CN109355270A

CN109355270A - 一种水稻激酶osk1及其应用

Info

Publication number: CN109355270A
Application number: CN201811365598.9A
Authority: CN
Inventors: 王娟; 陈新兵; 秦华; 于延文; 权瑞党; 黄荣峰
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: CN109355270B

Abstract

本发明公开了一种水稻激酶OSK1及其在提高植物耐盐方面的应用。所述激酶OSK1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了水稻激酶OSK1突变体在抗虫中的应用，本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种水稻激酶OSK1及其应用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种水稻激酶OSK1及其在提高植物耐盐方面的应用。

背景技术

土地盐渍化是造成我国西部及沿海中低产田和大面积土壤资源难以有效利用的直接原因，通过生物技术培育耐逆水稻品种是充分利用我国盐碱地、缓解水资源短缺、保证水稻高产、稳产最经济、快速、有效的途径。农作物分子育种的前提和创新源泉是有用基因资源的挖掘和鉴定，因此，挖掘水稻的生理及基因潜力、充分利用水稻的耐盐基因资源培育耐逆、优质的水稻品种，已成为我国粮食生产可持续发展急需解决的重大课题，对保障农业可持续发展具有重要的现实意义

随着水稻(Oryza sativa L.)基因组测序的完成以及基因功能与分子作用机理研究的不断深入，利用分子设计育种是提高水稻抗逆性的重要手段。研究水稻感受和应答盐胁迫的重要信号分子及其调控网络，进而挖掘优良基因资源与培育优良的水稻材料，是确保我国粮食高产与稳产和农业可持续发展的迫切需求。因此，挖掘水稻的抗逆性潜力、充分利用耐逆基因资源培育耐逆的水稻品种，已成为我国粮食生产可持续发展的重要举措。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻激酶OSK1在提高植物耐盐方面的应用。

一种水稻激酶OSK1，所述激酶OSK1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

为了使上述蛋白质便于纯化，可在上述多肽的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的一个或几个标签，如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述多肽可以是人工合成的，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述多肽也可通过将SEQ ID NO.2所示序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明提供的水稻激酶OSK1含有典型的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，为第11到266氨基酸残基；UBA结构域，为第288到328氨基酸残基；AMPK结构域，为第385到502氨基酸残基。

所述水稻激酶OSK1的基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

扩增上述的水稻激酶OSK1中任一片段的引物。

一种水稻激酶OSK1突变体，所述激酶OSK1突变体为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且与水稻耐盐性相关的由SEQ ID NO:1序列衍生的多肽。

所述重组植物表达载体将所述基因(SEQ ID NO.2所示序列)通过SpeI和BamHI酶切位点连接到pCAMBIA1307(3×HA)载体，得到pCAMBIA1307(3×HA)-OSK1载体。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物，如水稻等农作物。在本发明的一个实施例中，所述植物为单子叶植物水稻，具体为水稻品种中花11。

上述水稻激酶OSK1或激酶OSK1突变体在提高植物耐盐方面的应用。

一种水稻激酶OSK1突变体，所述激酶OSK1突变体的突变位点为第43和第44位氨基酸残基KI突变为QQ。发明人意外发现上述激酶OSK1突变体具有抗虫的活性。

本发明还同时提供了提高水稻耐盐性的方法：包括用上述DNA分子或上述多肽转化水稻细胞或者沉默目的水稻中所含有的上述DNA分子或上述多肽，再将转化后的水稻细胞培育成植株，得到耐盐性改变的转基因水稻，其中耐盐性可以是提高或降低的。

本发明的有益效果：本发明首次鉴定到降低激酶OSK1基因表达能明显地提高水稻幼苗对盐胁迫的耐性，使植物在遇到盐等非生物胁迫时能正常生长；过表达转基因株系相对于野生型，经过一段时间胁迫处理后，生长缓慢。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1所示为OSK1相关T-DNA插入突变体植株PCR鉴定。

图2所示为OSK1相关T-DNA插入突变体插入位点示意图。

图3所示为OSK1相关T-DNA插入突变体和过表达转基因植株OSK1转录本水平检测。

图4所示为OSK1基因受盐胁迫诱导表达增加。

图5所示为OSK1相关T-DNA插入突变体和过表达转基因植株盐胁迫处理表型。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：OSK1相关T-DNA插入突变体鉴定

从华中农业大学水稻突变体库订购到编号为RMD_ITR-04Z11FV75_URB4的T-DNA激活标签插入突变体，其背景为中花11(ZH11)，突变体标注的T-DNA插入位点是位于5号染色体的LOC_Os05g45420，其编码蛋白激酶OSK1，并突变体命名为FV75。

首先CTAB法提取野生型ZH11和突变体FV75各个单株的基因组DNA，通过三引物法来鉴定突变体有无纯合体，以特异引物对P1/P2和中间引物URB4同时进行PCR反应。然后琼脂糖凝胶电泳检测，野生型应该只有一条1000bp大小左右的条带，纯合体应该只有一条700bp大小左右的条带，杂合体应该两条带都有。结果显示突变体均为纯合体单株，电泳检测结果如图1所示。同时对突变体纯合体扩增出来的PCR产物经切胶回收后进行测序来鉴定T-DNA插入位点，结果显示突变体的T-DNA插入在OSK1的第一个内含子中，如图2所示。

特异引物对甲：

P1：5’-CGTCGAGATCCATTGATGTG-3’

P2：5’-CATGGCTGGTCAACTGTGAC-3’

URB4：

5’-TTGCGAAGTTTAAACTATCAGTGT-3’

实施例2：OSK1过表达转基因植物的获得

一、OSK1超表达载体pCAMBIA1307(3×HA)-OSK1的构建

从OSK1基因(Gene ID:4339410)的编码起始位点ATG开始设计5’端引物，于终止密码子前设计3’端引物：

引物1：5’-ACTAGTATGGAGGGAGCTGGCAGAGA-3’；

引物2：5’-GGATCCAAGGACTCTCAGCTGAGTTA-3’；

引物1中的ACTAGT序列为限制性内切酶SpeI的酶切位点，下划线标识的序列为OSK1基因的编码序列；引物2中GGATCC序列为限制性内切酶BamHI的酶切位点，下划线标识的序列为OSK1基因的编码序列。

以粳稻品种中花11的cDNA为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，用限制性内切酶SpeI和BamHI进行双酶切，回收酶切产物；用限制性内切酶SpeI和BamHI双酶切pCAMBIA1307(3×HA)，回收骨架载体；将所述酶切产物和所述骨架载体进行连接，然后进行测序，测序结果表明，得到了pCAMBIA1307(3×HA)-OSK1载体。

二、OSK1转基因植物的获得

利用电击法将重组表达载体pCAMBIA1307(3×HA)-OSK1导入农杆菌AGL0，得到重组农杆菌。

将含有pCAMBIA1307(3×HA)-OSK1的农杆菌AGL0分别浸染日本晴水稻愈伤组织；将浸染的愈伤在无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基上24℃暗培养2-4天；清洗的愈伤组织转到含潮霉素的选择培养基上进行抗性筛选；经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基7-10天后再转到分化培养基因进行光照培养；待小苗长至2-4cm时转到装有生根培养基的试管中生长2-3周，生长良好的小苗经2-3天的炼苗后便可移栽至温室中(T0代)。分别将小苗传代，得到T1代。

实施例3：检测OSK1相关T-DNA插入突变体纯合体和过表达转基因植株中OSK1基因的转录本水平

为了检测FV75突变体和OSK1过表达转基因植株中OSK1基因的转录本水平，首先用TRIzol法提取野生型ZH11和FV75突变体、OSK1过表达转基因植株不同株系的总RNA，取2μg总RNA用M-MLV反转录酶进行反转录，合成cDNA第一链，然后以cDNA为模板，通过荧光定量PCR分析OSK1基因的表达。将OSK1基因(引物5’-AGTGGCTACCTTGGAGCTGA-3’和5’-GTGGATGTGCTCGAGACTGA-3’)的荧光信号(以Ct值表示)与Actin基因(内参基因，引物5’-TCCAAGCAGCATGAAGATCA-3’和5’-CACATAAGAGAGTGACGTACA-3’)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量＝2-△Ct，其中△Ct＝Ct目的基因-Ct内参基因)计算出的值作为OSK1基因的相对表达量，结果见图3。结果表明，将野生型水稻中OSK1基因的表达量作为1，OSK1基因在FV75突变体纯合体中表达降低到50％左右，而OSK1基因在转基因植株不同株系中的表达较野生型均有不同程度的升高。

实施例4：OSK1相关T-DNA插入突变体纯合体和过表达转基因植株的耐盐性分析

检测基因表达特性时发现盐胁迫可以诱导OSK1的基因表达，用150mM NaCl处理野生型中花11，分别在不同时间点0h,1h,2h,4h,8h,24h进行取样，取样后提取RNA、反转录成cDNA，用引物5’-AGTGGCTACCTTGGAGCTGA-3’和5’-GTGGATGTGCTCGAGACTGA-3’进行检测OSK1的基因表达，如图4所示，可以观察到随着处理时间的增加OSK1基因表达也逐渐增加。

用野生型中花11和FV75突变体进行NaCl模拟盐胁迫处理。用水浸种培养使其萌发，萌发3天后将幼苗移至土壤进行土培。

收获OSK1的T1代转基因水稻种子，选取三个超表达株系(OE5、OE6、OE7)进行NaCl模拟盐胁迫处理。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，萌发3天后将幼苗移至96孔板进行水培，以同期生长的野生型中花11作为对照。

对生长至2周的幼苗进行盐处理(150mM NaCl)，试验重复3次，处理7天后，观察叶片待其出现萎蔫后，经多次置换将盐水换掉，观察叶片。盐处理后FV75突变体比野生型表现更强的耐盐性，而过表达株系比野生型表现出生长缓慢、耐盐性降低，说明降低OSK1基因表达可以提高水稻对盐胁迫的耐受性，结果如图5所示。

实施例5OSK1突变体的抗虫性能

PCR克隆OSK1基因,并构建植物表达载体p2300-35S-OSK1,利用p2300-35S-OSK1植物表达载体为模板，通过重叠延伸PCR的方法获得突变体，突变位点为第43和第44位氨基酸残基KI突变为QQ。重新构建植物表达载体p2300-35S-OSK1’，并通过农杆菌介导法转化水稻日本晴，获得了35S启动子驱动的OSK1’基因的转基因水稻植株。

种植转OSK1’基因的水稻和水稻中花11，生长到40天，取生长大小一致，叶片数目一致的水稻植株，转OSK1’基因的水稻植株30株，水稻中花11 30株，每株水稻上接100头成熟无翅的蚜虫，30小时后，统计蚜虫抑制率：蚜虫抑制率％＝(100-叶片上剩余蚜虫)/100。

实验结果：转OSK1’基因的水稻的蚜虫抑制率为78％，水稻中花11的蚜虫抑制率为1％。

种植转OSK1’基因的水稻和水稻中花11，生长到40天，取生长大小一致，叶片数目一致的水稻植株，转OSK1’基因的水稻植株30株，水稻中花11 30株，每株水稻上接100头褐飞虱，30小时后，统计褐飞虱抑制率：褐飞虱抑制率％＝(100-叶片上剩余褐飞虱)/100。

实验结果：转OSK1’基因的水稻的褐飞虱抑制率为69％，水稻中花11的褐飞虱抑制率为0％。

种植转OSK1’基因的水稻和水稻中花11，生长到40天，取生长大小一致，叶片数目一致的水稻植株，转OSK1’基因的水稻植株30株，水稻中花11 30株，每株水稻上接100头稻纵卷叶螟，30小时后，统计稻纵卷叶螟抑制率：稻纵卷叶螟抑制率％＝(100-叶片上剩余稻纵卷叶螟)/100。

实验结果：转OSK1’基因的水稻的稻纵卷叶螟抑制率为3％，水稻中花11的稻纵卷叶螟抑制率为3％。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种水稻激酶OSK1及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 505

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr Ala Ile

1 5 10 15

Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Ser Pro Gly Leu Val Leu Ile Ala Gly

20 25 30

His Ile Leu Thr Gly His Leu Val Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ala Ala

35 40 45

Leu Ile Leu Ser Met Gly Met Gly Gly Leu Val Leu Ala Gly Ile Leu

50 55 60

Ile Leu Ala Leu Pro Met His Pro His Ile Ile Ala Leu Thr Gly Val

65 70 75 80

Ile Ala Thr Pro Ala Ala Ile Thr Val Val Met Gly Thr Val Leu Ser

85 90 95

Gly Gly Leu Pro Ala Thr Ile Val Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ala Ala Ala Pro Pro Gly Gly Ile Ile Ser Gly Val Gly Thr Cys

115 120 125

His Ala Ala Met Val Val His Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Leu Leu

130 135 140

Leu Ala Ser Leu Cys Ala Val Leu Ile Ala Ala Pro Gly Leu Ser Ala

145 150 155 160

Val Met Ala Ala Gly His Pro Leu Leu Thr Ser Cys Gly Ser Pro Ala

165 170 175

Thr Ala Ala Pro Gly Val Ile Ser Gly Leu Leu Thr Ala Gly Pro Gly

180 185 190

Val Ala Val Thr Ser Cys Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Leu Cys Gly

195 200 205

Thr Leu Pro Pro Ala Ala Gly Ala Ile Pro Ala Leu Pro Leu Leu Ile

210 215 220

Leu Gly Gly Ile Thr Thr Leu Pro Ser His Leu Ser Pro Leu Ala Ala

225 230 235 240

Ala Leu Ile Pro Ala Met Leu Val Val Ala Pro Met Leu Ala Ile Thr

245 250 255

Ile Ala Gly Ile Ala Gly His Gly Thr Pro Thr Val Gly Leu Pro Ala

260 265 270

Thr Leu Ala Val Pro Pro Pro Ala Thr Ala Gly Gly Val Leu Leu Leu

275 280 285

Ala Ala Gly Thr Leu Ala Ala Val Ile Ala Met Gly Pro Ala Leu Ala

290 295 300

Gly Leu Ile Gly Ser Leu His Leu Ala Leu Gly Ala Gly Ala Thr Val

305 310 315 320

Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Thr Ser Gly Thr

325 330 335

Leu Gly Ala Gly Pro His Gly Ser Met Gly Ser Ser Leu Ala Gly Val

340 345 350

Thr Pro Ala Gly Thr Pro Ala Ser Ala Thr Ala His Ala Gly His Gly

355 360 365

His Met Gly Ser Pro Gly Pro Gly Leu Ala His His Pro Ala Ala Ala

370 375 380

Ala Leu Thr Ala Leu Gly Leu Gly Ser Ala Ala His Pro Ala Gly Ile

385 390 395 400

Ile Thr Gly Val Leu Leu Ala Leu Gly Gly Leu Ala Val Cys Thr Leu

405 410 415

Leu Ile Gly His Thr Ala Met Leu Cys Ala Thr Ser Pro Ser Pro Pro

420 425 430

Ser His Gly Ser Met Met His Ala Ala His Gly Pro Gly Ala Gly Ser

435 440 445

Ala Ile Ile Gly Thr Ala Ala Ser Gly Leu Ser Thr His Thr Val Leu

450 455 460

Pro Gly Ile Gly Leu Thr Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Leu Leu Ala

465 470 475 480

Leu Gly Ala Val Ser Gly Pro Gly Leu Leu Pro Leu Ala Leu Cys Ser

485 490 495

Ala Pro Leu Thr Gly Leu Ala Val Leu

500 505

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atggagggag ctggcagaga tgggaaccct cttggcggtt accggattgg caaaacccta 60

gggattgggt catttggcaa agtgaagatc gcggagcata tattgactgg tcacaaggtg 120

gcaatcaaga tcctcaatcg ccgtaagatc aagagcatgg agatggaaga gaaagttaaa 180

agagaaatca agatacttag attatttatg cacccacata tcattcgcct ttatgaggtg 240

atagacaccc cagctgatat ttatgttgtt atggagtatg tcaaatctgg agagttgttt 300

gattacatcg ttgagaaggg aagactgcaa gaggaagaag ctcgacgctt tttccagcag 360

atcatatctg gtgttgaata ttgccataga aacatggtgg ttcatcgtga tcttaagcca 420

gagaaccttc ttttggactc caaatgcaat gttaagattg cagactttgg cttgagtaat 480

gttatgcgtg atggtcactt tctgaagaca agttgtggta gcccaaatta tgcagcacct 540

gaggtgatat ctggtaaact atatgctggc cctgaagttg atgtgtggag ttgtggtgtt 600

attctttatg ctcttctttg tggtaccctt ccatttgatg acgagaatat tcccaacctt 660

tttaagaaaa taaagggtgg catatatacc cttcccagtc atttgtcacc tttggcaagg 720

gatttgattc ccagaatgct tgttgttgat cccatgaaga ggatcaccat acgtgaaatc 780

cgtgaacatc agtggttcac agttggtctt ccgcgttatt tagctgtgcc acctcctgac 840

actgcacaac aggttaaaaa gctcgacgat gaaactctga atgatgttat caatatgggg 900

tttgacaaga atcagctaat cgaatcactt cacaagagac tgcaaaacga ggcgacagtt 960

gcctactatt tactattgga caataggctg cgcacaacca gtggctacct tggagctgag 1020

ttccatgaat ctatggaatc ttctctcgct caagtaactc cagctgagac accaaactca 1080

gccactgatc atcggcagca tgggcatatg gaatctcctg ggtttggctt gaggcatcat 1140

ttcgcagctg acaggaaatg ggcccttggt cttcagtctc gagcacatcc acgagaaata 1200

ataactgaag ttcttaaagc tctgcaagag ctaaatgttt gctggaagaa gattggacat 1260

tataacatga aatgcagatg gagtcctagt tttcccagtc atgagagtat gatgcataac 1320

aaccatggct ttggtgcaga atctgctata attgaaactg atgacagtga gaaatcaacc 1380

cacactgtga aatttgaaat tcagctttac aaaacaaggg atgaaaaata ccttcttgac 1440

ttgcaaaggg tcagtggacc acagcttctc tttctggacc tgtgctctgc ctttctaact 1500

cagctgagag tcctttaa 1518

Claims

1.一种水稻激酶OSK1，其特征在于，所述激酶OSK1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述水稻激酶OSK1，其特征在于，所述激酶OSK1的基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.一种含权利要求1所述激酶OSK1的基因载体。

4.含有权利要求3所述激酶OSK1的基因载体的重组菌或细胞系。

5.扩增权利要求1所述的水稻激酶OSK1中任一片段的引物。

6.一种水稻激酶OSK1突变体，其特征在于，所述激酶OSK1突变体的突变位点为第43和第44位氨基酸残基KI突变为QQ。

7.权利要求1所述激酶OSK1或权利要求6所述激酶OSK1突变体在提高植物耐盐方面的应用。

8.权利要求6所述激酶OSK1突变体在抗虫中的应用。