CN115725592B - 烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38、及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38、及其编码的蛋白和应用。基因NtLTPI.38的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。蛋白质NtLTPI.38的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的基因NtLTPI.38的CDS或所述的蛋白质NtLTPI.38可用于提高植物耐盐性。具体的，将本发明NtLTPI.38基因的CDS导入植物细胞，可获得耐盐能力显著提高的转基因植株。本发明的基因NtLTPI.38对烟草在耐盐性方面有积极的调控作用，对培育耐盐的烟草品种育种中具有重要意义。

Description

烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38、及其编码的蛋白 和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38、及其编码的蛋白和应用。

背景技术

盐胁迫是全球农业生产力的主要制约因素，土壤盐碱化会造成土壤易板结、透气性差、土壤渗透势大于植物渗透势引起生理干旱和大量盐离子导致植物内部离子平衡，严重影响包括烟草在内的作物品质与产量，进而影响了烟叶的生经济效益。同时，近些年根据前人统计结果可知盐碱地面积占用我国可耕地面积4.88％，因此，培育和利用耐盐烟草品种对于扩大种植面积，提高产质都具有重要意义。

近些年随着分子生物学发展，nsLTPs相关基因的克隆在植物的生物学功能等都取得了许多研究成果。研究表明，植物非特异性脂质转运蛋白与植物适应生物和非生物胁迫有关能增加植物抗病、抗冻、抗旱、耐盐性等。但是普通烟草中nsLTP基因家族的全基因组鉴定和功能分析刚刚起步。在烟草中，Xu等从普通烟NC89中筛选并克隆NtLTP4基因，在烟草中过表达该基因能够提高干旱、盐和青枯菌的耐受性(徐扬.非特异性脂转移蛋白NtLTP4作为正调控因子参与烟草对非生物和生物胁迫的响应[D].山东农业大学,2018.)。但是目前为止，在烟草中NtLTP其他成员的克隆还未见报道。综上所述，目前对烟草中nsLTPs相关基因的克隆、功能分析和应用研究尤为迫切。

发明内容

本发明提出了一个烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38、及其编码的蛋白和应用，将本发明NtLTPI.38基因导入植物细胞，可获得耐盐能力显著提高的转基因植株。

本发明提供的烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38，其CDS序列为：5’-ATGGTGAAGGTAGCATTGTTGGTAGTAATGTGCATTGCAGCAGCAACGTCTGTAATGCTAACTCCTCATGCAGATGCTGCCATCTCATGTGGGCAAGTTGTTACGAGGTTGTCACCTTGCATCAACTACGTGAGGCAAGGTGGAGCTCTTCCAGCACCATGCTGCAGTGGGATTAAGGCCCTCAACAACCAAGCTACCACCACTCCTGATCGCCAGGCGGCGTGTAACTGTATTAAATCTGCTGCTGCAAGCATCAGTGGCATCAACTTCAATCTTGCTGGTAGTCTCCCTAGCAAATGTGGTGTCAACCTTCCCTACAAGATTAGCCCTTCCATTGACTGCTCCACGACCTATTATTGGTTTTCTCCTACAATTGAGTCTCATAAGTCACGTGTCAAATAA-3’，如SEQ ID NO:1所示。

该烟草非特异性脂质转移蛋白NtLTPI.38，其氨基酸序列为：

MVKVALLVVMCIAAATSVMLTPHADAAISCGQVVTRLSPCINYVRQGGALPAPCCSGIKAL NNQATTTPDRQAACNCIKSAAASISGINFNLAGSLPSKCGVNLPYKISPSIDCSTTYYWFSPTIESHKSRVK，如SEQ IDNO:2所示。

本发明还提供上述NtLTPI.38基因或蛋白NtLTPI.38在提高植物耐盐性中的应用，具体是在植株中过表达NtLTPI.38基因的CDS。所述植物为烟草，如烟草K326品种。

制备过表达NtLTPI.38基因的CDS的烟草的步骤为：构建烟草基因NtLTPI.38的CDS的植物表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtLTPI.38-Oe(NtLTPI.38过表达)转基因纯合系即为耐盐烟草。

本发明还提供一种植物表达载体，该植物表达载体中插入有烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38的CDS。如具体的，可将烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38的CDS插入pART-CAM植物表达载体中而成的重组表达载体。

本发明的有益效果为：

(1)利用农杆菌介导的转化系统将携带有本发明NtLTPI.38的CDS的植物表达载体转化导入植物细胞，可获得耐盐性增强的转基因植株。在高盐条件下，过量表达NtLTPI.38基因的CDS的烟草与非转基因野生型烟草相比，具有较低的相对电导率、较低的Na⁺、Cl^-和较高的K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺浓度、较高的可溶性糖和蛋白含量、较强的抗氧化性，说明NtLTPI.38基因参与调控烟草对盐胁迫的适应性。

(2)本发明所提供的烟草盐相关基因NtLTPI.38的CDS，读码框长度为402bp；其编码133AA残基的蛋白；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明NtLTPI.38基因的CDS导入植物细胞，可获得耐盐能力显著提高的转基因植株。

(3)使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型的启动子或诱导性启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如可加入植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。

(4)携带有本发明NtLTPI.38的CDS的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培养成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

(5)本发明的基因NtLTPI.38对烟草在耐盐性方面有积极的调控作用，对培育耐盐的烟草品种育种中具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例的重组表达载体pART-CAM-NtLTP(即pCAMBIA-NPT-NtLTPI.38)图谱和转化农杆菌后质粒PCR鉴定电泳图。

图2是本发明农杆菌介导的pCAMBIA-NPT-NtLTPI.38载体侵染烟草K326遗传转化图；其中A为阳性对照，B为阴性对照，C为转基因叶片，D为过表达阳性鉴定，E为转基因和K326野生型烟草植株中NtLTPI.38基因的表达水平，其中1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、17表示转基因阳性株系OE1、OE2、OE3、OE4、OE5、OE6、OE7、OE9、OE10、OE11、OE12、OE13、OE14、OE15、OE17。将烟草品种K326野生型NtLTPI.38基因的表达量标准化为1。

图3是NtLTPI.38在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。

图4是本发明实施例提供的盐胁迫下野生型烟草(WT)和NtLTPI.38-Oe转基因烟草的表型特征和NtLTPI.38表达水平。

图5是本发明实施例提供的盐胁迫下野生型烟草(WT)和NtLTPI.38-Oe转基因烟草相对电导率的影响。

图6是本发明实施例提供的盐胁迫下野生型烟草(WT)和NtLTPI.38-Oe转基因烟草叶片离子浓度的影响。

图7是本发明实施例提供的盐胁迫下野生型烟草(WT)和NtLTPI.38-Oe转基因烟草可溶性糖和蛋白的影响。

图8是本发明实施例提供的盐胁迫下野生型烟草(WT)和NtLTPI.38-Oe转基因烟草抗氧化能力的影响。

图9是本发明实施例提供的盐胁迫下对WT，NtLTPI.38-Oe植物中盐相关基因表达水平的研究。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

实施例中所用K326烟草来自河南农业大学国家烟草栽培重点实验室；pART-CAM载体、pBWA(V)HS-ccdb-GLosGFP载体购自伯远生物有限公司，农杆菌GV3101感受态细胞购自擎科生物科技有限公司。

实施例1

本实施例从烟草K326克隆到NtLTPI.38基因CDS，构建NtLTPI.38基因CDS的过表达载体并对K326烟草进行遗传转化，获得NtLTPI.38过表达转基因植株，利用K326烟草野生型植株和NtLTPI.38过表达转基因植株分析了盐胁迫条件下植株表型、叶片离子浓度、叶片相对电导率、可溶性糖和蛋白和抗氧化能力，发现NtLTPI.38基因提高了植物耐盐胁迫能力。1.烟草非特异性脂转移蛋白基因NtLTPI.38的克隆

以茄科基因组数据库中(https://www.sgn.cornell.edu/)的基因NtLTP4(该基因的id＝AT5G59310.1)为模板设计目的基因克隆引物CAM-NPT-NtLTPI.38-F和CAM-NPT-NtLTPI.38-R，引物序列如表1所示。CAM-NPT-NtLTPI.38-F/R引物5′末端的18个碱基序列与载体(pART-CAM载体)末端的序列相同。

S1：烟草叶片总RNA的提取

以烟草K326幼叶为材料，按照PlantTotalDNAIsolation Kit(成都福际生物技术有限公司，中国成都)试剂盒提提供的方法提取总RNA。

S2：烟草叶总cDNA和基因组总DNA的获得

反转录使用的是HiScriptIIQ RT SuperMixforqPCR(+gDNAwiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司，中国南京)试剂盒，反转录总体系是20uL，包括12pL的RNA，4μL4×gDNAwiper Mix(4μL)，4μL 5×HiScriptIIqRT SuperMixII，反转录后产物即为总cDNA；反转录条件为：50℃15min，85℃5s。

烟草总DNA提取采用PlantTotalDNAIsolation Kit(成都福际生物技术有限公司，中国成都)试剂盒提取。

S3：烟草NtLTPI.38基因CDS的PCR扩增

按照PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)说明书的操作步骤，以步骤S2得到的的烟草叶总cDNA为模板，采用目的基因克隆引物(CAM-NPT-NtLTPI.38-F和CAM-NPT-NtLTPI.38-R)PCR扩增目的基因的CDS。PCR扩增程序设定为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min。

克隆得到的目的基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，将该目的基因命名为NtLTPI.38。该基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

表1引物信息

2.过表达载体构建

为构建NtLTPI.38基因的过表达载体，以烟草叶总cDNA为模板，使用引物CAMBIA-NPT-NtLTPI.38-F和CAMBIA-NPT-NtLTPI.38-R扩增NtLTPI.38的整个编码序列(CDS)，作为目的基因片段。接着用XbaI和XhoI双酶切过表达载体pART-CAM质粒，切胶回收载体对应条带的凝胶，然后将目的基因片段与酶切后的载体相连接，混匀后在37℃放置30min之后通过冻融法转化DH5α大肠杆菌，过夜培养之后对其进行PCR阳性鉴定，选择阳性菌液提取质粒，提取质粒后测序验证，验证序列正确，载体构建成功，构建得到的过表达载体为pART-CAM-NtLTP(即pCAMBIA-NPT-NtLTPI.38)，如图1所示。

3.NtLTPI.38过表达转基因烟草植株的构建

将检测结果为阳性的过表达载体pCAMBIA-NPT-NtLTPI.38转入农杆菌GV3101感受态细胞中，黑暗条件下培养2～3d后挑取菌液，使用引物JC-NtLTPI.38-F和JC-NtLTPI.38-R进行PCR鉴定，引物序列如表1所示。将鉴定结果为阳性的菌液进行保菌。

之后再用叶盘法转化烟草品种K326，在超净工作台无菌条件中，将K326品种烟草的叶片剪成1cm左右的小段，在农杆菌菌液中浸泡30min进行转化，转化完成后用无菌滤纸吸除叶片表面多余的菌液，然后在普通的MS培养基上黑暗条件下培养24h，再次用无菌滤纸吸除叶片表面多余的菌液，并将叶片转移到含有浓度为30mg/mL的卡那霉素(Kanamycin,kana)分化筛选培养基上继续培养，直到分化出的抗性芽长至1～2cm时剪下，将其转移到含有相同浓度的卡那霉素生根培养基中继续培养，如图2A、2B和2C。

生根培养后共获得了16株成活的转基因烟草株系，选择成功生根并生长发育良好的转基因株系和烟草品种K326野生型株系提取DNA，利用引物JC-NtLTPI.38-F和JC-NtLTPI.38-R，进行PCR阳性鉴定。

结果发现，在部分转基因烟草株系中检测到与目的基因(NtLTPI.38基因)大小相同的条带片段，如图2D所示，表明目的基因成功插入到烟草品种K326的基因组中。然后提取了每个阳性植株的RNA，qRT-PCR检测每个株系中NtLTPI.38基因的相对表达量，检测引物为NtLTPI.38-F和NtLTPI.38-R，内参基因引物为L25-F和L25-R，引物序列如表1所示，选择表达量较高的OE3和OE17株系用于后续实验，如图2E。

4.NtLTPI.38蛋白的亚细胞定位

首先以烟草叶总cDNA为模板，使用特异性引物CAMBIA-NPT-NtLTPI.38-F和CAMBIA-NPT-NtLTPI.38-R，扩增烟草品种K326中NtLTPI.38的整个编码序列(CDS)，作为目的基因片段。通过瞬时转化的方法将PCR扩增之后的产物与pBWA(V)HS-ccdb-GLosGFP载体的N末端连接，产生与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因融合的pBWA(V)HS-NtLTPI.38-GFP载体。最后将经过测序确认后的阳性载体质粒通过电转化的方法转入农杆菌GV3101中，注入生长30d大小的烟草品种K326叶片的下表皮，同时，将与之相对应的GFP-CK空载体(pBWA(V)HS-ccdb-GLosGFP载体)作为对照。在弱光下培养2d后，用激光共聚焦显微镜观察荧光的定位信号并拍照。

结果显示，NtLTPI.38蛋白定位于烟草叶片的细胞膜上，如图3所示。

5.NtLTPI.38基因在烟草耐盐性方面的作用

上述对NtLTPI.38基因的研究发现，盐胁迫可以诱导NtLTPI.38基因的表达，因此，在此基础上研究了NtLTPI.38基因在烟草耐盐性方面的作用。验证过表达NtLTPI.38烟草株系在高盐条件下的耐受性。

5.1培养基培养

将野生型烟草(WT)种子和NtLTPI.38-Oe(OE3和OE17)转基因烟草种子(T2代)消毒，然后将种子点在MS培养基中，长至7d苗龄时，选取大小一致的幼苗将其部分移至MS培养基中作为对照(CK)，另一部分移至含有0.2mM NaCl的MS培养基中作为高盐处理，观察其幼苗根部发育情况。

5.2漂浮育苗

另外，将野生型烟草(WT)种子和NtLTPI.38-Oe转基因烟草种子(T2代)消毒，采用漂浮育苗法进行育苗，6片真叶时，选取长势一致的烟草植株转移至6孔水培盒中进行高盐处理。其中，对照组给予未添加NaCl的蒸馏水使其正常生长，实验组给予200mmol L^-1的NaCl溶液，连续高盐2d。

对野生型烟草和转基因植株进行以下特征观察和测定，其中幼苗根长观察使用培养基培养出的幼苗进行观察，其他均采用漂浮育苗的植株进行。

(1)表型特征观察

高盐处理后烟草植株的叶片出现不同程度的萎蔫，其中，野生型烟草(WT)植株叶片萎蔫程度较为严重，过表达株系长势较好。如图4A所示。

(2)幼苗根长观察

高盐处理后烟草幼苗的根长生长速度出现不同程度的减弱，其中，野生型烟草(WT)植株根长生长速度减弱程度较为严重，过表达株系幼苗根长生长状态较好。如图4B、4C所示。

(3)NtLTPI.38的表达水平测定

用qRT-PCR法测定NtLTPI.38的表达水平，检测引物为NtLTPI.38-F和NtLTPI.38-R，内参基因引物为L25-F和L25-R。结果显示在盐处理条件下NtLTPI.38-Oe转基因植株的NtLTPI.38基因的相对表达量显著高于野生株系，如图4D所示。

(4)相对电导率(REC)测定

盐处理2d之后，取烟草植株从上往下数第3片叶测量叶片的相对含水量(REC)。结果发现，在正常生长条件下，转基因烟草植株和野生型植株的REC没有显著差异，而在干旱处理后，过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片REC显著低于野生型。说明，盐处理下，与野生型相比，过表达NtLTPI.38基因的烟草植株可以减少膜损伤程度，维持细胞内外离子稳态从而来维持烟草的正常生长，从而提高其在盐胁迫下的适应能力，如图5所示。

(5)烟草植株叶片的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cl^-的离子浓度测定

检测发现，在盐处理之后，野生型和过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片中Na⁺和Cl^-含量均呈现出上升的趋势，但过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片中Na⁺和Cl^-含量显著低于野生型株系；而在盐处理之后，野生型和过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片中K⁺含量呈现出下降的趋势，但过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片中K⁺含量显著高于野生型株系；在盐处理之后，过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片中Ca²⁺和Mg²⁺含量均显著高于野生株系。

结果表明，在盐胁迫下，过表达NtLTPI.38基因的烟草株系可以通过增加对K⁺、Ca²⁺和Mg²⁺的摄入减轻盐胁迫下造成的细胞内Na⁺和Cl^-引起的毒害，维护烟草叶片内部的离子平衡，从而维持烟草正常的生长发育，增强对盐胁迫的适应能力，如图6所示。

(6)烟草植株的可溶性糖和蛋白含量测定

检测发现，在盐处理之后，野生型和过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片中可溶性糖和蛋白含量均呈现出上升的趋势，但过表达NtLTPI.38基因的烟草叶片中可溶性糖和蛋白含量显著高于野生型株系。

结果表明，与野生型相比，过表达NtLTPI.38基因的烟草植株可以增加可溶性糖和蛋白的合成，从而提高了烟草在盐胁迫下渗透保护剂的水平来平衡渗透压，维持了烟草在盐胁迫下的正常生长发育，增强对盐胁迫的适应能力。如图7所示。

(7)ROS含量、MDA含量和SOD酶活测定

检测发现，在受到盐胁迫时，烟草植株体内的ROS含量增加，但转基因株系H₂O₂和O^2-含量都显著低于野生型株系。在盐胁迫下，野生型和转基因株系的MDA含量均显著上升，但过表达NtLTPI.38基因的烟草MDA含量显著低于野生型株系；在盐处理之后，SOD酶活性显著升高，且转基因株系酶活性显著高于野生型株系。

以上结果表明，在盐处理下，与野生型株系相比，过表达NtLTPI.38基因可以提高烟草植株抗氧化能力，从而提高烟草对盐胁迫的抵抗能力。如图8所示。

(8)NtHKT1、NtNHX2、NtAKT1基因的表达水平测定

HKT1基因是将地上部积累的Na⁺随韧皮部转运回地下根部的基因，能够调控Na⁺清除；NHX2基因是位于液泡质膜上的钠氢离子反向转运蛋白，使Na⁺在液泡内的区室化，提高盐胁迫下Na⁺累计的耐受性；AKT1基因是一种K⁺转运蛋白，具有促进K⁺吸收和转运的功能，正向调控盐胁迫下耐受性。

本实施例通过qRT-PCR测定NtHKT1、NtNHX2、NtAKT1基因的表达水平，检测NtHKT1、NtNHX2、NtAKT1基因所用引物对分别为NtHKT1-F/R、NtNHX2-F/R、NtAKT1-F/R，内参基因引物对为L25-F/R，如表1所示。结果发现，在盐胁迫下，过表达NtLTPI.38基因可以通过提高NtHKT1、NtNHX2、NtAKT1基因的表达，从而调控其相关的代谢途径提高烟草对盐胁迫的抵抗能力。如图9所示。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (7)

1.烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38，其特征在于，该基因的CDS序列如SEQID NO:1所示。

2.权利要求1所述的烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述的基因NtLTPI.38或权利要求2所述的蛋白质在提高植物耐盐性中的应用，其特征在于，所述植物为烟草。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在植株中过表达NtLTPI.38基因的CDS以提高植物耐盐性。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，制备过表达NtLTPI.38基因的CDS的烟草的步骤为：构建烟草基因NtLTPI.38的CDS的植物表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtLTPI.38过表达转基因纯合系，即为耐盐烟草。

6.一种植物表达载体，其特征在于，该植物表达载体中插入有烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38的CDS，该基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求6所述的植物表达载体，其特征在于，将烟草非特异性脂质转移蛋白基因NtLTPI.38的CDS插入pART-CAM植物表达载体中制备得到重组表达载体。