actatatgtt aaactacacc aaaatatttc ttgaaaacct ttaccattac cgtttaccat 720

tttttcgact cggaatatat ctgttctata tttctgttgc tacaatttat tttccttcca 780

atttacagaa agagattgct ttgtatgatg tgtgttagag gatgcagttg ttcttaaaaa 840

tttgttgaat gatgaaagtt tgttttgtaa tgtttgttct tgttaggttg ggaaaataat 900

tgttcctata ttttgtattc tatatataat gaattttaat tccaataagc aaagttttat 960

acactaaaaa aggaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1003

<210> 2

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Met Ala Val Lys Leu Tyr Ile Val Tyr Tyr Ser Met Tyr Gly His Val

1               5                   10                  15

Glu Lys Leu Ala Glu Glu Ile Lys Lys Gly Ala Ala Ser Val Glu Gly

            20                  25                  30

Val Glu Ala Lys Leu Trp Gln Val Pro Glu Thr Leu His Glu Glu Val

        35                  40                  45

Leu Gly Lys Met Ser Ala Pro Pro Lys Ser Asp Val Gln Ile Ile Thr

    50                  55                  60

Pro Asp Glu Leu Ala Glu Ala Asp Gly Phe Val Phe Gly Phe Pro Thr

65                  70                  75                  80

Arg Phe Gly Met Met Ala Ala Gln Phe Lys Ala Phe Leu Asp Ala Thr

                85                  90                  95

Gly Gly Leu Trp Arg Thr Gln Lys Leu Ala Gly Lys Pro Ala Gly Ile

            100                 105                 110

Phe Tyr Ser Thr Gly Ser Gln Gly Gly Gly Gln Glu Thr Thr Ala Leu

        115                 120                 125

Thr Ala Ile Thr Gln Leu Val His His Gly Met Ile Phe Val Pro Ile

    130                 135                 140

Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Met Phe Glu Met Glu Gln Val Lys Gly

145                 150                 155                 160

Gly Ser Pro Tyr Gly Ala Gly Thr Tyr Ala Gly Asp Gly Ser Arg Gln

                165                 170                 175

Pro Ser Glu Leu Glu Leu Gln Gln Ala Phe His Gln Gly Lys Tyr Leu

            180                 185                 190

Ala Thr Ile Thr Lys Lys Leu Lys Glu Ala Ala

        195                 200

Claims (2)

1.TrFQR1基因在白花三叶草或拟南芥高温和干旱胁迫中的应用，所述TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.TrFQR1基因在促进拟南芥须根生长中的应用，所述TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

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