CN107384935B

CN107384935B - 一种冰缘植物蛋白及其编码序列与应用

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Publication number: CN107384935B
Application number: CN201610321604.5A
Authority: CN
Inventors: 岳修乐; 安黎哲; 岳金丽
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: CN107384935A

Abstract

本发明提供了一种冰缘植物冷诱导蛋白CbABF1，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种编码该冰缘植物冷诱导蛋白的基因CbABF1，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的冰缘植物冷诱导蛋白的编码基因可用于转化植物以产生具有抗寒特性的转基因植物。

Description

一种冰缘植物蛋白及其编码序列与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种冰缘植物冷诱导蛋白及其编码序列在提高烟草抗寒性中的应用。

背景技术

低温是影响植物地理分布和生长季节的最主要的环境因素之一，低温冻害严重地影响着农作物的生长状况和产量(Thomashow 1999)。大量的研究表明，冷响应基因的表达对植物的抗冻有着至关重要的作用(Gong et al.2002；Hsieh et al.2002；Knight etal.1999；Thomashow 1999；Tahtiharju and Palva 2001)。冷响应基因编码种类繁多的蛋白，如植物呼吸、碳循环、脂类、苯丙素和抗氧化代谢过程相关的酶，还有调控基因表达的转录因子，抗冻蛋白等(Guy 1990；Thomashow 1999；Mohapatra et al.1989)。

高山离子芥(Chorispora bungeana)是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，该地区海拔3600～3900m。年平均气温在-5～-7℃之间，6～8月平均气温为3.6℃，气温日差较大，是一种伴随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡，流石碓中砾石保水性差，时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、强紫外、大风和生理干旱，适应这些不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。

本发明公开了一种冰缘植物冷诱导基因CbABF1，该基因编码冰缘植物高山离子芥(Chorispora bungeana，又名Chorispora exscapa)一个新的受低温诱导而产生的蛋白CbABF1。该基因编码的蛋白与双子叶植物拟南芥、芜菁、琴叶拟南芥、山嵛菜、橹豆等具有较近的亲缘关系，其中与拟南芥ABF1蛋白的同源性为71％，其次是山嵛菜(70％)和琴叶拟南芥(64％)。在拟南芥、水稻以及大豆中，ABF1能被ABA和低温、高温、干旱所诱导表达，通过正调控ABA响应基因，进一步调节植物的萌发，气孔活动以及植物非生物胁迫下的耐受性(Maruyama et al,2010)，但是已知ABF1基因还无法确定是否可以用于制备具有抗寒特性的转基因植株。本发明公开的冰缘植物冷诱导CbABF1基因可应用到抗寒转基因作物育种中以提高其抗寒性，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种冰缘植物冷诱导基因CbABF1。

本发明的另一个目的在于提供一种培育抗寒转基因植物的方法，是将所述的编码基因转入植物中，得到具有抗寒特性的转基因植物。

本发明的又一个目的在于提供一种由所述冷诱导基因CbABF1用于转化植物以产生转基因植物的用途。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明克隆了高山离子芥的冷响应基因CbABF1，所述冷诱导基因CbABF1具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：1由1179个碱基组成。该冷诱导基因CbABF1的编码基因能够编码CbABF1蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：2由393个氨基酸组成。

本发明中CbABF1基因编码的蛋白与双子叶植物拟南芥、芜菁、琴叶拟南芥、山嵛菜、橹豆等具有较近的亲缘关系，其中与拟南芥ABF1的同源性最高为71％，其次是山嵛菜(70％)和琴叶拟南芥(64％)。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有CbABF1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与植物抗寒相关蛋白编码基因CbABF1的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电击、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥等双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的抗寒的转基因植物的方法，是将上述与植物冷诱导相关蛋白的编码基因CbABF1导入植物中，得到抗寒转基因植物。

本发明将CbABF1基因的cDNA构建在CaMV35s启动子下游，得到表达载体(其图谱如图2所示)，利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用叶盘法转染野生型烟草得到过表达的转基因植株。所述植物可为双子叶植物，如拟南芥。

本发明验证了转基因植株具有抗寒特性，结果显示(图4)，CbABF1的过表达可以显著增强烟草的抗寒特性，使低温处理之后的存活率提高了50％左右。这对于培养优良的作物品种特别是抗寒作物品种具有重要的理论及实践意义。

附图说明

图1高山离子芥CbABF1蛋白的氨基酸序列在NCBI同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。

图2构建的过表达载体图谱，PMDC32-CbABF1。

图3-4℃低温处理12小时前后，野生型(WT)和转基因植株(OE-CbABF1)表型差异。

图4-4℃低温处理12小时后，野生型(WT)和转基因烟草(OE-CbABF1)存活率统计。

具体实施方式

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chrispora bungeana)(西部地区特色植物种质资源库平台)和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)(美国种质资源信息网GRIN)，农杆菌GV3101(普如汀生物技术有限公司),质粒PMDC32(美国拟南芥生物资源中心)

实施例1

高山离子芥冷诱导蛋白编码基因CbABF1序列的克隆：

利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)分离高山离子芥再生苗总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥再生苗100mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1mlTrizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5ml的离心管中；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min；4℃，12000g离心15min；上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，4℃，12000g离心10min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

根据快速末端扩增技术(RACE)获取该基因全长序列，然后利用生物信息学技术，设计以下引物：

5’端引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGTACTCAAATCGACTTCAA，(其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB1序列)；

3’端引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACCAAGGACCCGTAA GCGTTC，(其中划线序列Invitrogen Gateway系统attB2序列)。

通过RT-PCR扩增得到CbABF1的cDNA序列，具体方法是：依据Plant RT-PCRKit2.01(TaKaRa,Japan)的用户手册进行。1-2μg总RNA(大约1-2μl)和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl₂ 4μl；10×RNA PCR Buffer 2μl；RNase Inhibitor 0.5μl；RNase freeWater8.5μl；dNTP Mixture 2μl；Reverse Transcriptase 1μl；Oligo dT-Adaptor 1μl)。混匀后，42℃ 30min；99℃ 5min；5℃ 5min，完成反转录反应。吸取2μl反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃ 2min后进入扩增程序：94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 50s,30个循环后，72℃ 5min。扩增得到的序列总长1243个碱基，包含attB1序列31个碱基，attB2序列30个碱基，终止密码子3个碱基，序列为taa；CbABF1的序列总长为1179个碱基，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，编码393个氨基酸,根据the 1997 IUPAC standard atomic weights,assuming pH＝7.0计算分子量为43.427kD,根据ExPASy's Compute pI/Mw program计算等电点为6.244。

实施例2

转CbABF1基因植株的获得及抗寒特性的测定

高山离子芥CbABF1基因植物过表达载体的构建：利用Invitrogen公司Gateway技术将测序验证过的实施例1得到的片段通过BP反应(BP

II Enzyme mix，Invitrogen No.11789020)重组到pDONR/Zeocin载体(Invitrogen No.12535-035)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经20mg/L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过Gateway技术中的LR反应(LR

II Enzyme mix，Invitrogen No.11791100)将CbABF1基因重组到PMDC32载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体PMDC32-CbABF1(如图3)。

农杆菌介导的转化：将构建好的过表达质粒通过电击的方式(电压2400V，电容25μF，阻抗200Ω，电击杯1mm)转化农杆菌GV3101，用10mg/L利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到YEP液体培养基中(含抗生素：链霉素25mg/L、利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L)于恒温摇床上28℃，180rpm摇培至OD₆₀₀＝0.6-0.8，离心后用1/2MS培养基稀释至OD₆₀₀＝0.2-0.4，将培养4周左右的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)无菌苗叶片在超净台内用打孔器打出直径1cm左右的叶盘，放入上述菌液中侵染20-30min，取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，平铺于1/2MS固体培养基上，25℃暗培养2-3天，之后将叶片转移到筛选培养基(1/2MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+50mg/L潮霉素+500mg/L羧苄青霉素)，25℃，16小时光照、8小时黑暗，培养一个月左右。待成功诱导出烟草愈伤组织后，将其转入至分化培养基(1/2MS+50mg/L潮霉素+500mg/L羧苄青霉素)，1-2月后可形成转基因烟草植株。

转基因株系的筛选：将转基因烟草收获的种子，经表面消毒后，种在含有50mg/L潮霉素的MS平板上进一步筛选，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的CbABF1过表达的烟草T2代株系(OE-CbABF1)。

转基因CbABF1烟草株系的抗寒性测定：将萌发4周左右的转基因烟草和非转基因烟草同时置于-4℃的低温培养箱，处理12小时，然后置于4℃培养箱恢复12小时，之后放回正常生长的培养箱，7天之后统计存活率。结果显示CbABF1的过表达可以显著增强烟草的抗寒性，使低温处理之后的存活率提高了50％左右。

本发明公开的一种冰缘植物冷诱导基因CbABF1，可应用到抗寒转基因作物育种中，得到具有抗寒特性的转基因植株。

Claims

1.一种冰缘植物冷诱导基因CbABF1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的基因在抗寒转基因植物育种中的用途。

3.如权利要求2所述的基因在抗寒转基因植物育种中的用途，其特征在于，所述植物为烟草。

4.含有权利要求1所述基因的表达载体。

5.含有权利要求1所述基因的宿主菌。

6.一种培育抗寒转基因植物的方法，是将权利要求1所述的编码基因转入植物中，得到抗寒转基因植株。

7.如权利要求6所述培育抗寒转基因植物的方法，其特征在于，所述植物为烟草。

8.一种由权利要求1所述的基因CbABF1编码的蛋白质CbABF1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。