CN112794889B - 抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用 - Google Patents

抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白IbMYB48，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。实验证明，在拟南芥中过表达IbMYB48基因可以提高拟南芥抗逆性，抗逆性提高表现为：存活率增加、根长增加、鲜重增加、ABA含量增加、JA含量增加、SOD酶活性增加、脯氨酸含量增加、MDA含量降低和H2O2含量降低。因此，蛋白IbMYB48及其编码基因可以调控植物抗逆性，具有重要的应用价值。

Description

抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用。
背景技术
当今世界耕地面积有限，且盐碱、干旱等边际土地面积巨大。世界人口的增加和可耕土地面积的减少，严重的威胁到粮食的安全。此外，随着世界人口急剧膨胀与全球气候变暖的影响，水资源的短缺也已成为农业面临的主要挑战之一。耕地的盐渍化和水资源的严重缺乏影响了农业的可持续发展，研究植物抗盐抗旱机理对农业生产和生态建设具有重要的意义。通过对植物抗盐抗旱机理的深入研究，培育抗盐抗旱作物新品种是利用盐碱滩涂地资源最经济、有效的措施之一。
植物的抗盐抗旱机理相当复杂，它涉及到生长发育、形态结构、生理特征以及代谢调节等诸多方面。植物在盐旱胁迫条件下，会采用一定的策略去阻止或减轻危害，在长期的进化过程中，植物发展出了一系列的抗盐抗旱机制。随着分子生物学的迅速发展，植物抗盐抗旱生理生化机制日益明确，使得克隆与植物抗盐抗旱相关基因成为可能。
发明内容
本发明的目的是提高植物的抗逆性。
本发明首先保护来源于甘薯的蛋白质IbMYB48，可为如下1)或2)或3)或4)：
1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；
2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于甘薯且与抗逆性相关的蛋白质；
4)与SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于甘薯且与抗逆性相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:2由266个氨基酸残基组成。
为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码所述蛋白质IbMYB48的核酸分子。
所述编码蛋白质IbMYB48的核酸分子可为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：
(a1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbMYB48的DNA分子；
(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbMYB48的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:1由801个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质IbMYB48的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质IbMYB48的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质IbMYB48，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质IbMYB48的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述重组载体具体可为重组质粒pCB-IbMYB48。重组质粒pCB-IbMYB48可为将载体pCAMBIA super1300-GFP的限制性内切酶KpnI和SalI识别序列间的小片段替换为SEQ IDNO.1所示的DNA分子，得到的重组质粒。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌GV3101。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为GV3101/pCB-IbMYB48。所述GV3101/pCB-IbMYB48可为将重组质粒pCB-IbMYB48导入根癌农杆菌GV3101，得到的重组农杆菌。
本发明还保护上述任一所述蛋白质IbMYB48、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗逆性中的应用。
本发明还保护上述任一所述蛋白质IbMYB48、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用。
上述任一所述的应用中，所述调控植物抗逆性可为提高植物抗逆性。
上述任一所述的应用中，所述培育抗逆性改变的转基因植物可为培育抗逆性提高的转基因植物。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbMYB48的表达量和/或活性，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性提高。
上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbMYB48表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbMYB48的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述蛋白质IbMYB48表达量和/或活性”具体可通过向受体植物中导入编码所述蛋白质IbMYB48的核酸分子实现。
上述方法中，所述编码蛋白质IbMYB48的核酸分子可为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：
(a1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbMYB48的DNA分子；
(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，来源于甘薯且编码所述蛋白质IbMYB48的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:1由801个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
所述向受体植物中导入编码所述蛋白质IbMYB48的核酸分子具体可通过向受体植物导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒pCB-IbMYB48。重组质粒pCB-IbMYB48可为将载体pCAMBIA super1300-GFP的限制性内切酶KpnI和SalI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，得到的重组质粒。
本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中上述任一所述蛋白质IbMYB48的表达量和/或活性，从而提高植物的抗逆性。
上述任一所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)薯蓣科植物；c4)甘薯；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)野生型拟南芥Col-0。
上述抗逆性提高可表现为存活率增加、根长增加、鲜重增加、ABA含量增加、JA含量增加、SOD酶活性增加、脯氨酸含量增加、MDA含量降低和H2O2含量降低中的至少一种。
上述任一所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。
实验证明，在拟南芥中过表达IbMYB48基因可以提高拟南芥抗逆性，抗逆性提高表现为：存活率增加、根长增加、鲜重增加、ABA含量增加、JA含量增加、SOD酶活性增加、脯氨酸含量增加、MDA含量降低和H2O2含量降低。因此，蛋白IbMYB48及其编码基因可以调控植物抗逆性，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为8个T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥的分子鉴定结果。
图2为实时定量PCR检测8个T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥IbMYB48基因的表达量。
图3为实施例2中步骤三1的抗逆性鉴定结果。
图4为实施例2中步骤三2的抗逆性鉴定结果。
图5为实施例2中步骤三3的生理生化指标的测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
野生型拟南芥Col-0记载在如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A genetic link between cold responses andflowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.。野生型拟南芥Col-0在下文中简称野生型拟南芥或WT。
甘薯品系JS6-5记载于如下文献中：Zhao HY，Zhang SS，Wang FB，Zhao N，He SZ，Liu QC，Zhai H.Comparative transcriptome analysis of purple-fleshed sweetpotato provides insights into the molecular mechanism of anthocyaninbiosynthesis.Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2018，doi.org/10.15302/J-FASE-2018219。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。
植物总RNA提取试剂盒为Transzol Up植物总RNA提取试剂盒(全式金，目录号ET111)。pEASY-Blunt simple载体为北京全式金生物技术有限公司的产品。QuantScriptRT Kit Quant cDNA Kit为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为KR103。载体pCAMBIA super1300-GFP为武汉淼灵生物科技有限公司产品，产品目录号为L3080。
1/2霍格兰营养液记载于如下文献中：刘德高.过表达IbP5CR、IbERD3、IbELT、IbNFU1基因的甘薯植株的获得及耐盐性鉴定.北京.2014年.中国农业大学博士毕业论文。
下述实施例中光暗交替培养的参数为：光照时间为16h、黑暗时间8h。
下述实施例中，光照的强度为3100―3500Lux。
实施例1、IbMYB48基因的获得
IbMYB48基因的获得的步骤如下：
1、用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯品系JS6-5的幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用QuantScript RT Kit Quant cDNA Kit反转录出第一链cDNA。
2、以步骤1获得的cDNA为模板，采用引物O-F：5′-ATGAAGATGATGATGATGAGGAGA-3′和引物O-R：5′-ATTATATTGTGCATAATCTTGGTTGT-3′组成的引物对进行PCR扩增，获得801bp的PCR扩增产物并测序。
结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示的基因命名为IbMYB48基因，其编码的蛋白命名为IbMYB48蛋白或蛋白质IbMYB48，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2、IbMYB48蛋白在调控拟南芥抗逆性中的应用
一、重组质粒的构建
1、用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切载体pCAMBIA super1300-GFP，回收约10783bp的载体骨架。
2、人工合成SEQ ID NO.1所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以引物OE-F：5’-GGGGTACCATGAAGATGATGATGATGAGGAGA-3’(下划线为限制性内切酶KpnI的识别序列)和引物OE-R：5’-ACGCGTCGACATTATATTGTGCATAATCTTGGTTGT-3’(下划线为限制性内切酶SalI的识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，获得含有限制性内切酶识别序列的双链DNA分子。
3、将步骤2得到的含有限制性内切酶识别序列的双链DNA分子连接至pEASY-Bluntsimple载体，得到中间载体。
4、用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切中间载体，回收约800bp的DNA片段。
5、将DNA片段与载体骨架连接，得到重组质粒pCB-IbMYB48。
将重组质粒pCB-IbMYB48进行测序。根据测序结果，对重组质粒pCB-IbMYB48进行结构描述如下：将载体pCAMBIA super1300-GFP的限制性内切酶KpnI和SalI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，得到的重组质粒。重组质粒pCB-IbMYB48表达SEQ ID NO.2所示的IbMYB48蛋白。
二、转IbMYB48基因拟南芥的获得
1、将重组质粒pCB-IbMYB48转化根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pCB-IbMYB48。
2、采用拟南芥花序浸花转化法(Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.(1998)16，735-743.)，将GV3101/pCB-IbMYB48转至野生型拟南芥中，获得T1代拟转IbMYB48基因拟南芥的种子。
3、将T1代拟转IbMYB48基因拟南芥的种子种植于含12.5mg/LPPT的1/2MS固体培养基上，4℃纯化3天，之后22℃培养7-10天，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转IbMYB48基因阳性苗。T1代转IbMYB48基因阳性苗收到的种子即为T2代转IbMYB48基因拟南芥的种子。
4、将步骤3筛选出的不同株系的T2代转IbMYB48基因拟南芥的种子播种于含12.5mg/LPPT的1/2MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为IbMYB48基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转IbMYB48基因拟南芥的种子。
5、将步骤4筛选出的T3代转IbMYB48基因拟南芥的种子再次播种于含12.5mg/LPPT的1/2MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥。
将筛选到的16个T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥的株系依次命名为L1—L16。
6、分子鉴定
待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、L1的种子、L2的种子、L3的种子、L4的种子、L5的种子、L6的种子、L7的种子、L8的种子、L9的种子、L10的种子、L11的种子、L12的种子、L13的种子、L14的种子、L15的种子或L16的种子。
(1)取5粒待测拟南芥种子，播种于1/2MS固体培养基上，4℃纯化3天，之后22℃光暗交替培养8天，得到待测拟南芥幼苗。
(2)完成步骤(1)后，提取待测拟南芥幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物O-F和引物O-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以水作为模板，采用引物O-F和引物O-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，作为阴性对照；以重组质粒pCB-IbMYB48作为模板，采用引物O-F和引物O-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，作为阳性对照。
(3)完成步骤(2)后，将各个PCR扩增产物进行1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果以某T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥的基因组DNA为模板得到的PCR扩增产物中含有约801bp的DNA片段(与阳性对照的片段相同)，则该T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥为阳性植株；否则不为阳性植株。
部分检测结果见图1(M为DNA Marker，W为阴性对照，P为阳性对照，WT为野生型拟南芥)。结果表明，L6、L7、L8、L11、L12、L13、L15、L16和阳性对照的PCR扩增产物中均含有约801bp的DNA片段，阴性对照和野生型拟南芥的PCR扩增产物中均不含有约801bp的DNA片段。由此可见，L6、L7、L8、L11、L12、L13、L15和L16均为阳性植株。
7、实时定量PCR检测T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥IbMYB48基因的表达量
待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、L6的种子、L7的种子、L8的种子、L11的种子、L12的种子、L13的种子、L15的种子或L16的种子。
(1)取5粒待测拟南芥种子，播种于1/2MS固体培养基上，4℃纯化3天，之后22℃光暗交替培养8天，得到待测拟南芥幼苗。
(2)完成步骤(1)后，提取各待测拟南芥幼苗的总RNA，用逆转录酶反转得到cDNA；实时定量PCR检测cDNA中IbMYB48基因的相对表达量(以拟南芥actin基因为内参基因)。
检测IbMYB48基因的引物为MYB48-F：5′-ACCAGGACGAACCGACAAC-3′和MYB48-R：5′-AGGAAGAGGAATTATTGGAGAGTG-3′。
检测actin基因的引物为actin-F：5’-GCACCCTGTTCTTCTTACCGA-3’和actin-R：5’-AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG-3’。
检测结果见图2。结果表明，IbMYB48基因为拟南芥外源基因，在野生型拟南芥中几乎没有表达，但IbMYB48基因在8个T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥的株系(分别为L6、L7、L8、L11、L12、L13、L15和L16)中都有不同程度的表达。
选取IbMYB48基因的表达量最高的三个株系(即L6、L8和L12)进行后续试验。
三、转IbMYB48基因拟南芥的抗逆性鉴定
1、转IbMYB48基因拟南芥抗逆性的鉴定一
待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、L6的种子、L8的种子或L12的种子。
(1)取待测拟南芥种子，用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌水清洗三次。
(2)完成步骤(1)后，将拟南芥种子播种于1/2MS固体培养基，4℃纯化3天，之后22℃光暗交替培养至子叶完全展开，得到待测拟南芥幼苗。
(3)完成步骤(2)后，将长势基本一致的待测拟南芥幼苗转移至固体培养基(1/2MS固体培养基、含100mM NaCl的1/2MS固体培养基或含300mM甘露醇的1/2MS固体培养基)，22℃光暗交替培养(直立培养)2周，观察拟南芥的生长状态。
拟南芥的生长状态见图3中左图。
(4)完成步骤(3)后，统计拟南芥幼苗的根长和鲜重(实验重复三次取平均值，每次统计的拟南芥幼苗为4株)。
检测结果见图3中右图。
结果表明，在1/2MS固体培养基上，野生型拟南芥和T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥(即L6、L8和L12)的根长和鲜重均无显著差异；在含100mM NaCl的1/2MS固体培养基或含300mM甘露醇的1/2MS固体培养基上，与野生型拟南芥相比，T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥(即L6、L8和L12)的根长和鲜重均显著增加。
2、转IbMYB48基因拟南芥抗逆性的鉴定二
待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、L6的种子、L8的种子或L12的种子。
(1)取待测拟南芥种子，用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌水清洗三次。
(2)完成步骤(1)后，将拟南芥种子播种于1/2MS固体培养基，4℃纯化3天，22℃光暗交替培养7天，得到待测拟南芥幼苗；将生长状态基本一致的待测拟南芥幼苗随机移栽至装有营养土的花盆，正常培养10天，得到处理前待测拟南芥幼苗。
为尽可能的保证实验条件一致，每个花盆中的营养土重量均相同，每个花盆中移栽的待测拟南芥幼苗数目也相同。
(3)完成步骤(2)后，取处理前待测拟南芥幼苗，进行如下处理：
对照(1盆)：培养3周；每隔2天灌溉50mL 1/2霍格兰营养液；
盐胁迫(1盆)：培养3周；每隔2天灌溉50mL含350mM NaCl的1/2霍格兰营养液；
旱胁迫(1盆)：培养3周；培养期间不浇任何水分。
旱胁迫后复水处理2天。
(4)完成步骤(3)后，观察处理后待测拟南芥幼苗的生长状态。
处理后待测拟南芥幼苗的生长状态见图4。
结果表明，正常培养的条件下(即对照)，野生型拟南芥和T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥(即L6、L8和L12)均生长茂盛；盐胁迫条件下，野生型拟南芥的叶片大面积变黄萎蔫，T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥(即L6、L8和L12)只有部分叶片变黄；旱胁迫条件下，野生型拟南芥全部萎蔫死亡、复水后也无法恢复，T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥(即L6、L8和L12)虽然叶片变黄，仍复水后叶片能够吸水伸展回绿，植株生长状态良好。
3、生理生化指标的测定
(1)取步骤2中(3)对照处理2周的待测拟南芥幼苗的地上部分、盐胁迫处理2周的待测拟南芥幼苗地上部分或旱胁迫处理2周的待测拟南芥幼苗的地上部分，参照文献(YanLi，Huan Zhang，Qian Zhang，Qingchang Liu，Hong Zhai，NingZhao，Shaozhen He，An AP2/ERF gene，IbRAP2-12，from sweetpotato is involved in salt and drought tolerancein transgenic Arabidopsis.Plant Science，2019，281：19–30)记载的方法检测ABA含量和JA含量。
(2)取步骤2中(3)对照处理2周的待测拟南芥幼苗、盐胁迫处理2周的待测拟南芥幼苗或旱胁迫处理2周的待测拟南芥幼苗，采用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(苏州科铭生物，目录号SOD-1-Y)检测SOD酶活性，采用丙二醛(MDA)试剂盒(苏州科铭生物，目录号MDA-2-Y)检测MDA含量，采用脯氨酸(PRO)含量试剂盒(苏州科铭生物，目录号PRO-2-Y)检测脯氨酸含量，采用过氧化氢(H2O2)试剂盒(苏州科铭生物，目录号为H2O2-2-Y)检测H2O2含量。
上述实验重复三次取平均值，每次检测10株待测拟南芥幼苗。
检测结果见图5。结果表明，正常培养的条件下(即对照)，野生型拟南芥和T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥(即L6、L8和L12)的ABA含量、JA含量、SOD酶活性、MDA含量、脯氨酸含量和H2O2含量均无显著差异；盐胁迫或旱胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，T3代纯合转IbMYB48基因拟南芥(即L6、L8和L12)的ABA含量、JA含量、SOD酶活性和脯氨酸含量均显著增加，MDA含量和H2O2含量均显著降低。
上述结果表明，过表达IbMYB48基因可以显著提高拟南芥的抗逆性；抗逆性为抗盐性和抗旱性。抗逆性提高表现为：存活率增加、根长增加、鲜重增加、ABA含量增加、JA含量增加、SOD酶活性增加、脯氨酸含量增加、MDA含量降低和H2O2含量降低。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国农业大学
<120> 抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 801
<212> DNA
<213> 甘薯Ipomoea batatas
<400> 1
atgaagatga tgatgatgag gagaggtcca tggacagaac aagaagatgt tcagttggtt 60
ctttacgtga acatgttcgg cgatcggcgg tgggattttc tggccaaagt ttcagggttg 120
aaaagaagtg ggaagagttg caggttacgt tgggttaatt acttgcagcc tggcctcaaa 180
cgtggcaaga tcacccctca agaacaacga ctcattcttc aactccactc caaatggggc 240
aataggtggt caaaaattgc ccagaaatta ccaggacgaa ccgacaacga aatcaagaac 300
tactggagaa cccacatgag gaaaaaggct aacgaagaca gagccaacaa gttcggttct 360
tcctcatccc catcttcatc atcatcactc tccaataatt cctcttcctc ttccggcggc 420
tccagcagcc cgccggcggt ggactcccgg ccgattccgg acacaaacga gaggaacttc 480
tacgacacag gaggaataat atttgaggat gaaacgacgc cgcagcagca gcaggagcag 540
gagaagaaga taatggatga tcatcatcag cagcagcagc aagtgtgctc gtcatcaatg 600
gatgatatat ggaaagacat ggaattatgg gcggaacaag aaaaaggtgg ttatacgatg 660
tggaattatt ggtcggattg ggtatggacg acatgtagta gtagtaataa caacaggatg 720
tgtccgccgc cgccgccgcc gtcttcttcc accgatcgtc tctgcttctt tgacaaccaa 780
gattatgcac aatataattg a 801
<210> 2
<211> 266
<212> PRT
<213> 甘薯Ipomoea batatas
<400> 2
Met Lys Met Met Met Met Arg Arg Gly Pro Trp Thr Glu Gln Glu Asp
1 5 10 15
Val Gln Leu Val Leu Tyr Val Asn Met Phe Gly Asp Arg Arg Trp Asp
20 25 30
Phe Leu Ala Lys Val Ser Gly Leu Lys Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg
35 40 45
Leu Arg Trp Val Asn Tyr Leu Gln Pro Gly Leu Lys Arg Gly Lys Ile
50 55 60
Thr Pro Gln Glu Gln Arg Leu Ile Leu Gln Leu His Ser Lys Trp Gly
65 70 75 80
Asn Arg Trp Ser Lys Ile Ala Gln Lys Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn
85 90 95
Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Arg Thr His Met Arg Lys Lys Ala Asn Glu
100 105 110
Asp Arg Ala Asn Lys Phe Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser
115 120 125
Ser Leu Ser Asn Asn Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Pro
130 135 140
Pro Ala Val Asp Ser Arg Pro Ile Pro Asp Thr Asn Glu Arg Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Asp Thr Gly Gly Ile Ile Phe Glu Asp Glu Thr Thr Pro Gln Gln
165 170 175
Gln Gln Glu Gln Glu Lys Lys Ile Met Asp Asp His His Gln Gln Gln
180 185 190
Gln Gln Val Cys Ser Ser Ser Met Asp Asp Ile Trp Lys Asp Met Glu
195 200 205
Leu Trp Ala Glu Gln Glu Lys Gly Gly Tyr Thr Met Trp Asn Tyr Trp
210 215 220
Ser Asp Trp Val Trp Thr Thr Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asn Arg Met
225 230 235 240
Cys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Thr Asp Arg Leu Cys Phe
245 250 255
Phe Asp Asn Gln Asp Tyr Ala Gln Tyr Asn
260 265

Claims (8)

1.蛋白质IbMYB48在调控植物抗逆性中的应用；
所述蛋白质IbMYB48，为如下1)或2)：
1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；
2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；
所述植物为薯蓣科植物或十字花科植物。
2.编码权利要求1中所述蛋白质IbMYB48的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用；
所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；
所述植物为薯蓣科植物或十字花科植物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为(a1)或(a2)：
(a1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。
4.权利要求1中所述蛋白质IbMYB48在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用；
所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；
所述植物为薯蓣科植物或十字花科植物。
5.编码权利要求1中所述蛋白质IbMYB48的核酸分子在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用；
所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；
所述植物为薯蓣科植物或十字花科植物。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为(a1)或(a2)：
(a1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。
7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入编码权利要求1中所述蛋白质IbMYB48的核酸分子，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性提高；
所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；
所述植物为薯蓣科植物或十字花科植物。
8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质IbMYB48的表达量和/或活性，从而提高植物的抗逆性；
所述增加植物中权利要求1中所述蛋白质IbMYB48的表达量和/或活性通过向植物中导入编码权利要求1中所述蛋白质IbMYB48的核酸分子实现；
所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；
所述植物为薯蓣科植物或十字花科植物。
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