CN114736279B

CN114736279B - 一种植物抗逆相关蛋白PvNAC52及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN114736279B
Application number: CN202210501900.9A
Authority: CN
Inventors: 于崧; 刘梦红; 翟玲侠; 秦猛; 张翼飞; 于立河
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2042-05-10
Also published as: CN114736279A

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆相关蛋白PvNAC52及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白PvNAC52，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。实验证明，在拟南芥中过表达PvNAC52基因可以提高拟南芥抗逆性，抗逆性提高表现为：在盐/碱/旱/渗透胁迫下，转基因植物的存活率增加、根长增加、鲜重增加、失水率降低、细胞膜损伤降低、丙二醛含量降低、相对电导率降低、H₂O₂含量降低、超氧阴离子降低、ROS含量降低、过氧化氢酶活性增加、SOD酶活性增加、过氧化物酶活性增加和脯氨酸含量增加。因此，蛋白PvNAC52及其编码基因可以调控植物抗逆性，在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

Description

一种植物抗逆相关蛋白PvNAC52及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物抗逆相关蛋白PvNAC52及其编码基因和应用。

背景技术

植物的非生物胁迫包括干旱胁迫、低温胁迫、盐碱胁迫、高温胁迫及重金属胁迫等，会对植物的生长发育产生非常大的影响。如盐碱胁迫会导致植株不能正常生长、矮小、黄化、萎蔫等；干旱胁迫影响植物的生长发育及生产力，导致细胞能量消耗、氧化还原失衡和氧化损伤等，会影响芸豆的出苗率及长势，导致芸豆产量下降，有些地方甚至会因为干旱出现零产量的现象；低温也是常遇到的一个影响植物生长的情况，低温胁迫会影响芸豆的生长和产量等。

转录因子在植物逆境应答中起着关键性作用，当植物受到逆境时，会通过一系列的信号转导途径激活转录因子。植物已经进化出复杂的响应策略，像转录因子是胁迫响应的主要调节因子，是极好的作物改良候选者。

发明内容

本发明的目的是提高植物的抗逆性。

本发明首先保护来源于芸豆的蛋白质PvNAC52，可为如下1)或2)：

1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

需要说明的是，本发明上述1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于芸豆且与抗逆性相关的蛋白质，以及与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于芸豆且与抗逆性相关的蛋白质，也均应属于本发明的保护范围。

其中，SEQ ID NO:1由340个氨基酸残基组成。

为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6个(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述蛋白质PvNAC52的核酸分子。

所述编码蛋白质PvNAC52的核酸分子可为(a1)或(a2)所示的DNA分子：

(a1)编码区为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子。

需要说明的是，与上述(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于芸豆且编码所述蛋白质PvNAC52的DNA分子，以及在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，来源于芸豆且编码所述蛋白质PvNAC52的DNA分子，也均应属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:2由1023个核苷酸组成，SEQ ID NO:2的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质PvNAC52的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质PvNAC52的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质PvNAC52，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质PvNAC52的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：2所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒PBI121-EGFP-PvNAC52。重组质粒PBI121-EGFP-PvNAC52可为将载体PBI121-EGFP的限制性内切酶SmaⅠ识别序列间的小片段替换为SEQ IDNO.2所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组菌可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌GV3101。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组菌具体可为GV3101/PBI121-EGFP-PvNAC52。所述GV3101/PBI121-EGFP-PvNAC52可为将重组质粒PBI121-EGFP-PvNAC52导入根癌农杆菌GV3101，得到的重组农杆菌。

本发明还保护上述任一所述蛋白质PvNAC52、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌，在调控植物抗逆性中的应用。

本发明还保护上述任一所述蛋白质PvNAC52、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌，在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用。

上述任一所述的应用中，所述调控植物抗逆性可为提高植物抗逆性。

上述任一所述的应用中，所述培育抗逆性改变的转基因植物可为培育抗逆性提高的转基因植物。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入编码所述蛋白质PvNAC52的核酸分子，得到与所述出发植物相比抗逆性提高的转基因植物。

所述向出发植物中导入编码所述蛋白质PvNAC52的核酸分子具体可通过向出发植物导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：提高植物中上述任一所述蛋白质PvNAC52的表达量和/或活性，从而增强植物的抗逆性。

上述任一所述植物可为双子叶植物。可选的为豆科植物，具体为芸豆，特别为龙芸14。或者为十字花科植物，如拟南芥，特别的为哥伦比亚野生型拟南芥。

上述抗逆性提高可表现为存活率增加、根长增加、鲜重增加、失水率降低、细胞膜损伤降低、丙二醛含量降低、相对电导率降低、H₂O₂含量降低、超氧阴离子降低、ROS含量降低、过氧化氢酶活性增加、SOD酶活性增加、过氧化物酶活性增加和脯氨酸含量增加中的至少一种。

上述任一所述抗逆性可为抗碱性、抗盐性、抗旱性和抗渗透性中的一种或几种。

上述任一所述的碱胁迫可通过加入NaHCO₃处理；盐胁迫可通过加入NaCl处理；渗透胁迫可通过加入ABA处理；干旱胁迫可通过加入Mannitol处理。在实验室条件下，加入处理浓度越高，则胁迫程度越大。

实验证明，在拟南芥中过表达PvNAC52基因可以提高拟南芥抗逆性，抗逆性提高表现为：在盐/碱/旱/渗透胁迫下，转基因植物的存活率增加、根长增加、鲜重增加、失水率降低、细胞膜损伤降低、丙二醛含量降低、相对电导率降低、H₂O₂含量降低、超氧阴离子降低、ROS含量降低、过氧化氢酶活性增加、SOD酶活性增加、过氧化物酶活性增加和脯氨酸含量增加。因此，蛋白PvNAC52及其编码基因可以调控植物抗逆性，在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为芸豆cDNA扩增PvNAC52 PCR电泳图；其中，M：Marker 5000；1-2：PvNAC52基因片段。

图2为PBI121-EGFP载体单酶切电泳图；其中，1：PBI121-EGFP质粒；2-5：PBI121-EGFP质粒SmaI单酶切产物；M：Marker 15000。

图3为PvNAC52转基因植物在不同处理下的萌发情况。

图4为根长和鲜重试验的结果。

图5为失水率测定的结果。

图6为细胞膜损伤情况分析的结果。

图7、8为活性氧清除能力及抗氧化酶测定的结果。

图9为脯氨酸含量测定的结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验材料为哥伦比亚野生型拟南芥及芸豆耐盐碱品种龙芸14。从芸豆盐碱叶片组织转录组中获得一个新的蛋白，命名为PvNAC52蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。将编码PvNAC52蛋白的基因命名为PvNAC52基因，开放阅读框如SEQ ID NO:2所示。

下述实施例中的土为人工土(蛭石:黑土＝1:1)，拟南芥培养条件为：温度23℃，光照强度400μmol·m^-2·s^-1，光周期为光照培养16h，黑暗培养8h，湿度70％。芸豆培养条件为：温度25℃，光照强度400μmol·m^-2·s^-1，光周期为光照培养14h，黑暗培养10h，湿度70％。

下述实施例中的所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

下述实施例中的载体PBI121-EGFP为淼灵生物公司产品，产品目录号为P01586。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1PvNAC52基因的克隆

利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取芸豆叶片总RNA，使用ReverTra AceqPCR RTMaster Mix with gDNA Remover(TOYOBO)进行反转录得到产物cDNA。

以cDNA为模板，利用以下引物进行PCR扩增：

PvNAC52-F：5′-ATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAGGATCCCCGGGATGGGAGTTCCAGAG-3′；

PvNAC52-R：5′-TTGCTCACCATAAGGGACTGACCACCCGGGGAATGCCTGAACCCGAATCCCACCGGCTG-3′。

扩增体系如表1，程序如表2。

表1 PCR反应体系

表2菌液PCR反应条件

克隆产物如图1，将得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后利用胶回收试剂盒(OMEGO)回收。

实施例2

转基因植物的获得

一、重组质粒的构建

利用限制性内切酶SmaⅠ将PBI121-EGFP酶切并回收，如图2。将获得的线性化PBI121-EGFP和PvNAC52克隆PCR产物用T4连接酶连接，反应体系如表3，22℃条件下反应10min，得到重组质粒PBI121-EGFP-PvNAC52。同时进行测序验证。

表3 T4连接酶连接体系

二、转基因植物的获得

1、将重组质粒PBI121-EGFP-PvNAC52导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、将农杆菌悬浮制备农杆菌侵染液，调OD₆₀₀为0.6-1。取哥伦比亚野生型拟南芥植株，将花序完全浸入侵染液中15s，10min后，再次浸入侵染液中15s，之后避光培养24h。正常条件下培养2d，再进行侵染一次，避光培养24h。

3、收集侵染后拟南芥植株的成熟种子，用95％酒精和10％NaClO溶液消毒后，播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基中，4℃春化3d，然后在23℃正常条件下培养7d。取正常生长的绿色幼苗移植到土壤中继续培养3周。取拟南芥植株的莲座叶，提取基因组DNA，用PvNAC52特异性引物(实施例1中的引物：PvNAC52-F和PvNAC52-R)进行检测，如果结果为阳性，则该植株为T1代转PvNAC52基因植株。

4、T1代转PvNAC52基因植株自交，收获种子，将种子依次按照步骤3进行操作，将得到T2代转PvNAC52基因种子。

5、T2代转PvNAC52基因植株自交，收获种子，将抽样种子按照步骤3操作，将得到T3代转PvNAC52基因种子。

随机抽取两个纯合的转基因株系，标记为OE3和OE5株系。

三、转空载体植株的获得

用PBI121-EGFP载体替代重组质粒PBI121-EGFP-PvANC52，按照步骤二进行操作，得到空载体株系。

实施例3转基因植物的抗性鉴定

本实施例中通过加入NaHCO₃、NaCl、ABA和Mannitol胁迫来研究该基因对非生物胁迫的抵抗能力。

一、萌发率实验

供试种子：OE3株系的T3代种子、OE5株系的T3代种子、转空载体株系的T3代种子，野生型拟南芥种子。

第一组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率。

第二组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于含7mM NaHCO₃的1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率。

第三组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于含120mM NaCl的1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率。

第四组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于含1.5μM ABA的1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率。

第五组：将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于含300mM Mannitol的1/2MS培养基平板，进行培养，第8天拍照并统计萌发率。

进行三次重复试验，每次试验每个株系用25粒种子。

萌发照片见图3A，萌发率的结果如图3B。结果说明，在对照条件下，4个株系的萌发率都在100％，因此我们可以知道在正常条件下转基因PvNAC52对4个株系没有明显影响，4个株系的生长及萌发率无显著差别。而在NaHCO₃、NaCl、ABA和Mannitol四种处理下2个过表达株系的萌发率是野生型株系及空载株系萌发率的1.4-9倍，过表达株系极显著高于野生型及空载，其中在Mannitol处理下差别最大，过表达株系萌发率在90％左右，而野生型及空载仅有8％-10％。综上，说明PvNAC52影响NaHCO₃、NaCl、ABA和Mannitol处理条件下的拟南芥种子萌发，PvNAC52的过表达会提高拟南芥对NaHCO₃、NaCl、ABA和Mannitol处理的抗逆性。

二、根长和鲜重试验

将供试种子进行消毒，然后将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，进行培养，培养7d。将长势一致的幼苗进行分组处理。

第一组：转移到1/2MS培养基平板，竖直培养，第7d拍照、测量主根长和全株鲜重；

第二组：转移到含有7mM NaHCO₃的1/2MS培养基平板，竖直培养，第7d拍照、测量主根长和全株鲜重；

第三组：转移到含有120mM NaCl的1/2MS培养基平板，竖直培养，第7d拍照、测量主根长和全株鲜重；

第四组：转移到含有1.5μM ABA的1/2MS培养基平板，竖直培养，第7d拍照、测量主根长和全株鲜重；

第五组：转移到含有300mM Mannitol的1/2MS培养基平板，竖直培养，第7d拍照、测量主根长和全株鲜重；

进行三次重复试验，每次试验每个株系测量45-50株植物。

照片见图4A，主根长见图4B，全株鲜重见图4C。正常条件下不同株系的根长及鲜重没有明显差异。然而，在NaHCO₃、NaCl和Mannitol处理条件下，转基因株系的根长及鲜重显著高于野生型拟南芥及空载拟南芥，其中在NaHCO₃处理下根长差异最大，过表达株系的根长约是野生型及空载株系的1.5倍；在Mannitol处理下鲜重差异最大，过表达株系的鲜重约是野生型及空载株系的1.4倍；而在ABA处理下，4个株系的根长及鲜重无明显差异。这说明PvNAC52参与调控盐碱胁迫及渗透胁迫下植物根的生长，PvNAC52提高了转基因拟南芥对盐碱胁迫及渗透胁迫的抗逆性。

三、各项生理指标的测定

1、失水率的测定

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。

称重上述植株叶片5g记0h，之后分别在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h称重，称重后烘干至恒重，用公式失水率＝(鲜重-此阶段鲜重)/(鲜重-干重)计算拟南芥失水率，每个试验三次生物学重复。

失水率结果见图5。植物组织的失水速度越快，在非生物逆境条件下的抵抗力也就越弱。本试验比较各株系叶片的失水率，将4种不同拟南芥株系的叶片剪下后放于室内，通过指定时间称量叶片的重量变化来分析不同植株叶片的失水率情况。通过结果可以得知，两个过表达植株的失水率均显著低于野生型及空载拟南芥，说明PvNAC52基因在植物抵御失水反应中是一个正向调节因子。

2、细胞膜损伤分析

(1)碘化丙啶(PI)根尖染色

PI(Propidium Iodide,碘化丙啶)是一种有机物，可将DNA的细胞核染色，常用于细胞凋亡检测，可以将受到破坏的细胞膜染成红色，

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。用含有10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mM Mannitol的1/2MS培养基处理24h。取根尖进行PI染色。

结果见图6A，在荧光显微镜下观察不同株系根尖的PI颜色深浅状况，在正常培养条件下生长的幼苗根系，转基因株系、野生型株系及空载株系的幼苗根尖的颜色较浅且无显著差异。处理后，4种不同植株幼苗根尖的染色程度都较正常条件下相比颜色都较深，并且与2个过表达株系相比，野生型及空载拟南芥颜色相对更深，这表明在处理下，野生型株系及空载株系细胞死亡更严重。

(2)伊文思蓝染色

伊文思蓝是一种非渗透染料，在质膜存在损伤时，染料可进入细胞质和核中并将它们染成蓝色，可用于检查细胞的活力。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理2h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分进行伊文思蓝染色。

结果见图6B，在正常培养条件下，4个拟南芥株系的染色程度相当，并且颜色较浅。而在处理后，拟南芥的着色程度相对于正常条件下培养颜色略深，其中每个处理的野生型及空载拟南芥的染色程度比2个过表达株系的颜色更深，这表明在处理之后野生型及空载拟南芥细胞膜损伤情况要比2个过表达株系的拟南芥更严重。

(3)丙二醛(MDA)含量测定

当植物衰老或在逆境条件下受到伤害，其体内组织或器官膜脂质发生过氧化反应，继而会产生丙二醛(MDA)，其含量与生物体衰老及逆境伤害有密切关系。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理48h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分用于丙二醛含量测定，试验采用试剂盒法(苏州格锐思G0109F)。试验进行三个生物学重复。

结果见图6C，在正常条件下，4个株系的丙二醛含量无显著差异。而在处理后，无论是过表达株系或是野生型及空载株系丙二醛含量都有明显增加，同时野生型及空载拟南芥丙二醛含量显著高于过表达株系。

(4)电导率的测定

植物相对电导率(Relative electrical conductivity)可以直接反映植物膜系统状况。当植物受到非生物胁迫或其他损伤时，细胞膜容易发生破裂，导致胞质胞液外渗，进而增大植物的相对电导率。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理48h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分用于电导率测定。

以水处理为对照，选大小均匀一致的叶片，洗净，称取0.1g叶片并剪碎放入含有25mL蒸馏水的锥形瓶中，封口膜封住于室温下静置12h，用电导率仪测定浸提液电导率R1，之后沸水浴20min，冷却至室温，再次测浸提液电导率R2，电导率值＝R1/R2×100％，试验进行三个生物学重复。

结果见图6D，正常条件下，4个株系植物体内的相对电导率没有显著差异，而在处理下4个株系的的相对电导率明显高于未处理的相对电导率，同时过表达株系的相对电导率显著低于野生型及空载拟南芥。

3、细胞活性氧含量

(1)DAB染色

DAB染料能够用来观察植物中过氧化氢(H₂O₂)的含量，其可以与H₂O₂释放出的氧离子氧化成棕色物质，颜色越深则代表H₂O₂越多。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理2h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分进行DAB染色。

结果见图7A，在正常培养条件下，4个拟南芥株系的染色程度相当，并且颜色较浅。处理后，拟南芥的颜色相对于正常条件下培养颜色加深，其中每个处理的野生型及空载拟南芥的染色程度比2个过表达株系的颜色更深，这表明在转基因株系的H₂O₂含量更低，抗逆性更强。

(2)NBT染色

NBT染料能够用来观察植物中超氧阴离子的含量，NBT染料能够将超氧阴离子氧化成蓝色沉淀，颜色越深说明超氧阴离子含量越多。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理2h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分进行NBT染色。

结果见图7B，在正常培养条件下，4个拟南芥株系的染色程度相当，并且颜色较浅。处理后，拟南芥的颜色相对于正常条件下培养颜色加深，其中每个处理的野生型及空载拟南芥的染色程度比2个过表达株系的颜色更深，这表明在处理之后野生型及空载拟南芥超氧阴离子要比2个过表达株系的拟南芥更多。

(3)D₂CFDA根尖染色

H₂DCF-DA可检测细胞内的ROS含量。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。用含有10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mM Mannitol的1/2MS培养基处理24h。取根尖进行D₂CFDA染色。

结果如图7C，正常培养条件下，过表达株系、野生型株系及空载株系的幼苗根尖颜色相对于处理后的株系颜色较浅且无显著差异。处理后，4种不同植株幼苗根尖的染色程度都较正常条件下相比颜色都较深，并且与2个过表达株系相比，野生型及空载拟南芥颜色相对更深。

(4)过氧化氢(H₂O₂)含量测定

过氧化氢(H₂O₂)是重要的活性氧之一，它的存在会对生物大分子产生伤害、产生细胞毒害的能力，而且还能作为信号分子，在生物和非生物胁迫应激、细胞程序性死亡以及生长发育调控过程中起重要作用。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理48h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分用于过氧化氢含量测定，试验采用试剂盒法(苏州格锐思G0112F)。试验进行三个生物学重复。

结果见图8A，正常培养条件下4个株系的过氧化氢含量无显著差异。在处理下，4个株系过氧化氢含量高于对照组，且2个过表达株系要显著低于野生型及空载株系，证明在非生物胁迫后植物体内产生了更多的过氧化氢，而转基因植株会降低过氧化氢的产生。

(5)过氧化氢酶(CAT)含量测定

过氧化氢酶(CAT)在植物遭受各种逆境时会产生保护机制，通过清除作用来保持ROS一定的浓度。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理48h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分用于过氧化氢酶含量测定，试验采用试剂盒法(苏州格锐思G0105F)。试验进行三个生物学重复。

结果见图8B，正常培养条件下4个株系的过氧化氢酶含量无显著差异，在处理下4个株系过氧化氢酶含量高于对照组，而转基因株系过氧化氢酶含量更高。

(6)超氧化物歧化酶(SOD)的测定

超氧化物歧化酶在动植物、微生物和培养细胞体内广泛存在，是生物体内重要的抗氧化酶，SOD具有抗衰老、提高机体对多种疾病的抵抗力，能增强机体对外界环境的适应力。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理48h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分用于超氧化物歧化酶含量测定，试验采用试剂盒法(苏州格锐思G0101F)。试验进行三个生物学重复。

结果见图8C，四种处理之后的超氧化物歧化酶含量高于对照组，且2个过表达株系的两种酶含量都显著高于野生型及空载株系，说明转基因植株的ROS清除能力增强。

(7)过氧化物酶(POD)的测定

过氧化物酶(POD)会将植物体内的H₂O₂水解，对植物具有一定的保护作用。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理48h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分用于过氧化物酶含量测定，试验采用试剂盒法(苏州格锐思G0107F)。试验进行三个生物学重复。

结果见图8D，处理之后过氧化物酶含量高于对照组，且2个过表达株系的两种酶含量显著高于野生型及空载株系，而对照组的4个株系的酶活并无显著差异，以上结果说明转基因植株可以提高对ROS的清除能力，该基因可以提高植物的抗逆性。

4、脯氨酸(Pro)含量的测定

植物体内游离脯氨酸(Proline,Pro)含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，当植株抗逆性强时，往往会积累较多的脯氨酸。

将供试种子进行消毒，将消毒后的种子播种于1/2MS培养基平板，培养7天。将幼苗移栽到装有土的花盆中，每盆5株，培养4周。用10mM NaHCO₃、120mM NaCl、50μM ABA和300mMMannitol处理48h，以正常培养条件下的不同株系拟南芥土壤苗为对照，取地上部分用于脯氨酸含量测定，试验采用试剂盒法(苏州格锐思G0111F)。试验进行三个生物学重复。

结果见图9，在正常条件下，4个株系的脯氨酸含量无显著差异且低于处理后的脯氨酸含量，处理后，2个过表达株系的脯氨酸含量显著高于野生型株系及空载株系，这说明过表达株系对非生物胁迫有着更强的抗性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 一种植物抗逆相关蛋白PvNAC52及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 340

<212> PRT

<213> Phaseolus vulgaris

<400> 1

Met Gly Val Pro Glu Lys Asp Pro Leu Ala Gln Leu Ser Leu Pro Pro

1 5 10 15

Gly Phe Arg Phe Tyr Pro Thr Asp Glu Glu Leu Leu Val Gln Tyr Leu

20 25 30

Cys Arg Lys Val Ala Gly His His Phe Ser Leu Pro Ile Ile Ala Glu

35 40 45

Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Val Leu Pro Ser Lys Ala Ile

50 55 60

Phe Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Val Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys

85 90 95

Ala Thr Gly Thr Asp Lys Ile Ile Thr Thr Glu Gly Arg Lys Val Gly

100 105 110

Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Val Gly Lys Ala Pro Lys Gly Thr

115 120 125

Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Leu Asp Ser Ser Arg

130 135 140

Lys Thr Thr Gly Thr Lys Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr

145 150 155 160

Lys Lys Asn Ser Ser Ala Gln Lys Ala Val Gln Asn Gly Val Val Ser

165 170 175

Ser Arg Glu His Thr Gln Tyr Ser Asn Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser

180 185 190

Ser His Leu Asp Asp Val Leu Glu Ser Leu Pro Thr Ile Asp Glu Arg

195 200 205

Cys Phe Met Met Pro Arg Ala His Thr Val Gln Gln Gln His Glu Glu

210 215 220

Lys Val Asn Ile Glu Asn Leu Gly Ala Gly Gly Leu Val Asp Trp Ala

225 230 235 240

Asn Pro Ala Val Leu Asn Pro Val Gly Asp Phe Val Ser Gly Asn Asn

245 250 255

Gln Val Val Gln Glu His Thr Gln Gly Met Val Asn Tyr Ser Gly Cys

260 265 270

Asn Asp Leu Tyr Val Pro Thr Phe Cys His Val Glu Ser Ala Leu Pro

275 280 285

Gln Lys Met Glu Glu Glu Val Gln Ser Gly Val Arg Asn Gln Asn Ser

290 295 300

Asn Asn Ser Trp Phe Leu Gln Asn Asp Phe Thr Gln Gly Phe Gln Asn

305 310 315 320

Ser Val Asp Thr Cys Gly Phe Lys Phe Pro Val Gln Pro Val Gly Phe

325 330 335

Gly Phe Arg His

340

<210> 2

<211> 1023

<212> DNA

<213> Phaseolus vulgaris

<400> 2

atgggagttc cagagaaaga ccctcttgcc cagctgagtc tacctcctgg ttttcgattc 60

taccccaccg acgaggagct tctcgttcag tatctctgcc gcaaggtcgc cggccaccat 120

ttctctctcc caatcattgc tgaaattgat ttgtacaagt tcgacccatg ggttcttcca 180

agcaaggcga ttttcgggga gaaagagtgg tactttttca gccctcgaga caggaagtac 240

ccaaacgggt ctcgacccaa cagagtagcc gggtcgggtt attggaaagc caccggaacc 300

gacaagatca tcaccaccga aggtagaaaa gtgggcataa aaaaagccct ggttttttac 360

gttggcaaag ctccgaaagg caccaaaacc aattggatca tgcacgagta tcggcttctt 420

gattcttccc gaaagaccac tggtaccaag ctggatgatt gggttctgtg tcgtatatac 480

aagaagaact cgagtgcaca gaaggcggtg caaaacggcg tcgtttcgag cagggaacac 540

acccaataca gcaacggttc ctcgtcgtcg tcatcgtccc atctggacga cgttctggaa 600

tcgctgccaa cgatcgacga acggtgtttc atgatgccac gtgctcacac ggtgcagcaa 660

cagcatgagg agaaggtgaa cattgagaac ctgggtgcgg gtgggttggt ggattgggcg 720

aaccctgcgg ttctgaatcc ggtgggtgat ttcgtttcgg ggaataatca agtggtgcag 780

gagcatactc aggggatggt gaactacagc gggtgcaatg acctttatgt tccaaccttc 840

tgccacgtgg agtctgcgct tccgcaaaag atggaggaag aggtgcaaag cggcgtgaga 900

aaccaaaaca gtaataactc gtggtttctt cagaacgatt ttacgcaggg gtttcagaac 960

tcggtggaca cgtgtgggtt taagttcccg gttcagccgg tgggattcgg gttcaggcat 1020

tga 1023

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atttcatttg gagagaacac gggggactct agaggatccc cgggatggga gttccagaga 60

r 61

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttgctcacca taagggactg accacccggg gaatgcctga acccgaatcc caccggctg 59

Claims

1.蛋白质PvNAC52，或，编码蛋白质PvNAC52的核酸分子，或，含有编码蛋白质PvNAC52核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌，在提高植物抗逆性或培育抗逆性改变的转基因植物中的应用；

所述蛋白质PvNAC52为如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

(b)在SEQ ID NO:1所示蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述抗逆性为抗盐性和抗渗透性中的一种或两种，所述植物为芸豆或拟南芥。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID NO:2所示的DNA分子。

3.一种制备转基因植物的方法，其特征在于：包括如下步骤：在出发植物中导入权利要求1或2中编码蛋白质PvNAC52的核酸分子，得到与所述出发植物相比抗盐性和/或抗渗透性提高的转基因植物；所述植物为芸豆或拟南芥。

4.一种植物育种方法，其特征在于：包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质PvNAC52的表达量和/或活性，从而增强植株的抗盐性和/或抗渗透性，所述植物为芸豆或拟南芥。