CN115838734A - C2h2型锌指蛋白基因hstl在调控水稻耐盐性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，尤其涉及C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明利用CRISPR/Cas9技术构建了hstl单突变体和hstl/hst双突变体，并通过鉴定突变体在提高水稻耐盐性方面所发挥的功能，探究对水稻盐胁迫应答的调控机制，这对培育新的高耐盐性水稻品种具有重要的意义。

Description

C2H2型锌指蛋白基因HSTL在调控水稻耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子 HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。

背景技术

高盐度是农业中最严重的非生物胁迫之一。研究人员已经分离克隆了不同植物的盐诱导基因。ABA在植物的渗透胁迫反应中起关键作用。在盐胁迫下，植物启动ABA信号转导途径以激活防御相关基因的表达，其中C2H2锌指蛋白发挥重要作用。盐胁迫导致活性氧的积累，这对植物细胞是有毒的。C2H2锌指蛋白可调节与ROS清除有关的基因的表达，以减少盐胁迫下H₂O₂的积累。据报道，从水稻中分离的ZFP179含有两个典型的C2H2锌指结构域和位于其C-末端的DLN-box/EAR-基序，并且在功能上是一种新的盐响应基因。ZFP179过量表达的转基因水稻显示出耐盐性增强。当水稻遭受盐胁迫时，ZFP179可通过三种机制增加植物耐盐性：ABA依赖途径，ABA非依赖途径和ROS清除系统。在ZFP179过表达转基因水稻植株中，ABA依赖性途径中δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Delta1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase，OsP5CS)和脯氨酸转运(Proline transport，OsProT)基因的表达上调，因此脯氨酸含量增加。在ABA非依赖途径中，OsDREBA2A(Dehydration-responsive elementbinding 2A) 基因的表达增强，导致耐盐性提高。此外，ZFP179可以增加植物细胞的ROS清除活性，从而减少高盐胁迫下的氧化应激。另一种水稻C2H2锌指蛋白基因ZFP182编码具有核定位信号的蛋白质和富含亮氨酸的结构域，然而没有DLN-box/EAR-基序。ZFP182在成熟水稻植物的叶，茎，根和穗中组成性表达。对其转录水平和启动子的分析显示ZFP182由盐和ABA诱导，表明ZFP182可能通过ABA依赖途径在耐盐性中起重要作用。

Ma等在小麦中克隆了新的基因TaZNF(Triticum aestivum predicted Dof zincfinger protein)。TaZNF属于C2H2锌指转录因子家族。TaZNF的过表达提高了拟南芥的耐盐性。在盐胁迫下，转基因植物积累了大量的脯氨酸和叶绿素。此外，转基因植物通过减少气孔张开来保持较高的含水量以保护植物免受盐胁迫。这些结果表明，TaZNF确实与植物的耐盐性有关。

研究者已报道了在盐胁迫下其他C2H2锌指蛋白，包括编码STZ和3种拟南芥锌指蛋白的表达分析。在高盐胁迫下，4个锌指蛋白基因AZF1、AZF2、AZF3和STZ的表达水平均有所提高，但AZF2的表达水平未提高。在这四种锌指蛋白中，只有ABA处理强烈诱导AZF2 表达，其诱导动力学与高盐度引起的诱导相似。Guo等利用生物信息学方法和RT-PCR从水稻幼苗中分离到两个C2H2锌指蛋白基因RZF5和RZF71。表达分析表明，在水稻幼苗中用150 mMNaCl和20％聚乙二醇(PEG)6000处理显著增强了RZF5和RZF71的表达，而ABA处理对这些基因的表达几乎没有影响。RZF5和RZF71的过表达显著提高了转基因植物的抗盐性。

目前，全球土地盐碱化问题日趋严重，成为限制农业生产发展的主要障碍因素。水稻在长期进化中逐渐形成了多种响应盐胁迫的生理调控保护机制。C2H2型锌指蛋白基因最早在非洲爪蟾中发现，植物中发现的第一个C2H2型锌指蛋白基因是在矮牵牛中分离得到的ZPT2-1，之后陆续在拟南芥、棉花、大豆、水稻等植物中分离到了该类型的锌指蛋白。研究发现，C2H2 型转录因子是锌指结构转录因子家族的主要成员之一，主要参与植物生长、发育以及对多种非生物胁迫的应答，如低温胁迫、盐胁迫、光照胁迫和干旱胁迫等方面。本研究组前期获得了一个水稻耐高温突变体hst，其突变基因为C2H2型锌指蛋白中的HST转录因子。在此基础上，发现了与HST具有相同锌指结构域的同源物HSTL。

发明内容

为了解析水稻响应盐胁迫响的分子生理机制，为培育高耐盐性的水稻品种提供基础，本发明提供了C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。本申请利用CRISPR/Cas9技术构建了hstl单突变体和hstl/hst 双突变体，并通过鉴定突变体在提高水稻耐盐性方面所发挥的功能，探究对水稻盐胁迫应答的调控机制，这对培育新的高耐盐性水稻品种具有重要的意义。

为了实现上述的发明目的，本发明采用了以下的技术方案：

C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

作为优选，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过负调控作用影响水稻耐盐性。

作为优选，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过调控抗氧化酶活性影响水稻的耐盐性；优选，抗氧化酶为POD、SOD和CAT。

作为优选，所述高耐盐性水稻品种为通过CRISPR/Cas9技术，在HSTL基因内选取靶位点将该基因敲除所获得的水稻突变体；作为优选，所述的水稻突变体为hstl单突变体或hstl/hst 双突变体；最优选hstl单突变体为hstl 3-1和hstl 12-1，hstl/hst双突变体为hstl/hst 15-2和 hstl/hst 3-2。

进一步，本申请提供了一种基因敲除载体，为C2H2型锌指蛋白基因HSTL的CRISPR/Cas9 基因敲除载体，包含SEQ ID NO：3-6所示的核苷酸序列。

进一步，本申请提供了一种重组菌和/或转基因细胞系，包含所述的基因敲除载体。

进一步，本申请提供了所述的基因敲除载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。

进一步，本申请提供了所述高耐盐性水稻品种的培育方法，包括以下步骤：通过CRISPR/Cas9技术，设计特异性靶向HSTL基因编码序列的sgRNA，构建得到基因敲除载体，将其转化入水稻，对获得的植株进行鉴定以获得水稻突变体。

作为优选，所述sgRNA表达框的引物序列如SEQIDNO：7-10所示。

作为优选，所述水稻突变体鉴定的引物序列如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示。

本发明的有益效果是：本申请提出的SEQIDNO：1所示的HSTL基因及其编码的转录因子HSTL对水稻的耐盐性有负调控作用，该转录因子的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，通过水稻盐胁迫表型鉴定和生理机制的分析，在hstl单突变体和hstl/hst双突变体中，水稻的耐盐性均有增强，水稻长势和存活率均高于野生型，同时具有较高的相对含水量和抗氧化酶活性，失水率较低，其中双突变体的效果更为明显，证明了HSTL及其转录因子HSTL在水稻抵抗盐胁迫中发挥了重要的功能作用，为培育高耐盐性的水稻品种提供了参考，而且本申请通过基因工程方法提高水稻的耐盐性也为揭示水稻耐盐性的分子机制提供了理论依据，对解析水稻盐胁迫响应的机制具有重要意义。

附图说明

图1：采用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除载体的流程图；

图2：基因敲除载体的电泳图；

图3：基因敲除载体的测序结果；

图4：CRISPR/Cas9突变位点序列比对；

图5：HSTL在野生型水稻不同时期不同器官的表达特征；

图6：盐胁迫不同时间后HSTL的表达特征；

图7：120mM NaCl盐胁迫后水稻野生型ZH11、突变体和双突变体表型比较；

图8：盐胁迫后水稻野生型ZH11、突变体和双突变体存活率比较；

图9：相对含水量；

图10：盐胁迫下不同时间点野生型ZH11和突变体及双突变体叶片中(1)H₂O₂及(2)MDA 含量；

图11：盐胁迫不同时间下野生型ZH11和突变体及双突变体中抗氧化酶酶活测定((A)POD；(B)SOD；(C)CAT)。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1实验材料及其获得过程：

实验材料：野生型水稻中花11(OryzasativaL.ssp.Japonicacv.ZH11)、突变体hst、hstl3-1、 hstl12-1、双突变体hstl/hst3-2、hstl/hst15-2。

获得过程：hstl单突变体和hstl/hst双突变体的构建和鉴定

从NCBI中下载HSTL基因(LOC_Os12g42250)cDNA序列，设计CDS序列特异性引物。引物均采用Primer5.0软件设计。引物合成与纯化PCR产物及阳性克隆菌液测序由上海生物工程有限公司完成。

CRISPR/Cas9敲除载体构建的具体操作步骤为：

(1)CRISPR-Plant(www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)设计HSTL靶位点引物。

(2)靶点接头制备(U3和U6a分开)。将靶标引物稀释到100μM，方法如下：U3-F和U3-R (U6a-F和U6a-R)各取1μL加入到98μL dH₂O混合稀释到1μM，90℃处理30s，立即放置在冰上，备用。

(3)边切边连(第一次)。配制10μl酶切连接反应液(U3和U6a分开)。体系如表1所示， PCR程序：37℃5min；20℃5min，共进行4个循环。

表1酶切连接反应体系(10μL体系)

(4)两轮PCR扩增gRNA表达盒

Ⅰ：第一轮PCR扩增(每个gRNA表达盒共进行2个PCR反应，共4个反应)，反应体系如表2，PCR程序如表3。扩增反应完成后取4μl电泳检查。

表2第一轮PCR反应体系(20μL体系)

表3PCR反应程序

Ⅱ：第二轮PCR扩增：预先将两对位置特异引物混合成工作液，每对1.5μM：B1’+B2(PT1)； B2’+BL(PT2)。其中，PT1扩增U3-gRNA表达盒，PT2扩增U6a-gRNA表达盒。反应体系如表4，反应程序如表3。反应完成后取2-3μl电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。

表4第二轮PCR反应体系(50μL体系)

(5)将第二轮PCR反应液的U3-gRNA表达盒和U6a-gRNA表达盒混合在一起，使用Magen HiPure Gel Pure DNA Mini Kit回收目的片段，具体步骤参照说明书。

(6)边切边连(第二次)。配置15μL酶切连接反应体系，反应体系如表5，PCR反应程序如表6。

表5酶切连接反应体系(15μL体系)

表6酶切连接反应程序

(7)转化。操作如下：将6μL连接产物与60μL大肠杆菌DH5α感受态细胞在离心管中混匀，冰浴30min；42℃水浴热激60s，立即置于冰上2min；加入500μL无抗LB液体培养基，混匀，37℃，220rpm/min摇1h；用移液枪吸取200μL，将其均匀涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上，至菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h。

(8)挑取单克隆菌落及菌液PCR鉴定。镊子夹取枪头挑取单克隆菌落至含卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃，220rpm/min摇3h后进行菌液PCR反应，共3个PCR反应，引物分别为SP-ML/U3-R(U3)，U3-F/SP-R(U6a)和SP-ML/SP-R(U3+U6a)。引物序列如下，反应体系如表7，反应程序如表8。反应完成后取8μL进行电泳验证产物长度是否符合。

载体构建相关引物序列：

U-F：5'-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'；

gRNA-R：5'-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3'；

B1：5'-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；

B2：5'-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；

B2’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；

BL：5'-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；

SP-ML：5'-GCGCGGTGTCATCTATGTTACTA-3'；

SP-R：5'-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3'；

U3-F：5'-ggcATCGACCTCTCGCTGACGCT-3'；

U3-R：5'-aaacAGCGTCAGCGAGAGGTCGA-3'；

U6a-F：5'-gccGAAGCCGTCTTCGTCGACGA-3'；

U6a-R：5'-aaacTCGTCGACGAAGACGGCTT–3'。

表7菌液PCR反应体系(20μL体系)

表8菌液PCR反应程序

(9)菌液测序及质粒提取。取1ml菌液送测序，菌液测序由杭州尚亚生物技术有限公司完成。测序结果比对成功后，取200μl原始菌液置于8ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃， 220rpm/min摇12-16h。质粒提取使用Magen HiPure Plasmid Micro Kit C，具体操作步骤参考说明书。

(10)使用MEGA 6.0对测序结果与目标序列进行比对。

CRISPR/Cas9编辑系统的突变效率高且操作简单，在植物基因的功能研究中得到了广泛运用。构建流程图如图1所示，在HSTL的CRISPR/Cas9敲除载体构建过程中，在目标编辑区插入了U3和U6a两个启动子，有助于提高打靶效率。构建过程中的电泳图如图2所示，PCR结果与预期相符。测序结果如图3，证明已将设计的两个靶位点序列插入到表达盒中，且保证了靶位点序列的高保真性。

将构建成功的HSTL基因敲除载体转化至水稻野生型ZH11和突变体hst中获得hstl单突变体和hstl/hst双突变体。

水稻HSTL CRISPR/Cas9转基因植株的阳性鉴定：

CRISPR/Cas9敲除载体在水稻野生型ZH11和突变体hst中的转化完成后，获得T0代水稻转基因苗。以T0代水稻叶片为材料提取DNA，进行PCR阳性鉴定。获得的阳性植株经突变鉴定以及测序结果显示，无纯合突变体植株存在，因此需获得T1代种子后才能进行突变鉴定。从T1代种子中进行突变鉴定，通过测序分析获得了纯合突变体，从中选择4种纯合突变体作为材料。

CRISPR/Cas9阳性植株突变鉴定：

(1)CRISPR/Cas9阳性植株突变鉴定引物：

HSTL-F：5'-CCATTTCTCATCACTGAGCT-3'

HSTL-R：5'-ATTCTGGTGTCCCCCTAGCGC-3'

(2)在获得的阳性植株的T1代种子中选了4个株系的种子进行突变鉴定，经过苗期的初步表型分析，选择了hstl3-1和hstl12-1单突变体，hstl/hst3-2和hstl/hst15-2双突变体进行后续实验。

(3)CRISPR/Cas9突变位点序列比对如图4所示。

表8突变体hstl和双突变体hstl/hst水稻植株突变类型统计表

实施例2实验方法

水稻培养、盐处理及恢复：

挑选粒大饱满的ZH11、hstl3-1、hstl12-1、hst、hstl/hst3-2和hstl/hst15-2水稻种子，用 0.1％稀HNO₃溶液破休眠处理16h，5％NaClO消毒20min，萌发后置于人工气候箱培养。将 14d龄的幼苗进行120mM NaCl盐处理18d，再移至正常培养条件下恢复16d，观察苗的长势，统计存活率、拍照并取样以进行后期实验。

生理指标测定：

失水率：用10株14d离体水稻叶片迅速称量其鲜重W₁，置于30℃恒温培养箱中上，每隔30min称量一次植株的鲜重W₂，直至失水率水平趋于平缓，确定其失水率。

相对含水量：用120mM NaCl处理0、12、24、48、72h，以6片14d龄植株的完全展开叶片为材料，将其浸入到盛满蒸馏水的试管中，利用真空泵抽真空5min，3次后，浸泡过夜，使叶片组织吸水，每次浸入前称重，得到植物叶片在吸水达到饱和时的重量，最后在80℃烘箱中干燥4h后称重，确定其相对含水量。

H₂O₂含量：称取120mM NaCl处理0、1、2、4、8h的0.1g水稻叶片，制备植物组织匀浆，利用过氧化氢试剂盒测定H₂O₂含量。

MDA含量：称取120mM NaCl处理0、2、4、8、12、24h的0.1g水稻叶片，制备1.4％野生型和突变体水稻组织样本匀浆，利用MDA试剂盒测定并根据公式计算MDA含量。

清除H₂O₂相关酶的活性：制备植物组织匀浆，利用超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等测定试剂盒测定相关生理指标。

基因表达检测：

水稻总RNA的提取：利用康为世纪RNA提取试剂盒提取在高温处理不同时间点下的野生型水稻叶和根中的总RNA，具体实验操作步骤参考试剂盒说明书。RNA易降解，实验前需用75％乙醇擦拭实验台。提取的RNA应立即在超微量分光光度计上测定RNA浓度和纯度，确定所提取的RNA样品合格后，利用逆转录试剂盒进行逆转录。剩下的RNA置于-80℃超低温冰箱保存。

水稻花药总RNA的提取：利用LC Sciences Total RNA purification kit提取野生型在高温处理不同时间点下的花药总RNA，具体实验操作步骤参照试剂盒说明书。然后在超微量分光光度计上测定RNA的浓度和纯度，确定RNA样品合格后，立即进行逆转录反应。剩下的RNA 置于-80℃超低温冰箱保存。

RNA样品的逆转录：利用Takara逆转录试剂盒对所提的RNA进行逆转录，实验步骤参考试剂盒说明书。RNA逆转录的反应程序：37℃，15min；85℃，5s；4℃，恒温保存。逆转录完成后，-20℃保存cDNA样品，写好标签。用于qRT-PCR的cDNA需稀释3倍后才能使用。

取苗期、拔节期、花期野生型ZH11水稻植株根、茎、叶、节、花药作为材料，利用Takara Mini BEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，采用TaKaRa第一链cDNA合成试剂盒 Prime Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行总RNA逆转录；利用实时荧光定量法 PCR分析HSTL在野生型ZH11不同器官中的表达特征，以及分析14dZH11在盐胁迫不同时段下(0、0.5、1、2、4h)HSTL的表达，对每个cDNA样品做3次生物学重复实验。

qRT-PCR反应体系(10μL体系)为：SYBR/TB-Green 5μL，PrimerF 0.4μL，PrimerR0.4μL， ddH₂O 3.2μL，cDNA1μL。反应程序为：变性95℃1min，热变性94℃10s，退火55℃15s，延伸72℃15s(共45个循环)。内参β-actin-F序列为5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3，β-actin-R 序列为5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3，HSTL-F序列为5'-CCCTTCTCTTTCCATCGTC-3， HSTL-R序列为5'-CTCTGTTGTTGTCACCACC-3。定量数据采用2^-ΔΔCt方法进行分析。

数据处理与分析：

所有实验均选取3个生物学重复。使用Excel软件进行数据分析，数据均以平均值±方差 (Mean±SD)表示，方差采用(P<0.05)；作图使用GraphpadPrism9.0。

实施例3荧光定量PCR分析水稻中HSTL的表达情况

HSTL在不同时期水稻不同器官的表达特征分析：

我们采用实时荧光定量PCR技术对HSTL在水稻不同时期不同器官的表达特征进行分析。如图5所示，在苗期，HSTL在叶中表达的比较多，在根和茎中表达的相对较少。在拔节期， HSTL在叶和节中表达的比较多，在根和茎中表达的比较少。在花期，HSTL在茎中表达的最多，在叶中也有较多的表达，在根和节中表达的比较少，在花药中表达的最少。

HSTL在盐胁迫下的表达检测：

我们还进行了HSTL在盐胁迫不同时间下的表达检测。如图6所示，14d苗龄的野生型 ZH11植株在盐胁迫0.5h，HSTL在叶中的表达略微下降；在盐胁迫0.5h后呈上升趋势，盐胁迫1h后明显上升。盐胁迫4h后，HSTL相比于盐胁迫2h前有较高的表达量。经过4h的盐胁迫，HSTL受外界环境强烈诱导，在植物体内表达量增高，结果表明HSTL与水稻盐胁迫响应相关。

实施例4hstl单突变体和hstl/hst双突变体的表型和生理机制分析

盐胁迫对水稻表型的影响：

由图7可知，盐处理前14d的野生型植株、突变体及双突变体长势基本一致。盐胁迫18d 后，野生型ZH11出现大量萎蔫，突变体及双突变体部分倒伏。将盐胁迫18d的水稻苗移至正常培养条件下恢复16d，发现野生型ZH11部分枯萎，突变体及双突变体少量萎蔫。统计可得图8，在盐胁迫下双突变体存活率最高，hstl/hst3-2达81.67％，hstl/hst15-2为80.00％；突变体次之，野生型ZH11存活率最低，仅40.00％；说明HSTL在耐盐性上发挥重要作用。

盐胁迫对水稻生理机制的影响：

失水率和相对含水量分析：

如图9所示，在盐胁迫过程中，与野生型ZH11相比，突变体及双突变体失水率更低，因此突变体及双突变体能保持更多的水分。盐胁迫导致水稻叶片相对含水量降低，且双突变体 hstl/hst15-2含量始终最高，未处理前相对含水量有96.14％，盐处理72h后，仍有88.76％；双突变体hstl/hst15-2及hstl/hst3-2的相对含水量高于单突变体，野生型ZH11最低。因此HSTL 更能减少水分损失，使双突变体在盐胁迫存活率最高。

H₂O₂是导致植物体内气孔关闭的重要信号分子。盐处理之前，突变体hst、hstl/hst3-2的 H₂O₂含量比野生型ZH11高；随着盐处理时间的增加，除hstl12-1外，其余双突变体与突变体的H₂O₂含量均比野生型ZH11高(如图10-1)。在盐处理2h后，hstl/hst15-2含量达5.7mmol/g protein。在盐处理过程中，突变体与双突变体体内比野生型积累更高浓度的H₂O₂，H₂O₂含量的增加，诱导水稻气孔关闭，使突变体和双突变体具有较高含水量，从而突变体与双突变体具有较强的耐盐性。

如图10-2，MDA作为脂质过氧化程度的指标，反映了植物受逆境胁迫的伤害程度。未经盐处理前，双突变体hstl/hst3-2含量最高，ZH11次之；在经盐胁迫24h后，野生型MDA含量最高，hstl12-1、hst次之，双突变体hstl/hst3-2、hstl/hst15-2MDA含量最低。说明在受到盐胁迫后，水稻双突变体细胞受损最轻微，野生型细胞受损最严重。说明HSTL可以减少水稻植株叶片的细胞受损。

POD、SOD、CAT为抗氧化酶，为植物的活性氧(ROS)清除系统的重要成员。如图11-A所示，盐处理之前，野生型ZH11的POD酶活最低，双突变体hstl/hst15-2最高，盐处理72h时，hstl/hst15-2酶活最高，ZH11的POD酶活最低，两者活性相差最大。如图11-B，在盐处理过程中，野生型ZH11的SOD含量在12h达到最高，但突变体及双突变体SOD酶活基本高于野生型ZH11；如图11-C，在盐处理过程中，野生型ZH11的CAT酶活一直比hst低，且呈下降趋势，在盐处理72h后，ZH11的CAT活性达最低，突变体次之，双突变体CAT活性最高。说明盐胁迫下，HSTL能增强植物的抗氧化酶活性，提高抗氧化胁迫的能力。它们能够清除过多的H₂O₂，对植物的抗衰老以及代谢有着非常重要的意义。

本文以实验室前期获得的野生型ZH11、突变体hst、hst13-1、hstl12-1、双突变体hstl/hst3-2、 hstl/hst15-2等6个品种水稻作为试验材料，探究HSTL对水稻盐胁迫应答的调控机制，为揭示水稻对耐盐性的分子机制提供理论依据，对培育高产、优质、抗逆的水稻新品种提供参考。实验表明HSTL的敲除会增加水稻的耐盐性。进行苗期耐盐表型的鉴定，发现盐处理前三者长势基本一致。盐胁迫后，野生型ZH11出现大量倒伏，萎蔫现象严重，而突变体均表现出一定的耐盐性，存活率明显高于野生型。因此，说明HSTL在耐盐性上发挥重要作用。

锌指蛋白是一个大的转录因子家族，在植物界中广泛分布。HSTL是C2H2锌指转录因子的一种，在细胞抵抗盐胁迫中发挥重要的作用。大量研究表明，H₂O₂作为ROS的一种类型，还可以参与调控植物气孔的关闭，减少植物叶片水分的损失。Huang等(2009)克隆并鉴定了一种C2H2锌指转录因子DST，发现DST介导了H₂O₂诱导气孔关闭的信号转导途径。DST 直接调控H₂O₂代谢相关基因(如过氧化物酶Prx24)的表达，提高了H₂O₂在保卫细胞中的累积，促使叶片气孔关闭。DST功能的丧失增加了气孔闭度，降低了气孔密度，从而增强了水稻的耐盐性。本实验中，突变体hst、hstl3-1、hstl12-1、双突变体hstl/hst3-2、hstl/hst15-2中由于HSTL的敲除，H₂O₂清除基因表达量的下降，导致突变体内H₂O₂的高积累，进一步促使气孔关闭，相对含水量增加，从而获得了一定的耐盐性。盐处理前突变体与双突变体体内积累更高浓度的H₂O₂，可能是导致HSTL突变耐盐的原因之一。

当植物受到盐胁迫应激时，它们会识别盐应激并使用高度复杂的细胞内信号系统(如ROS) 做出反应。研究发现OsZFP213过表达植株表现出较高的抗氧化酶如SOD，CAT活性。通过酵母双杂交和双分子荧光互补等技术发现，水稻蛋白激酶OsMAPK3与OsZFP213相互作用增强ROS的清除能力进而来提高了水稻的耐盐性。我们研究发现盐处理后，双突变体以及单突变体中H₂O₂含量显著提高且高于野生型。由此初步推测HSTL可以通过增加叶片中的H₂O₂含量，使叶片保持更多水分，从而抵御盐胁迫下的生理干旱。另外，本文使用定量PCR技术对HSTL进行苗期表达量分析，发现未经盐处理的野生型植株叶中的HSTL表达量较低。盐胁迫后HSTL表达量整体上看呈上升趋势。并使用qRT-PCR对水稻不同生长时期不同器官进行HSTL表达量分析，总体上看，HSTL在叶中的表达量最高。水稻不同器官中HSTL的表达量随水稻的生长时期发生改变，这可能与水稻不同时期对抗盐胁迫逆境及耐盐能力的不同有关。以上研究表明突变体hst、hstl3-1、hstl12-1、双突变体hstl/hst3-2、hstl/hst15-2中由于HSTL 转录因子功能的缺失，H₂O₂清除基因表达量下降，导致突变体内H₂O₂的高积累，提高了突变体的耐盐性。

以上为对本发明实验例的描述，通过对所公开的实验例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实验例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实验例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过负调控作用影响水稻的耐盐性。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过调控抗氧化酶活性影响水稻的耐盐性；优选，抗氧化酶为POD、SOD和CAT。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高耐盐性水稻品种为通过CRISPR/Cas9技术，在HSTL基因内选取靶位点将该基因敲除所获得的水稻突变体；作为优选，所述的水稻突变体为hstl单突变体或hstl/hst双突变体；最优选hstl单突变体为hstl 3-1和hstl 12-1，hstl/hst双突变体为hstl/hst 15-2和hstl/hst 3-2。

5.一种基因敲除载体，其特征在于，为C2H2型锌指蛋白基因HSTL的CRISPR/Cas9基因敲除载体，包含SEQ ID NO：3-6所示的核苷酸序列。

6.一种重组菌和/或转基因细胞系，其特征在于，包含权利要求5所述的基因敲除载体。

7.权利要求5或6所述的基因敲除载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。

8.权利要求1-4任意一项权利要求所述高耐盐性水稻品种的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：通过CRISPR/Cas9技术，设计特异性靶向HSTL基因编码序列的sgRNA，构建得到基因敲除载体，将其转化入水稻，对获得的植株进行鉴定以获得水稻突变体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述sgRNA表达框的引物序列如SEQ IDNO：7-10所示。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述水稻突变体鉴定的引物序列如SEQID NO：11和SEQ ID NO：12所示。

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