CN112724219B

CN112724219B - 超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树

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Publication number: CN112724219B
Application number: CN202110136852.3A
Authority: CN
Inventors: 林晓飞; 祁彩芬; 李超然; 张海东; 闫春霞
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112724219A

Abstract

本发明公开了超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树。本发明提供了蛋白质，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在1)的N端或/和C端连接分子标签得到的共表达蛋白质；3)将1)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。本发明将盐生灌木西伯利亚白刺的关键耐盐基因NSHKT1转入84K杨，获得了耐盐、耐碱、抗氧化能力强的转基因杨树，为杨树在盐碱地带的应用提供了候选品种。

Description

超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树。

背景技术

植物根部是直接接触土壤中Na⁺的器官，因此根部的Na⁺外排，地上部分细胞对Na⁺的区隔化集中以及阻止Na⁺向地上部的运输是决定植物耐盐性的重要机制。液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(NHX1)将细胞质中的Na⁺逆浓度梯度运输到液泡中区隔化；细胞质膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(SOS1)能够将细胞质中的Na⁺逆向运送到细胞外的高Na⁺环境中；高效钾离子转运蛋白(HKT1)能够将进入木质部的Na⁺卸载到木质部薄壁细胞并通过韧皮部运回到根部以防止Na⁺在植物地上部分积累。截止目前，所开发及应用的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因，大多来自于拟南芥、番茄等甜土植物，而针对木本植物、特别是对盐生木本植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的开发与研究较为匮乏。已有研究发现，盐芥ThSOS1的表达量约为拟南芥AtSOS1的8～10倍，而且在甜土植物水稻和盐生植物盐芥中发现了相似的SOS信号通路，表明高等植物可能共用一套耐盐调控机制。因此，开发利用盐生植物的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因具有十分重要的意义。

白刺(Nirtaria L.)是蒺藜科(Zygophyllceae)白刺属的一种落叶小灌木，为盐生植物，主要分布在我国北部至西北部的内蒙古、宁夏、甘肃、青海和新疆等地，是干旱盐碱地带的建群种之一。白刺属植物的茎叶具有较厚的角质层、叶片被蜡质表皮毛、气孔内陷、栅栏组织和维管束发达、细胞内含物填充蜡质晶体，这些典型的旱生植物结构特征使其在抵御盐害中发挥作用。盐胁迫条件下较强的膜保护能力和膜修复能力，以及高效的胞内离子区隔化和渗透调节物质的积累能力赋予白刺属植物较强的耐盐性。内蒙古地区主要有四个种，即西伯利亚白刺(N.sibilica Pall)、唐古特白刺(N.tangutorum Bobr)、泡泡刺(N.sphaerocarpa Maxim)和齿叶白刺(N.roborowskii Kom)，其中西伯利亚白刺表现出更强的耐盐能力。西伯利亚白刺具有极其重要的生态价值，由于其在自然生境中受到盐、碱、旱的三重胁迫，导致其具有较强的耐盐碱和耐干旱能力，蕴含着丰富的抗逆基因资源。因此，研究其耐盐机理，鉴定耐盐相关基因并应用于牧草、农林作物的耐盐性遗传改良，具有十分重要的意义。

杨树是一种兼具经济和生态价值的多年生木本植物，因其生长快、产量高而被广泛应用于园林绿化、经济林和防护林。除胡杨外，大多数杨树品种对盐十分敏感，盐渍土对杨树生长产生不利影响。84K杨(Populus alba×Populus glandulosa)是1984年从韩国引进的一个白杨派无性系(雄株)，其生长速度快，适应性强，有较强的抗逆能力，而且其无飞絮，不会对环境造成污染，因而是杨树基因工程研究中的优良品种。84K杨虽然有较强的耐寒、耐旱能力，但其和大多数杨树一样对盐十分敏感，因而对其进行耐盐性遗传改良至关重要。由于包括杨树在内的木本植物的遗传转化获得转基因植物较为困难，存在周期长、转化率低等问题，使得通过转化耐盐基因改良杨树耐盐性的研究进展缓慢。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)在1)的N端或/和C端连接分子标签得到的共表达蛋白质；

3)将1)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-7)任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；

2)序列表中序列1的第61-1722位核苷酸组成的DNA分子；

3)序列表中序列1的第1-1843位核苷酸组成的DNA分子；

4)序列表中序列1的第14-1777位核苷酸组成的DNA分子；

5)在1)-4)中任一种序列的末端连接标签编码基因得到的共表达核酸分子；

6)与1)-4)中任一种限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；

7)在严格条件下与1)-4)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。

含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌也是本发明保护的范围。

上述的蛋白质或上述的核酸分子或上述的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌在如下A-C中的应用也是本发明保护的范围；

A、提高杨树耐受性；

B、培育耐受性提高的杨树；

C、培育耐盐、耐碱和/或耐氧化的杨树。

本发明另一个目的是提供一种制备耐逆性提高的转基因杨树的方法，为如下1)或2)：

1)所述的方法包括如下步骤：提高目的杨树中上述的蛋白质的含量和/或活性，得到转基因杨树；

2)所述的方法包括如下步骤：提高目的杨树中编码上述的蛋白质的核酸分子的表达，得到转基因杨树；

所述转基因杨树的耐逆性抗性高于所述目的杨树。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐性、耐氧化性和/或耐碱性。

上述方法中，所述提高目的杨树中上述的蛋白质的含量和/或活性，或，所述提高目的杨树中编码上述的蛋白质的核酸分子的表达，均是将所述编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子导入所述目的杨树中。

本发明将盐生灌木西伯利亚白刺的关键耐盐基因NSHKT1转入84K杨，获得了耐盐、耐碱、抗氧化能力强的转基因杨树，为杨树在盐碱地带的应用提供了候选品种。

附图说明

图1为扩增NSHKT1 cDNA全长序列的PCR产物。

图2为NSHKT1基因ORF区域的扩增和重组载体的构建；A.NSHKT1基因ORF区域的扩增产物；B.pBI 101和pMD19T-NSHKT1的质粒双酶切产物；C,菌落PCR鉴定pBI101-NSHKT1重组质粒；M1：200bp DNA Marker；M2：DL15000 DNA Marker；1：NSHKT1-ORF PCR扩增产物；2：pMD19T-NSHKT1质粒双酶切产物；3：pBI101质粒双酶切产物；4：重组质粒的PCR产物。

图3为84K杨的遗传转化；(A)外植体的切割及预培养；(B)农杆菌侵染；(C)分化培养；(D)抗性筛选；(E)生根培养；(F)获得抗性植株(比例尺＝1cm)。

图4为转NSHKT1基因84K杨的基因组PCR鉴定；M：200bp DNA Ladder；+：pBI101-NSHKT1重组质粒；UT：非转基因84K杨；H1-H15：转NSHKT1基因84K杨。

图5为转NSHKT1基因84K杨的RT-PCR鉴定；UT：非转基因84K杨；H1-H15：转NSHKT1基因84K杨。

图6为NSHKT1基因在非转基因及转基因84K杨中的表达水平；UT：非转基因84K杨；H1-H15：转NSHKT1基因84K杨；误差线代表三个独立实验的标准偏差(SD)；不同的小写字母分别代表每组样本之间单因素方差分析的显著性(P<0.05)。

图7为转NSHKT1基因84K杨的叶圆盘耐受性分析；(A)NaCl胁迫下的叶圆盘(B)NaCl胁迫后叶圆盘叶绿素含量(C)H₂O₂胁迫下的叶圆盘(D)H₂O₂胁迫后叶圆盘叶绿素含量(E)NaHCO₃胁迫下的叶圆盘(F)NaHCO₃胁迫后叶圆盘叶绿素含量；UT：非转基因84K杨；H2、H8、H15：转NSHKT1基因84K杨；误差线代表三个独立实验的标准偏差(SD)；不同的小写字母分别代表每组样本之间单因素方差分析的显著性(P<0.05)。

图8为盐胁迫下非转基因和转NSHKT1 84K杨的生根情况；UT：非转基因84K杨；H2、H8、H15：转NSHKT1基因84K杨。

图9为非转基因与转NSHKT1基因84K杨的耐盐性分析；(A)150mM NaCl条件下非转基因和转基因杨树长势(比例尺＝10cm)；(B)150mM NaCl胁迫条件下非转基因与转基因杨树叶片(比例尺＝3cm)；(C)150mM NaCl胁迫条件下非转基因与转基因杨树根的生长情况(比例尺＝10cm)；(D)150mM NaCl胁迫条件下非转基因与转基因杨树的株高；(E)150mMNaCl胁迫条件下非转基因与转基因杨树的叶绿素含量；(F)150mM NaCl胁迫条件下非转基因与转基因杨树的相对含水量；(G)150mM NaCl胁迫条件下非转基因与转基因杨树根的生物量；UT：非转基因84K杨；H2、H8、H15：转NSHKT1基因84K杨；误差线代表三个独立实验的标准偏差(SD)；不同的小写字母分别代表每组样本之间单因素方差分析的显著性(P<0.05)。

图10为转NSHKT1基因84K杨的耐盐性分析；(A)SOD活性；(B)CAT活性；(C)POD活性；(D)脯氨酸含量；(E)MDA含量；UT：非转基因84K杨；H2、H8、H15：转NSHKT1基因84K杨；误差线代表三个独立实验的标准偏差(SD)；不同的小写字母分别代表每组样本之间单因素方差分析的显著性(P<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中植物材料：84K杨(Populus alba×Populus glandulose)的无菌组培苗由内蒙古农业大学杨海峰副教授惠赠；培养条件：温度24±2℃，光周期16/8h，光照强度75-100μmol·m^-2·s^-1，湿度70％。

上述84K杨记载在如下文献中：李慧,赵慧,闵现东,等.84K杨引种栽培及扦插育苗研究[J].现代农业科技,2017(13):146-147。

下述实施例中所用培养基：

(1)预培养培养基：MS粉(4.33g/L)+Sucrose(10g/L)+NAA(0.05mg/L)+6-BA(0.5mg/L)+Agar(0.78％)

(2)共培养培养基：MS粉(4.33g/L)+Sucrose(30g/L)+NAA(0.1mg/L)+6-BA(1.0mg/L)+Agar(0.78％)+AS(200μmol/mL)

(3)分化培养基：MS粉(4.33g/L)+Sucrose(30g/L)+NAA(0.1mg/L)+6-BA(1.0mg/L)+Agar(0.78％)+Cef(200mg/L)+Tim(200mg/L)

(4)筛选培养基：MS粉(4.33g/L)+Sucrose(30g/L)+NAA(0.1mg/L)+6-BA(1.0mg/L)+Agar(0.78％)+Cef(200mg/L)+Tim(200mg/L)+Kan(50mg/L)

(5)生根培养基：1/2MS粉(2.17g/L)+Sucrose(30g/L)+IBA(0.4mg/L)+Agar(0.78％)

实施例1、NSHKT1基因的扩增

西伯利亚白刺(Nitraria sibirica Pall)的NSHKT1基因，根据NSHKT1基因3’和5’末端序列设计引物Full-NsHKT-F：5’-CCACTCTCAGAATTCAATCC-3’，Full-NsHKT-R：5’-TAGGCAGCAGGAACCACACGC-3’。

以cDNA为模板，用Full-NsHKT-F和Full-NsHKT-R进行PCR扩增，得到1800bp左右的目的产物(图1)。

上述PCR扩增反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃1min，72℃2min，35cycles；72℃7min。

经过测序，1800bp左右的目的产物具有NSHKT1基因，该PCR扩增产物的核苷酸序列为序列1第1-1843位，其中序列1第61-1722位为NSHKT1基因编码区，该基因编码的蛋白命名为NSHKT1蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

实施例2、转NSHKT1基因耐盐型杨树的制备

一、重组载体的构建

设计扩增包含NSHKT1的ORF(包含终止子)引物，分别在其5′端添加XbaI和BamHI识别位点，NsHKT-pBI-F:5’-TCTAGATCAATCCAATTCTATCTCGTC-3’和NsHKT-pBI-R:5’-GGATCCAGATAGTCAGACACAACTATTG-3’。

以cDNA为模板，用NsHKT-pBI-F和NsHKT-pBI-R进行PCR扩增，得到1764bpPCR产物(图2A)。

将扩增的1764bpPCR产物与PMD-19T连接后，得到PMD19T-NSHKT1载体。

分别用XbaI及BamHI双酶切PMD19T-NSHKT1及pBI101载体(Akama,K.,H.Shiraishi,S.Ohta,et al.(1992)."Efficient transformation of Arabidopsisthaliana:comparison of the efficiencies with various organs,plant ecotypesand Agrobacterium strains."Plant Cell Rep 12(1):7-11，图2B)，将酶切后的片段连接，构建pBI01-NSHKT1双元表达载体。

pBI01-NSHKT1双元表达载体菌落PCR鉴定(引物为NsHKT-pBI-F和NsHKT-pBI-R)结果如图2C所示。

经过测序，pBI01-NSHKT1双元表达载体为将序列表中序列1第14-1777位替换pBI101载体XbaI及BamHI双酶切位点间的DNA分子，得到的载体。

二、转NSHKT1基因耐盐型杨树的获得

1、重组菌

将上述pBI101-NSHKT1转化到农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌EHA105/pBI101-NSHKT1。

2、遗传转化制备转NSHKT1基因耐盐型杨树

84K杨的无菌组培苗由内蒙古农业大学杨海峰副教授惠赠；培养条件：温度24±2℃，光周期16/8h，光照强度75-100μmol·m-2·s-1，湿度70％。

利用农杆菌介导的叶盘法按以下步骤将其转化到84K杨的无菌组培苗中(图3)：

a、在无菌条件下挑选84K杨(以下称为野生型杨树)的幼嫩叶片，垂直叶脉划伤，平铺在预培养培养基上，置于光照培养箱中预培养2d，使细胞处于分裂旺盛期(图3A)。

b、挑取经鉴定重组农杆菌EHA105/pBI101-NSHKT1菌落接种于LB液体培养基(含kan和Rif)中，28℃摇床震荡培养至菌液OD600值达为0.5～0.8。加入0.02％的表面活性剂Silwet L-77并混匀，将预培养2d的外植体置于菌液中震荡6-10min，滤纸轻吸叶片表面菌液，并平铺在共培养培养基上，黑暗条件下共培养3-5d(图3B)。

c、将共培养后的叶片用灭菌水洗去表面菌落，用滤纸吸干后将其平铺于分化培养基上，光照培养2-3周，直至长出不定芽(图3C)。

d、将不定芽从叶片外植体上分离下来，置于添加Kan(50mg/L)的分化培养基上继续培养一个月左右，以完成抗性筛选(图3D)。

e、将可以正常生长的抗性芽(约1cm)转移至1/2MS生根培养基上继续培养(图3E)。

f、抗性芽生根后继续培养至10cm左右，得到抗性植株(图3F)。

3、转基因杨树鉴定

1)转NSHKT1基因84K杨的基因组PCR鉴定

将上述抗性植株取组织叶片称重，使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNAExtraction Kit试剂盒提取DNA，利用引物35S-F：5’-AGGAAGGTGGCTCCTACAAATG-3’和NSHKT1-R：5’-TGGATGAGACGGGGTACTAAGGTA-3’进行基因组PCR鉴定。以pBI101-NSHKT1重组质粒作为阳性对照，以野生型杨树的叶片作为阴性对照。

得到1800bp为阳性植株。

结果如图4所示，M：200bp DNA Ladder；+：pBI101-NSHKT1重组质粒；UT：非转基因84K杨(野生型杨树)；H1-H15：抗性植株；H1-H15株系及阳性对照pBI101-NSHKT1重组质粒均检测到目的片段，而阴性对照非转基因84K杨中没有检测到目的产物，表明H1-H15株系中NSHKT1已经成功转化到84K杨树中，命名为T0代转NSHKT1基因84K杨。

2)转NSHKT1基因84K杨的RT-PCR鉴定

使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒(操作过程见说明书的程序Protocol-I)提取上述T0代转NSHKT1基因84K杨植株叶片的RNA，

First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit合成cDNA第一链。

将反转录产物作为模板，以84K杨的Actin基因为内参，利用引物Actin-F(Populus)：5’-AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG-3’和Actin-R(Populus)：5’-GCATCATCACAATCACTCTCCGA-3’检测Actin基因的表达，反应条件：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃20s，30cycles；72℃5min。

利用引物NSHKT1-F：5’-GAAACTGGAGCACTTTTGTAACGC-3’和NSHKT1-R:5’-TGGATGAGACGGGGTACTAAGGTA-3’检测NSHKT1基因的表达。以野生型杨树的叶片作为非转基因对照。

结果如图5所示，UT：非转基因84K杨；H1-H15：T0代转NSHKT1基因84K杨；在非转基因对照和T0代转NSHKT1基因84K杨H1-H15均检测到Actin基因的表达，但只有T0代转NSHKT1基因84K杨H1-H15中检测到NSHKT1基因的表达。

结果表明，NSHKT1基因在转基因株系中稳定表达。

3)、NSHKT1基因在转基因84K杨中的表达水平

提取非转基因(野生型杨树)和T0代转NSHKT1基因84K杨株系叶片的总RNA，使用

All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)将其反转录合成cDNA第一链，反应条件为：42℃15min；85℃5s。

根据杨树肌动蛋白基因Actin和NSHKT1基因序列分别设计特异性引物qAction-F:5’-GCCATCTCTCATCGGAATGGAA-3’和qAction-R:5’-AGGGCAGTGATTTCCTTGCTCA-3’，qNSHKT1-F:5’-AGCAACGGATTCGAGCATGACC-3’和qNSHKT1-R:5’-TCCAAGTGAAGGCCAAGCAAGG-3’。

建立qPCR反应体系及标准曲线：将cDNA模板按5的倍数稀释成6个梯度，使用全式金TransStart Tip Green qPCR SuperMix进行Real time Q-PCR反应，反应条件为94℃5s，60℃15s，72℃10s，45cycles。计算Actin和NSHKT1基因的扩增效率，两个基因扩增效率均为2±5％即可利用这两对引物进行相对定量检测：以杨树Actin基因为内参，对非转基因及转基因株系进行qPCR反应，采用2﹣△△Ct法计算NSHKT1基因的相对表达水平。

结果如图6所示，UT：非转基因84K杨；H1-H15：T0代转NSHKT1基因84K杨，误差线代表三个独立实验的标准偏差(SD)；不同的小写字母分别代表每组样本之间单因素方差分析的显著性(P<0.05)；NSHKT1在非转基因植株中的表达量为0，在T0代转NSHKT1基因84K杨株系H2、H8、H15中的表达量较高，在其它株系中表达量不等。

因而选择T0代转NSHKT1基因84K杨H2、H8、H15进行后续表型分析。

4、转NSHKT1基因84K杨的耐盐性检测

1)转NSHKT1基因84K杨的叶圆盘抗逆性检测

选取移栽一月左右长势一致的T0代转NSHKT1基因84K杨H2、H8和H15和非转基因84K杨(UT)，使用孔径1cm的打孔器切取叶圆盘(注意避开叶脉部位)，将转基因和非转基因株系的叶圆盘分别浸在装有不同浓度NaCl水溶液(0、50、100、150、200mM)、H₂O₂水溶液(0％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％，体积百分含量)培养皿和装有不同浓度NaHCO₃水溶液(0、100、200、300、400mM)培养皿中，每皿16个叶圆盘，在24℃光照周期为16h光照/8h黑暗的培养箱中孵育72h，观察其变化并拍照记录，使用植物叶绿素(chlorophyll)含量测定试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定叶绿素含量。

NaCl胁迫处理后结果如图7A和7B所示：在0mM和50mMNaCl条件下，转NSHKT1基因84K杨与非转基因叶圆盘的表型无显著差异，叶绿素含量也无显著变化；随着NaCl溶液浓度的升高，非转基因和转NSHKT1基因株系的叶圆盘均软化、叶绿素含量降低，但150mM NaCl胁迫后，三个转基因株系H2、H8、H15叶圆盘的叶绿素含量均显著高于非转基因株系。NaCl胁迫条件下转NSHKT1基因84K杨与非转基因相比表现出了较强的耐受性。

H₂O₂胁迫处理后结果如图7C和7D所示：在0％和0.5％H₂O₂处理条件下，转NSHKT1基因84K杨与非转基因的叶圆盘完整度较好，但在1.0％和1.5％H₂O₂处理条件下，转基因株系的叶圆盘的褐化、白化程度较弱，而叶绿素含量也显著高于非转基因株系，转NSHKT1基因株系表现出较强的抗氧化能力。

NaHCO₃胁迫处理后结果图7E和7F显示：200mM、300mM NaHCO₃胁迫条件下，转基因株系的叶圆盘受损程度较小，叶绿素含量也显著高于非转基因株系，表现出较强的NaHCO₃耐受性。

这些结果表明：NSHKT1基因的过表达提高了84K杨对盐(NaCl)、氧化(H₂O₂)和碱(NaHCO₃)胁迫的耐受性，增强了84K杨的抗逆性。

2)盐胁迫下转NSHKT1基因84K杨的生根情况

选取长势一致的非转基因和T0代转NSHKT1基因84K杨H2、H8、H15组培苗，切取顶端4cm左右的幼芽(保留顶芽和三片叶子)，扦插在含有0、50、100、150、200mM NaCl的1/2MS培养基中进行光照培养，15天后观察并记录生根情况和存活率。

结果如图8所示,UT：非转基因84K杨；H2、H8、H15：转NSHKT1基因84K杨正常生长情况下(NaCl浓度为0)，非转基因和T0代转NSHKT1基因84K杨树均能正常生根且存活率为100％；随着NaCl浓度的升高，非转基因和T0代转NSHKT1基因84K杨株系生根率逐渐下降、侧根变少，但转基因株系表现出了更强的生根能力：其中当NaCl浓度为50mM时，非转基因与转基因株系并无显著差别，而在100和150mM NaCl胁迫条件下，转基因株系的生根能力较强于非转基因，尤其是在150mM NaCl条件下，转NSHKT1基因株系H8生根，而非转基因杨树无法生根，且转NSHKT1基因株系H8的存活率大于非转基因杨树。

该结果表明，在1/2MS培养基中NaCl浓度不高于150mM时，过表达NSHKT1可以在一定程度上提高84K杨的耐盐性。

3)在土壤盐胁迫下转NSHKT1基因84K杨的耐盐性分析

选取长势一致(株高10cm左右)的非转基因和T0代转NSHKT1基因84K杨H2、H8和H15组培苗移栽到土壤中，置于温室中定期浇灌Hoagland营养液。生长20天后，选取长势一致的幼苗分为两组，对照组定期浇灌Hoagland营养液，实验组浇灌等量的含150mM NaCl的Hoagland营养液。两周后，进行各项指标的测定。

(1)株高：用最大刻度30cm的直尺对地上部分株高进行测量(单位cm)。

(2)叶绿素含量：使用SPAD-502便携式叶绿素测定仪测定叶片叶绿素含量，每片在不同位置测定三次，每株取相同位置的三枚叶片进行测定。

(3)根的生物量测定：将植株的根部土壤轻轻蓬松脱离，用蒸馏水反复清洗干净并用吸水纸吸干。使用电子天平称量生物量。

(4)叶片相对含水量：使用电子天平测定植株相同位置叶片的鲜重Wf。将叶片完全浸泡于去离子水中，黑暗放置24h，吸胀后滤纸吸干叶片表面测定重量Wt。之后将叶片在80℃烘箱中烘干2d，测定其干重Wd。使用公式RWC＝(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100％计算叶片相对含水量(RWC)。

(5)保护酶活性的测定：使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒测定保护酶SOD、POD和CAT的活性，测定丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和脯氨酸的含量。

结果如下：

正常生长条件下，非转基因和转基因株系植株表型并无显著差别(图9A)；150mMNaCl胁迫后，植株均变矮小，叶片失水并开始脱落，但转基因株系的株高显著高于非转基因植株(图9A、D)。另一方面，正常生长情况下，各植株叶片的生长状况、叶绿素含量和相对含水量无显著差别(图9B、E、F)；150mM NaCl胁迫后，植株的叶片均有干枯、泛黄、坏死的现象，叶绿素含量均上升，但转基因株系的叶片状况更佳(图9B)，转基因株系H8和H15的叶绿素含量显著高于非转基因植株(图9E)，而三个转基因株系的叶片相对含水量也显著高于非转基因植株(图9F)。

将实验组和对照组的各植株的根轻轻分离，并用清水洗净后测量生物量。结果发现，正常生长情况下各株系的根系均很发达，根系状况无显著差别(图9C)；150mM NaCl胁迫后，各植株的根系均明显受到影响，但转基因植株的根系更长，侧根更加发达(图9C)，根的生物量也显著高于非转基因植株(图9G)。

以上实验结果表明：过表达NSHKT1基因可以提高84K杨的耐盐性。

为了调查盐胁迫条件下抗氧化系统发挥的作用，检测了非转基因和转基因杨树的保护酶(SOD、CAT和POD)活性，脯氨酸和丙二醛(MDA)的含量。

结果如图10所示，(A)SOD活性；(B)CAT活性；(C)POD活性；(D)脯氨酸含量；(E)MDA含量，UT：非转基因84K杨；H2、H8、H15：转NSHKT1基因84K杨，误差线代表三个独立实验的标准偏差(SD)；不同的小写字母分别代表每组样本之间单因素方差分析的显著性(P<0.05)，盐胁迫后，非转基因和转基因株系的SOD、CAT和PO D活性显著升高，但转基因株系的保护酶活性显著高于非转基因株系(图10A、B、C)；脯氨酸和MDA含量也明显升高，转基因株系的脯氨酸含量显著高于非转基因(图10D)，MDA含量显著低于非转基因(图10E)。

综合以上结果，超表达NSHKT1基因可以显著提高转基因84K杨的保护酶活性，增加脯氨酸含量，减少氧化胁迫对84K杨产生的损伤，在一定程度上降低盐胁迫对植物的伤害。

SEQUENCE LISTING

<110>内蒙古大学

<120>超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1879

<212> DNA

<213> Nitraria sibirica Pall

<400> 1

ccactctcag aattcaatcc aattctatct cgtcgtttct aagtcgtttc taaaataagc 60

atgaagaact tttctaattt tggtaggaaa ctggagcact tttgtaacgc ttcttctttt 120

tccatttcca aatttgtcgg ccttcaccac tccggtgttc gtttcacttt ctcatctttt 180

aatctttcat tgctacacaa actgaatcct ttctgtatac acttgctcta tttctttgct 240

gtttcattgg ctggctattt tgccttgagt gtcaccaagc ctagaaatta taacaatgat 300

attattctta catcttcttc ttcttcatca cagcttaata gctttgatat tttcttcact 360

tctgtttcgg cagcaacgga ttcgagcatg accactctgg aaatggaggt tttctccaat 420

ttccaactta ttatcatcac cattttaatg ttactcggtg gcgagctttt catatccttg 480

cttggccttc acttggagaa atccaagatc cccaaaatct ttccatcaac cacaagttca 540

atcgaccata tggagttggg tctgattatt ccagcatcaa aaatacaccc ccccataccc 600

acctccgata tacgatttaa tgacataata atcaaatcat cttcgccatc ctcaagtgac 660

gatgtactga aatacaactc tataaagtac ctatgttaca tagtgtcagt gtatctcata 720

gtggtgcaaa ttggtggctc gagtttggta tctctttaca taagccttgt cccgagtgca 780

agagacatac tgaagaacaa gaatcttcag ttgcagacat tttcagtgtt tacagtggtt 840

tcaactttct ctaattgtgg gtttgttcct acaaacgaga acatgattat tttcagggag 900

aactcagggc tgctgttgat tcttctaccg caagttttac ttgggaacac attgtaccca 960

agtttcctaa ggctgattat ctgggcctta aacgcaagct caaagagaaa agagttcgaa 1020

tacttgttaa agaattttaa ggaggcagga tatggtgact tgatgtctgg tcctcgttgc 1080

tgcatgttgg tagtaactgc agttggattc atattattac agctggtgat gttttgcttg 1140

ctggaatgga ataatttgga agccatggat ggcctgaatt cgtaccagag aatcattgct 1200

tctctatttc aagtcactaa tacaaggcat actggggaac ctgtctttga tctttcggtt 1260

ttatctccac ccattttggt gctcttcctc gttatgatgt atttgccagc gtatacttcg 1320

tttgtaccaa caagatatcg tgaaagtaat tacaaagtga aaggaaatga agagaataac 1380

aagagcatat gggaaaatct gctgttggcg ccgttggttt atcttgtctt tttcatcatt 1440

ctaatttgca ttactgagaa agataagatg aagagcgacc cactcaactt caacgttctc 1500

aacatcacct ttgaagtgat tagtgcatac gggagcgtgg gactgtcgac tgggtacagc 1560

tgcaaacgac aactgaaacc agatgcctca tgcaaaaatg tctggtacgg cttcgtgggc 1620

agatggagta acaaaggaaa attcatactc atactcgtca tgatgtttgg gagactcaag 1680

aaattcgtat ttagaggtgg taaagcctgg aaattacctt agtaccccgt ctcatccaga 1740

ttcctgcact gcagacaata gttgtgtctg actatctgta ctgtatacgt atatatatgt 1800

agtgtgaatt tgatctaact aggcgtgtgg ttcctgctgc ctatatgatc aagcagctta 1860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1879

<210>2

<211> 553

<212> PRT

<213> Nitraria sibirica Pall

<400> 2

Met Lys Asn Phe Ser Asn Phe Gly Arg Lys Leu Glu His Phe Cys Asn

1 5 10 15

Ala Ser Ser Phe Ser Ile Ser Lys Phe Val Gly Leu His His Ser Gly

20 25 30

Val Arg Phe Thr Phe Ser Ser Phe Asn Leu Ser Leu Leu His Lys Leu

35 40 45

Asn Pro Phe Cys Ile His Leu Leu Tyr Phe Phe Ala Val Ser Leu Ala

50 55 60

Gly Tyr Phe Ala Leu Ser Val Thr Lys Pro Arg Asn Tyr Asn Asn Asp

65 70 75 80

Ile Ile Leu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Leu Asn Ser Phe Asp

85 90 95

Ile Phe Phe Thr Ser Val Ser Ala Ala Thr Asp Ser Ser Met Thr Thr

100 105 110

Leu Glu Met Glu Val Phe Ser Asn Phe Gln Leu Ile Ile Ile Thr Ile

115 120 125

Leu Met Leu Leu Gly Gly Glu Leu Phe Ile Ser Leu Leu Gly Leu His

130 135 140

Leu Glu Lys Ser Lys Ile Pro Lys Ile Phe Pro Ser Thr Thr Ser Ser

145 150 155 160

Ile Asp His Met Glu Leu Gly Leu Ile Ile Pro Ala Ser Lys Ile His

165 170 175

Pro Pro Ile Pro Thr Ser Asp Ile Arg Phe Asn Asp Ile Ile Ile Lys

180 185 190

Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Asp Asp Val Leu Lys Tyr Asn Ser Ile

195 200 205

Lys Tyr Leu Cys Tyr Ile Val Ser Val Tyr Leu Ile Val Val Gln Ile

210 215 220

Gly Gly Ser Ser Leu Val Ser Leu Tyr Ile Ser Leu Val Pro Ser Ala

225 230 235 240

Arg Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asn Leu Gln Leu Gln Thr Phe Ser Val

245 250 255

Phe Thr Val Val Ser Thr Phe Ser Asn Cys Gly Phe Val Pro Thr Asn

260 265 270

Glu Asn Met Ile Ile Phe Arg Glu Asn Ser Gly Leu Leu Leu Ile Leu

275 280 285

Leu Pro Gln Val Leu Leu Gly Asn Thr Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg

290 295 300

Leu Ile Ile Trp Ala Leu Asn Ala Ser Ser Lys Arg Lys Glu Phe Glu

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Lys Glu Ala Gly Tyr Gly Asp Leu Met Ser

325 330 335

Gly Pro Arg Cys Cys Met Leu Val Val Thr Ala Val Gly Phe Ile Leu

340 345 350

Leu Gln Leu Val Met Phe Cys Leu Leu Glu Trp Asn Asn Leu Glu Ala

355 360 365

Met Asp Gly Leu Asn Ser Tyr Gln Arg Ile Ile Ala Ser Leu Phe Gln

370 375 380

Val Thr Asn Thr Arg His Thr Gly Glu Pro Val Phe Asp Leu Ser Val

385 390 395 400

Leu Ser Pro Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu Val Met Met Tyr Leu Pro

405 410 415

Ala Tyr Thr Ser Phe Val Pro Thr Arg Tyr Arg Glu Ser Asn Tyr Lys

420 425 430

Val Lys Gly Asn Glu Glu Asn Asn Lys Ser Ile Trp Glu Asn Leu Leu

435 440 445

Leu Ala Pro Leu Val Tyr Leu Val Phe Phe Ile Ile Leu Ile Cys Ile

450 455 460

Thr Glu Lys Asp Lys Met Lys Ser Asp Pro Leu Asn Phe Asn Val Leu

465 470 475 480

Asn Ile Thr Phe Glu Val Ile Ser Ala Tyr Gly Ser Val Gly Leu Ser

485 490 495

Thr Gly Tyr Ser Cys Lys Arg Gln Leu Lys Pro Asp Ala Ser Cys Lys

500 505 510

Asn Val Trp Tyr Gly Phe Val Gly Arg Trp Ser Asn Lys Gly Lys Phe

515 520 525

Ile Leu Ile Leu Val Met Met Phe Gly Arg Leu Lys Lys Phe Val Phe

530 535 540

Arg Gly Gly Lys Ala Trp Lys Leu Pro

545 550

Claims

1.蛋白质或编码所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌在如下A或C中的应用；

A、提高杨树耐碱性和/或耐氧化性；

C、培育耐碱和/或耐氧化的杨树；

所述蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列2。

2.一种制备耐碱性和/或耐氧化性提高的转基因杨树的方法，为如下1）或2）：

1）所述的方法包括如下步骤：提高目的杨树中蛋白质的含量和/或活性，得到转基因杨树；

2）所述的方法包括如下步骤：提高目的杨树中编码蛋白质的核酸分子的表达，得到转基因杨树；

所述转基因杨树的耐碱性和/或耐氧化性高于所述目的杨树；

所述蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列2。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述提高目的杨树中蛋白质的含量和/或活性，或，所述提高目的杨树中编码蛋白质的核酸分子的表达，均是将编码所述的蛋白质的核酸分子导入所述目的杨树中。