CN111154800A

CN111154800A - 水稻OsRNCR基因及其编码蛋白在增强植物耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN111154800A
Application number: CN202010164889.2A
Authority: CN
Inventors: 王文生; 傅彬英; 汪娟; 王银晓; 赵秀琴; 杜丰平; 徐建龙; 黎志康
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明公开了水稻OsRNCR基因及其编码蛋白和重组载体在增强植物耐盐性中的应用。本发明提供了如下1)‑3)中任一种物质在调控植物耐盐性中的应用；1)蛋白OsRNCR；2)编码蛋白OsRNCR的核酸分子；3)含有编码蛋白OsRNCR的核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌；本发明发现在水稻中OsRNCR基因在受盐胁迫诱导后下调表达，在水稻中敲除OsRNCR基因能够显著提高水稻抵御盐胁迫的能力，该基因为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，培养耐盐性水稻，具有十分重要的理论和实际意义。

Description

水稻OsRNCR基因及其编码蛋白在增强植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsRNCR基因及其编码蛋白和重组载体在增强植物耐盐性中的应用。

背景技术

水稻是全世界三分之一以上人口的主食，也是我国65％以上人口的主食，90％的水稻都在亚洲种植。然而随着人口的急剧增长、气候条件的恶化导致对水稻产量的需求日益增加。要满足这个需求，除了增加粮食单产外，增加耕地面积是最简单有效的方法，但近年来日益严重的土壤盐渍化已成为进一步扩大种植面积的主要障碍。盐害是影响水稻生长发育及产量的重要的非生物胁迫，盐胁迫会对水稻体内的离子平衡产生影响，渗透调节物质和抗氧化物酶类的含量也会发生变化。为了克服盐害对水稻生产的不利影响同时扩大水稻的种植面积，挖掘和克隆耐盐基因，并利用耐盐基因培育耐盐新品种是最经济、最环保、最有效的方式。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了1)-3)中任一种物质在调控植物耐盐性中的应用；

1)蛋白OsRNCR；

2)编码蛋白OsRNCR的核酸分子；

3)含有编码蛋白OsRNCR的核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌；

所述蛋白OsRNCR为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质；

(3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。

上述应用中，所述编码蛋白OsRNCR的核酸分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

本发明另一个目的是提供一种制备耐盐性提高转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下方法1)或2)或3)：

1)所示的方法包括如下步骤：降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR的活性或含量，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物；

2)所示的方法包括如下步骤：降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸的表达，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物；

3)所示的方法包括如下步骤：对所述目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸进行基因编辑，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物；

上述转基因植物耐盐性高于目的植物体现如下几个方面：

1)盐胁迫下转基因植物盐害级别低于目的植物；

2)盐胁迫下转基因植物地上部干重和/或地下部干重高于目的植物；

3)盐胁迫下转基因植物地上部和/或地下部钠离子含量低于目的植物；

4)盐胁迫下转基因植物地上部/或地下部MDA含量显著低于目的植物；

5)盐胁迫下转基因植物地上部/或地下部SOD的含量显著高于目的植物。

所述蛋白OsRNCR为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述方法中，所述降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR的活性或含量，或，降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸的表达，均是通过对所述目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸进行基因编辑实现；

或，所述蛋白OsRNCR的编码核酸是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

上述方法中，所述基因编辑是通过CRISPR/Cas9系统实现。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶序列为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统包括含有sgRNA1编码基因、sgRNA2编码基因和cas9基因的重组载体；

所述sgRNA1编码基因的核苷酸序列为序列5；

所述sgRNA2编码基因的核苷酸序列为序列6。

如下a-c任一如下物质在培育耐盐性植物或培育耐盐性提高的植物中的应用也是本发明保护的范围；

a、降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR的活性或含量的物质；

b、降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸的表达的物质；

c、对所述目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸进行基因编辑的物质。

上述应用中，所述物质为如下(1)-(3)中任一种生物材料：

(1)上述CRISPR/Cas9系统；

(2)上述重组载体；

(3)含有上述重组载体的微生物转化体。

上述应用中的生物材料也是本发明保护的范围。

本发明发现在水稻中OsRNCR基因在受盐胁迫诱导后下调表达，在水稻中敲除OsRNCR基因能够显著提高水稻抵御盐胁迫的能力，该基因为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，培养耐盐性水稻，具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为以实时定量PCR分析OsRNCR在盐胁迫下的表达量差异；

图2为转OsRNCR CRISPR/Cas9水稻的鉴定；

图3为CRISPR敲除转基因植株耐盐相关表型鉴定；

图4为CRISPR敲除转基因植株钾钠离子含量测定；

图5为CRISPR敲除转基因植株生理指标测定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合实施例对本发明提供的水稻OsRNCR基因及其编码蛋白和重组载体在增强植物耐盐性中应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实验材料：日本晴(Nipponbare，Oryza sativa ssp.japonica)记载在如下参考文献：水稻品种“日本晴”[J].农业科技通讯,1973(02):31.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、不同胁迫处理条件下OsRNCR基因的时空表达差异

1、水稻的盐胁迫

水稻日本晴种子在50℃烘3天打破休眠，用0.01g/mL次氯酸钠水溶液浸泡10分钟进行表面消毒，用去离子水清洗后，在25℃下浸种24h、然后37度催芽24h至露白。选发芽一致的种子播于剪去底部的PCR板中，二叶前水培，二叶后用Yoshida营养液培养。于两叶一心期在含有120mM NaCl的Yoshida营养液(Coolaber公司，货号：NSP1040)中继续培养(盐处理)，0h，0.5h，1h，3h，6h，12h，24h，48h时取样(Nacl)。以在不含有120mM NaCl的Yoshida营养液中培养作为对照(CK)。

2、实时定量PCR分析OsRNCR基因

采用TRIZOL试剂提取上述1得到的盐处理实验样品总RNA，并进行RNA纯度的分析：用1％琼脂糖凝胶电泳快速检测提取的总RNA的完整性，DNase I消化RNA中的基因组DNA，具体方法和步骤参照说明书。

将上述RNA反转录得到cDNA：第一链cDNA的合成用反转录用试剂盒(天根生化科技有限公司，Code no：KR118)。

以cDNA为模板，用如下OsRNCR的PCR引物进行Real Time PCR反应：

所用OsRNCR的PCR引物如下：

F：5′-AGGCCGTTACTTATCCATGCA-3′；

R：5′-ACGTTGCAGATCTTTGATCGC-3′；

内参基因UBQ引物序列为：

F：5′-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3′；

R：5′-CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3′。

Real Time PCR的分析使用天根生化科技有限公司的荧光定量检测试剂盒(Codeno：FP205)，应用的Real Time PCR扩增仪为ABI7500，方法见说明书。

数据分析：

用相对定量法计算目的基因相对表达量Rel.Exp＝2-^ΔΔCt，其中ΔΔCt＝[(待测样品目的基因的Ct-待测样品看家基因的Ct)-(对照组目的基因的Ct-对照组看家基因的Ct)]。

标准方差的计算用Excel完成，先用统计函数STDEV算出样品和对照的S值，再将两个S值算平方，算出(S1²+S2²)/3的值，进而算出X＝Power((S1²+S2²)/3，0.5)，最后算出方差＝(2^(-ddct-x)-2^(-ddct+x))/2。

结果如图1所示，可以看出，盐胁迫可以诱导日本晴中OsRNCR下调表达。

实施例2、OsRNCR基因CRISPR敲除株系的构建及耐盐性检测

一、OsRNCR基因CRISPR敲除株系的构建

1、OsRNCR基因CRISPR敲除载体构建

根据OsRNCR基因cDNA序列设计敲除的靶位点，靶位点1序列：5′-ATGAGCCAGGACGTGCTGAG-3′(序列3)，靶位点2序列：5′-CTAGAGAGCCTATTAAATGC-3′(序列4)。

实验方法及载体均来自刘耀光院士实验室，载体记载在如下文献中：Ma X,ZhangQ,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y,Xie Y,Shen R,Chen S,WangZ,Chen Y,Guo J,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu YG.A Robust CRISPR/Cas9 System forConvenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and DicotPlants.Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284。

构建利用CRISPR/Cas9方法编辑OsRNCR基因的重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsRNCRsgRNA1-OsRNCRsgRNA2，所用靶序列1为ATGAGCCAGGACGTGCTGAG；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列的sgRNA记为sgRNA1；所用靶序列2为CTAGAGAGCCTATTAAATGC；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列的sgRNA记为sgRNA2。

重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsRNCRsgRNA1-OsRNCRsgRNA2按照如下方法制备：

1)sgRNA表达盒构建

以LacZ-U6a-sgRNA载体为模板，使用引物：

U-F:5′-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3′；

U6a-ALN-R:5′-CTCAGCACGTCCTGGCTCATCGGCAGCCAAGCCAGCA-3′进行PCR扩增，将831bp且序列正确的DNA片段命名为U6a-ALN；

以OsU6a-sgRNA载体为模板，使用引物：

gR-ALN-F:5′-ATGAGCCAGGACGTGCTGAGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3′；

gR-r:5′-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3′进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA1，序列5；

以LacZ-U6b-sgRNA质粒为模板，使用引物：

U-F:5′-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3′；

U6b-ALN-R:5′-GCATTTAATAGGCTCTCTAGCAACACAAGCGGCAGC-3′进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6b-ALN；

以OsU6b-sgRNA载体为模板，使用引物：

gR-ALN-F2:5′-CTAGAGAGCCTATTAAATGCGTTTTAGAGCTAGAAAT-3′；

gR-R:5′-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3′

进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA2，序列6.

使用引物：

Pps-R:5′-TTCAGAGGTCTCTACCGACTAGTCACGCGTATGGAATCGGCAGCAAA-3′,

Pgs-2:5′-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′；

Pps-2:5′-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′,

Pgs-L:5′-AGCGTGGGTCTCGCTCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGC-3′两对引物，通过overlapping PCR将U6a-ALN、sgRNA1、U6b-ALN、sgRNA2连在一起；随后使用接头引物：

V-F:5′-GCGCCGTAGTGCTCGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′；

V-R:5′-GCTGCCGATTCCCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3′

进行PCR扩增，得到的序列正确的DNA片段即为sgRNA表达盒，命名为LacZ-OsU6-sgRNA-ALN，其结构为LacZ-OsU6a-sgRNA1-OsU6b-sgRNA2，该表达盒的核苷酸序列为序列表中7，序列7的第242-688位为U6a启动子，第689-791位为sgRNA1的编码序列，第792-1163位为U6b启动子，第1164-1266位为sgRNA2的编码序列。

2)OsRNCR重组载体的构建

将上述序列7所示的LacZ-OsU6-sgRNA-ALN与经BsaI酶切pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(记载在如下文献中：Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,LiH,Lin Y,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,Guo J,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu YG.ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants.Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)得到的载体骨架进行同源重组连接反应，反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，将得到的序列正确的重组载体命名为pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsRNCRsgRNA1-OsRNCRsgRNA2，即OsRNCR基因敲除载体。

OsRNCR基因敲除载体中含有sgRNA1的编码基因和sgRNA2编码基因，其表达sgRNA1和sgRNA2。

sgRNA1的编码基因的核苷酸序列为ATGAGCCAGGACGTGCTGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(序列5)；

sgRNA2的编码基因的核苷酸序列为CTAGAGAGCCTATTAAATGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(序列6)。

2.农杆菌转化

冻融法将重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsRNCRsgRNA1-OsRNCRsgRNA2转入农杆菌EHA105感受态细胞中(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Ruifang Yang,Qicai Tang,HuimeiWang,Xiaobo Zhang,Gang Pan,HongWang and Jumin Tu Analyses of two rice(Oryza sativa)cyclin-dependentkinase inhibitors and effects of transgenic expression of OsiICK6 on plantgrowth and development，2011,Annals of Botany,107:1087-1101)，方法参照分子克隆实验指南，得到表达重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsRNCRsgRNA1-OsRNCRsgRNA2的重组农杆菌。

3.遗传转化

用农杆菌介导的遗传转化法，以日本晴为受体材料，进行遗传转化(培养基配方见如下表1)，具体方法如下：

1)愈伤诱导

取适量成熟的日本晴水稻种子，脱壳后，先用70％酒精清洗消毒1min，期间不断地摇荡，再用15％的次氯酸钠消毒处理30min(可置于摇床上振荡)；最后用无菌蒸馏水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种。将消毒处理后的种子接种于含有2.0mg/L的2，4-D的诱导培养基中，28℃暗培养30～40天。培养获得的愈伤在继代培养基上扩大培养，每2周继代一次，直至胚性愈伤形成。

2)农杆菌侵染

a)将表达pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsRNCRsgRNA1-OsRNCRsgRNA2的重组农杆菌划线于含有抗生素(50mg/L卡那霉素或壮观霉素、25mg/L利福平)的LB固体培养基表面，28℃，200rpm培养过夜。

b)用灭过菌的牙签挑取单克隆菌落，接种到5mL含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃震荡培养到OD₆₀₀＝0.5。

c)取活化好的新鲜菌液按1:100的比例接种到25mL相同的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至OD₆₀₀＝0.5。

d)菌液在5000g，4℃下离心10min收集菌体，弃去上清液；加入25mL 10mM的MgSO₄悬浮菌体，并用移液枪轻轻吸打使其充分悬浮，在5000g，4℃下离心10min重新收集菌体，弃去上清液。

e)用25mL含有200μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS浸染培养基重新悬浮。

f)将生长状态良好的胚性愈伤从继代培养基中转移至表面覆有无菌滤纸的培养皿中(愈伤切成0.3-0.4mm大小)，在超净工作台上风干10～20min。

g)将干燥的胚性愈伤浸入含有上述菌液的50mL离心管中20min，期间每隔5min摇荡一次；之后倒掉菌液，将愈伤取出置于无菌滤纸上风干10～20min，然后转移至表面铺有无菌滤纸的含有200μM乙酰丁香酮(AS)的CC培养基中，25℃黑暗条件下共培养3天。

h)收集表面没有明显农杆菌的愈伤组织，用含600mg/L头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸取多余水分。

i)将愈伤组织转入筛选培养基(含500mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的N6培养基)上继续筛选2-3次，每次两周。最终得到生长良好的鲜黄色潮霉素抗性愈伤组织。

3)转化体植株再生

取新鲜潮霉素抗性的愈伤，将愈伤组织分割成2mm的小块，接于预分化培养基中，

28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养8-9天后将已分化出不定芽的愈伤组织后转入再生培养基(250mL组培瓶)上，继续光照培养。等到不定芽长成4-6cm高的小苗后再转移到生根培养基中，在28℃光照培养间(12h光照/12h黑暗)条件下培养约15天，得到转化体植株，移到温室种植(T0代)，一月后取叶片进行PCR，测序鉴定，并收获其转基因植株种子(T1代)。

得到T1代CRISPR1/2水稻种子。

表1遗传转化所用培养基及其配方

5、转基因植株分子鉴定

1)测序

播种T1代CRISPR1/2水稻种子，得到T1代CRISPR1/2水稻。

提取不同株系的T1代CRISPR1/2水稻的叶片的DNA，用如下引物：ba1-F:TGTGTGTGCAGTGGAGGTGAAG，ba1-R:CAGAATGCATCCCACATGAGAG；ba2-F:CAGTTGGATGCAGCTAAGGA，ba2-5R:CAGTGTATCATTCTATCATTTGC进行PCR扩增，得到PCR产物。

对PCR产物进行测序，

其中2个株系T1代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和CRISPR-2的结果如图2所示，

T1代CRISPR1/2水稻CRISPR-1中OsRNCR编码区第50-52位核苷酸(缺失CTG)和第272-275位核苷酸缺失(缺失ATGC)，导致第17位氨基酸缺失，到第94位氨基酸翻译终止；

T1代CRISPR1/2水稻CRISPR-2中OsRNCR编码区第50-54位核苷酸缺失(CTGAG)和第272位核苷酸后插入一个核苷酸(G)，导致第17位氨基酸后发生大片段缺失，蛋白质功能丧失。

上述结果表明，T1代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和T1代CRISPR1/2水稻CRISPR-2均为CRISPR敲除转基因水稻。

培育T1代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和T1代CRISPR1/2水稻CRISPR-2获得T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-2。

二、OsRNCR基因CRISPR敲除株系耐盐性检测

1、株高、根长、地上部干重和根部干重检测

盐胁迫组(Nacl)：将T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1(CRISPR)和野生型(WT，日本晴)材料(WT)在25℃下浸种24h、然后37℃催芽24h至露白。选发芽一致的种子播于剪去底部的PCR板中，二叶前水培，随后用Yoshida营养液进行培养，于两叶一心期转移至含有150mMNacl的Yoshida营养液中培养进行盐处理，以28℃，光照80％，14小时；24℃，光照0％，10小时的循环模式培养。

对照组(CK)：用正常Yoshida营养液培养T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和野生型(日本晴)为对照。

每个株系选取5株。实验重复3次，结果取平均值。

盐处理后14天观察按照下表2进行盐害等级SES评价。

表2苗期耐盐性目测SES分级标准

同时收集植株样品，将对照组和盐胁迫组的地上部和地下部分别置于80度烘箱中烘干至恒重，测定干重DW，全株干重为地上部干重+地下部干重。

结果如图3所示，

肉眼观察盐胁迫组T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1的耐盐相关表型(如卷叶、干枯)优于野生型(图3A)；

盐害等级SES评价检测结果如图3B所示，可以看出，盐胁迫组T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1与野生型材料盐害级别降低。

盐胁迫组T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1的地上部干重和地下部干重结果如图3C和3D所示，可以看出，盐胁迫组T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1的地上部干重和地下部干重均显著高于野生型，对照组中T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和野生型水稻无显著差异。

上述结果表明，与野生型水稻相比，在盐胁迫下，敲除OsRNCR基因可以显著提高水稻的耐盐性。

2、地上部和根部的钾钠离子浓度测定

将上述1中盐胁迫组(NaCl)中盐处理14天的T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和野生型水稻烘干后的地上部和地下部样品装入密闭性好的30ml离心管中，加入100mM醋酸，于90℃水浴恒温振荡器中提取2小时，将提取液分成两组，测定前将原液转移至2ml离心管中，离心，再根据原液浓度，稀释一定倍数，稀释3次重复，减少操作误差，分别用S2型火焰原子吸收光谱仪(S2型火焰原子吸收光谱仪，美国热电公司生产)测定地上部和根部的K⁺浓度和Na⁺浓度。测定K⁺浓度的光波长为766.5nm，测定Na⁺的光波长为589.0nm，火焰为空气-乙炔优级纯火焰。以对照组为对照。

计算钾钠离子从根部到地上部的转运量，参照Saqib(2005)的计算公式：

根部到地上部Na⁺转运＝地上部Na⁺浓度(mmol/g)/根部Na⁺浓度(mmol/g)

根部到地上部K⁺转运＝地上部K⁺浓度(mmol/g)/根部K⁺浓度(mmol/g)

T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1的钾钠离子测定结果如图4所示，对于钾离子浓度来讲，盐胁迫造成敲除材料CRISPR-1和野生型中钾离子浓度的一致下降，但总体来说，在胁迫处理后，CRISPR敲除材料CRISPR-1的根部钾离子含量高于野生型(图A,B，SKC指地上部钾离子浓度(Shoot K+concentration)，RKC指地下部钾离子浓度(Root K+concentrationv))

对于钠离子浓度来讲，盐胁迫造成敲除材料CRISPR-1和野生型中钠离子浓度的一致上升，而CRISPR敲除材料CRISPR-1的地上部和地下部钠离子含量显著低于野生型(图C,D，SKC指地上部钠离子浓度，RNC指地下部钠离子浓度；对盐胁迫对水稻产生毒害的主要是钠离子，钠离子浓度降低了，耐盐性提高)。

分析敲除材料和野生型材料的地上部，地下部钠钾比可以发现，盐胁迫后，CRISPR敲除CRISPR-1和野生型材料的钠钾比都有所上升，但CRISPR敲除材料的地上部和地下部钠钾比显著低于野生型(图E,F)。

3、生理指标测定

将上述1中盐胁迫组(NaCl)中盐处理14天的T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1和野生型水稻，剪取根系，洗净泥沙，用蒸馏水冲洗3～5次，吸干多余水分；取待测叶样/根样0.3g，2mL 50mM PBS(PH＝7.8，含0.2mM EDTA，2％(w/v)PVP)，少许石英砂。冰浴研磨，12000g(rcf)离心20min，取上清液(2mL离心管或者10mL离心管)，此上清液用于测定各种酶含量。以对照组为对照。

各种酶的活性的测定使用试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，货号：SOD-1-Y，POD-1-Y,MDA-1-Y)

待测样品称取0.1g，快速液氮研磨后加入1mL提取液，充分混匀后10000rpm,4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

1)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性测定：

按照说明书稀释和配置好试剂，按顺序加试剂和样品入96孔板，充分混匀，室温放置30分钟，酶标仪预热30分钟以上，与560nm处测定各管吸光值A。

计算：抑制百分率＝(A对照管－A测定管)÷A对照管×100％

SOD活性(U/g鲜重)＝[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V(反应总体积)]÷(W(样本质量)×V(样本体积)÷V(提取液体积))＝11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W(样本质量)

2)过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性测定：

配制工作液，25℃水浴10分钟，向96孔板中加入样品10μL、工作液190μL，混匀，记录470nm下1min时吸光值A1和2min后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。以每克组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.005为一个酶活力单位计算：POD(U/g鲜重)＝ΔA×V(反应总体积)÷(W(样本质量)×V(样本体积)÷V(提取液体积))÷0.005÷T(反应时间)＝4000×ΔA÷W(样本质量)

3)丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定：

吸取0.3mL试剂一加入1.5mL离心管中，再加入0.1mL样本,混匀，95℃水浴30分钟，(盖紧，盖子易崩开)，取出置于冰浴中冷却，室温下10000rpm，离心10min。吸取200μL上清液加入96孔板中，测定532nm和600nm处的吸光值，记为A532和A600，ΔA＝A532-A600。

MDA含量(nmol/g鲜重)＝[ΔA×V(反应总体积)÷(155×10³L/mol/cm×0.5cm)×10⁹]÷(W×V(样本体积)÷V提取液体积))＝51.6×ΔA÷W(样本质量)

盐胁迫后T2代CRISPR1/2水稻CRISPR-1的生理指标测定结果如图5所示，结果显示盐胁迫会导致包括野生材料和转基因材料CRISPR-1的MDA含量的上升，但CRISPR敲除材料CRISPR-1的地上部MDA含量显著低于野生型(图A,B)；而SOD的含量在CRISPR敲除材料CRISPR-1中要高于野生型(图C,D)，而POD含量没有显著差异(图E,F)；由此可知，相比于野生型，CRISPR敲除材料CRISPR-1中抗氧化物质较多，过氧化物脂质的含量较低，其抗氧化胁迫的能力较强，从而提高水稻的耐盐性。抗氧化物质较多导致过氧化物脂质少，所以耐盐性高。

上述结果表明，在水稻中敲除OsRNCR基因能够显著改善水稻抵御盐胁迫的能力，在水稻抗逆育种中具有重要价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120> 水稻OsRNCR基因及其编码蛋白和重组载体在增强植物耐盐性中的应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 660

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgcccggac tgatcgatgt gcacgcgcat cttgatgagc caggacgtgc tgagtgggag 60

gggttctcca ctggtacaag agcagcagct gcaggtggca ttacaacatt agtggacatg 120

cctcttaata gctacccgtc aactgtttct gaagaaactc tcaagctgaa gttggatgca 180

gctaaggata aactacatgt tgatgtaggg ttctggggag gcctcgttcc agagaatgcc 240

ctcaatccaa gtgcactaga gagcctatta aatgcaggcg tcttagggct caagtcattt 300

atgtgcccct caggtataaa tgacttcccc atgacaaatt caactcatat tgaggagggc 360

ctggttacat tggcaaagta caaaaggccg ttacttatcc atgcagaacg catacccgat 420

gttcagaatg aagatgggat cgatggtgaa ctagatccta aagcctatac gacatatctt 480

aaatctagac caccagcatg ggaggaagca gcgatcaaag atctgcaacg tgcgatgaaa 540

gacacggaga tagggggtcg gtcagaagga gctcatattc acatagttca tctctcagat 600

gcaaaacttc tcttgggctt cttaaggatg caaaacaaaa tggtgcaagg gttagtgtag 660

<210> 2

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Pro Gly Leu Ile Asp Val His Ala His Leu Asp Glu Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ala Glu Trp Glu Gly Phe Ser Thr Gly Thr Arg Ala Ala Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ile Thr Thr Leu Val Asp Met Pro Leu Asn Ser Tyr Pro Ser Thr

35 40 45

Val Ser Glu Glu Thr Leu Lys Leu Lys Leu Asp Ala Ala Lys Asp Lys

50 55 60

Leu His Val Asp Val Gly Phe Trp Gly Gly Leu Val Pro Glu Asn Ala

65 70 75 80

Leu Asn Pro Ser Ala Leu Glu Ser Leu Leu Asn Ala Gly Val Leu Gly

85 90 95

Leu Lys Ser Phe Met Cys Pro Ser Gly Ile Asn Asp Phe Pro Met Thr

100 105 110

Asn Ser Thr His Ile Glu Glu Gly Leu Val Thr Leu Ala Lys Tyr Lys

115 120 125

Arg Pro Leu Leu Ile His Ala Glu Arg Ile Pro Asp Val Gln Asn Glu

130 135 140

Asp Gly Ile Asp Gly Glu Leu Asp Pro Lys Ala Tyr Thr Thr Tyr Leu

145 150 155 160

Lys Ser Arg Pro Pro Ala Trp Glu Glu Ala Ala Ile Lys Asp Leu Gln

165 170 175

Arg Ala Met Lys Asp Thr Glu Ile Gly Gly Arg Ser Glu Gly Ala His

180 185 190

Ile His Ile Val His Leu Ser Asp Ala Lys Leu Leu Leu Gly Phe Leu

195 200 205

Arg Met Gln Asn Lys Met Val Gln Gly Leu Val

210 215

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tgagccagga cgtgctgag 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tagagagcct attaaatgc 19

<210> 5

<211> 103

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgagccagg acgtgctgag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 103

<210> 6

<211> 103

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ctagagagcc tattaaatgc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 103

<210> 7

<211> 1266

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ttcagaggtc tctcggcagc tggaatcggc agcaaaggac gcgttgacat tgtaggacta 60

tattgctcta ataaaggagg cagctatgct ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 120

aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 180

taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcta 240

attttttcct gtagttttcc cacaaccatt ttttaccatc cgaatgatag gataggaaaa 300

atatccaagt gaacagtatt cctataaaat tcccgtaaaa agcctgcaat ccgaatgagc 360

cctgaagtct gaactagccg gtcacctgta caggctatcg agatgccata caagagacgg 420

tagtaggaac taggaagacg atggttgatt cgtcaggcga aatcgtcgtc ctgcagtcgc 480

atctatgggc ctggacggaa taggggaaaa agttggccgg ataggaggga aaggcccagg 540

tgcttacgtg cgaggtaggc ctgggctctc agcacttcga ttcgttggca ccggggtagg 600

atgcaataga gagcaacgtt tagtaccacc tcgcttagct agagcaaact ggactgcctt 660

atatgcgcgg gtgctggctt ggctgccgat gagccaggac gtgctgaggt tttagagcta 720

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 780

gtgctttttt tttcagaggt ctctcggcag ctggaatcgg cagcaaagga tgcaagaacg 840

aactaagccg gacaaaaaaa aaaggagcac atatacaaac cggttttatt catgaatggt 900

cacgatggat gatggggctc agacttgagc tacgaggccg caggcgagag aagcctagtg 960

tgctctctgc ttgtttgggc cgtaacggag gatacggccc acgagcgtgt actaccgcgc 1020

gggatgccgc tgggcgctgc gggggccgtt ggatggggat cggtgggtcg cgggagcgtt 1080

gaggggagac aggtttagta ccacctcgcc taccgaacaa tgaagaaccc accttataac 1140

cccgcgcgct gccgcttgtg ttgctagaga gcctattaaa tgcgttttag agctagaaat 1200

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 1260

tttttt 1266

Claims

1.如下1)-3)中任一种物质在调控植物耐盐性中的应用；

1)蛋白OsRNCR；

2)编码蛋白OsRNCR的核酸分子；

所述蛋白OsRNCR为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述编码蛋白OsRNCR的核酸分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

3.一种制备耐盐性提高转基因植物的方法，为如下方法1)或2)或3)：

所述蛋白OsRNCR为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR的活性或含量，或，降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸的表达，均是通过对所述目的植物基因组中的蛋白OsRNCR编码核酸进行基因编辑实现；

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述基因编辑是通过CRISPR/Cas9系统实现。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶序列为序列3所示的DNA分子和序列4所示的DNA分子。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统包括含有sgRNA1编码基因、sgRNA2编码基因和cas9基因的重组载体；

所述sgRNA1编码基因的核苷酸序列为序列5；

所述sgRNA2编码基因的核苷酸序列为序列6。

8.a-c任一如下物质在培育耐盐性植物或培育耐盐性提高的植物中的应用；

a、降低目的植物基因组中的蛋白OsRNCR的活性或含量的物质；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述物质为如下(1)-(3)中任一种生物材料：

(1)权利要求5-7中任一所述CRISPR/Cas9系统；

(2)权利要求7中所述重组载体；

(3)含有权利要求7中所述重组载体的微生物转化体。

10.权利要求9所述的生物材料。