CN108018291B - 一种冰缘植物抗冻基因及其用于制备抗冻转基因植物应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高山离子芥抗冻基因CbDREB2AL、其编码产物CbDREB2AL蛋白、含有抗冻基因CbDREB2AL的植物的制备方法及其在制备抗冻转基因植物中的应用。本发明公开的CbDREB2AL基因可应用到转基因作物育种中以提高其抗冻性，具有广阔的应用前景。

Description

一种冰缘植物抗冻基因及其用于制备抗冻转基因植物应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高山离子芥抗冻基因CbDREB2AL、其编码产物CbDREB2AL蛋白、含有抗冻基因CbDREB2AL的植物的制备方法及其在制备抗冻转基因植物中的应用。
背景技术
低温是影响植物地理分布和生长季节的最主要的环境因素之一，低温冻害严重地影响着农作物的生长状况和产量，大量的研究表明，冷响应基因的表达对植物的抗冻有着至关重要的作用。冷响应基因编码种类繁多的蛋白，如植物呼吸、碳循环、脂类、苯丙素和抗氧化代谢过程相关的酶，还有调控基因表达的转录因子，抗冻蛋白等[1-3]。
高山离子芥(Chorispora bungeana，又名Chorispora exscapa)是十字花科离子芥属多年生草本植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上，该地区的环境特点是气候寒冷、干旱、强辐射。恶劣环境时常造成高山离子芥低温胁迫。高山离子芥为了适应低温、强紫外、大风和干旱等不利的环境条件，进化出了优秀的逆境适应机制[4]。
本发明公开了一种冷响应基因CbDREB2AL，该基因编码高山离子芥一个新的受低温诱导而产生的蛋白CbDREB2AL。该基因编码的蛋白与山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)的同源基因有较近的亲缘关系。本发明公开的CbDREB2AL基因可应用到转基因作物育种中以提高其抗冻性，具有广阔的应用前景。
1.Chinnusamy,V.,J.K.Zhu,andR.Sunkar,Gene regulation during coldstressacclimation inplants.Methods inmolecularbiology,2010.639:p.39-55.
2.Yadav,S.K.,Cold stress tolerance mechanisms in plants.Areview.Agron.Sustain.Dev.,2010.30(3):p.515-527.
3.Thomashow,M.F.,PLANTCOLDACCLIMATION:Freezing Tolerance Genes andRegulatoryMechanisms.AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,1999.50(1):p.571-599.
4.Zhao,Z.,et al.,Deep-sequencing transcriptome analysis ofchillingtolerance mechanisms ofa subnival alpineplant,Chorisporabungeana.BMCPlantBiology,2012.12(1):p.222.
发明内容
本发明的目的是提供一种抗冻基因CbDREB2AL及其编码蛋白。
本发明的另一个目的在于提供一种培育抗冻转基因植物的方法，是将所述的编码基因转入植物中，得到具有抗冻特性的转基因植物。
本发明的又一个目的在于提供一种由所述抗冻基因CbDREB2AL用于转化植物以产生抗冻转基因植物的用途。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明克隆了高山离子芥的抗冻基因CbDREB2AL，所述抗冻基因CbDREB2AL具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：1由1002个碱基组成。该抗冻基因CbDREB2AL能够编码CbDREB2AL蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：2由334个氨基酸组成。
本发明中CbDREB2AL基因编码的蛋白与双子叶植物山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)等的同源基因具有较近的亲缘关系。
可用现有的植物表达载体构建含有CbDREB2AL基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。携带有本发明基因CbDREB2AL的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥、烟草等双子叶植物。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除芳剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明所提供的获得抗冻的转基因植物的方法，是将上述植物抗冻蛋白的编码基因CbDREB2AL导入植物中，得到抗冻转基因植物。
本发明将CbDREB2AL基因的cDNA构建在CaMV35s启动子下游，得到表达载体(其图谱如图2所示)，利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用浸花法转染野生型拟南芥得到过表达的转基因植株。所述植物可为双子叶植物，如烟草、拟南芥等。
本发明通过对比试验验证了含有CbDREB2AL基因的转基因植株具有抗冻特性，图3和图4中的结果显示，CbDREB2AL的过表达可以显著增强拟南芥的抗冻特性，使低温处理之后的拟南芥的存活率提高了20％左右。这对于培养优良的作物品种特别是抗冻作物品种具有重要的理论及实践意义。
附图说明
图1高山离子芥CbDREB2AL蛋白的氨基酸序列经同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。
图2构建的过表达载体图谱，PMDC32-CbDREB2AL。
图3对照(野生型WT为Col-0)和转基因植株(#2，#3)抗冻性表型比较。
图4对照(野生型WT为Col-0)和转基因植株(#2，#3)低温处理后的存活率比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chorisporabungeana，又名Chorispora exscapa)(西部地区特色植物种质资源库平台)和拟南芥Col-0(Arabidopsis thaliana，Col-0)(美国拟南芥生物资源中心)，农杆菌GV3101(普如汀生物技术有限公司),质粒PMDC32(美国拟南芥生物资源中心)。
实施例1高山离子芥抗冻蛋白编码基因CbDREB2AL序列的克隆：
利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)分离高山离子芥再生苗总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥再生苗100mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1mlTrizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5ml的离心管中；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min；4℃，12000g离心15min；上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，4℃，12000g离心10min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。
根据快速末端扩增技术(RACE)获取该基因全长序列，然后设计以下引物进行编码区的克隆：
5’端引物：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAGTATACGATCAGAGTGGAG，(其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB1序列)；
3’端引物：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTCTCCAGATCCAAGAAACTCAAG，(其中划线序列Invitrogen Gateway系统attB2序列)。
通过RT-PCR扩增得到CbDREB2AL的cDNA序列，具体方法是：依据PrimeScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,No.6210A)的手册进行:4μl总RNA(约3μg)和试剂盒中的部分试剂混合(Oligo dT Primer 1μl,dNTPMixture 1μl,RNase free Water 4μl)，65℃处理5min之后立刻冰上冷却，继续加入试剂混合(5×PrimeScript II Buffer 4μl，RNase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript II RTase 1μl，RNase free Water 4.5μl)，混匀后，42℃处理60min；95℃处理5min，完成反转录反应。
吸取2μl上述反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃处理2min后进入扩增程序：94℃30s、56℃ 30s、72℃ 60s,30个循环后，72℃5min。扩增得到的SEQ ID NO：1序列总长1002个碱基，编码334个氨基酸,根据the 1997IUPAC standard atomic weights,assumingpH＝7.0计算分子量为37.294kDa,根据ExPASy's Compute pI/Mw program计算等电点为4.954。
本发明中CbDREB2AL基因编码的蛋白与双子叶植物与山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)的同源基因有较近的亲缘关系，如图1所示。
实施例2转CbDREB2AL基因植株的获得及抗冻特性的测定
1.高山离子芥CbDREB2AL基因植物过表达载体的构建：利用Invitrogen公司Gateway技术将测序验证过的实施例1得到的片段通过BP反应(BP II Enzymemix，Invitrogen No.11789020)重组到pDONR/Zeocin载体(Invitrogen No.12535-035)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经20mg/L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过Gateway技术中的LR反应(LR II Enzyme mix，Invitrogen No.11791100)将CbDREB2AL基因重组到PMDC32载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体PMDC32-CbDREB2AL(如图2)。
2.农杆菌介导的转化：将构建成功的过表达质粒PMDC32-CbDREB2AL通过电击的方式(电压2400V，电容25μF，阻抗200Ω，电击杯1mm)转化农杆菌GV3101，用10mg/L利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到YEP液体培养基中(含抗生素：链霉素25mg/L、利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L)于恒温摇床上28℃，180rpm摇床培养至OD600＝0.6-0.8，离心后用侵染培养基(1/2MS，5％sucrose，0.01％silwet L-77，pH5.7)重悬OD600＝0.8-1。将拟南芥Col-0倒置使花苞浸没在侵染培养基溶液里30-60秒，用保鲜膜将侵染之后的拟南芥地上部分包裹，黑暗培养两天之后去掉保鲜膜，并用清水轻柔冲洗侵染部分，正常条件(25℃，16小时光照、8小时黑暗)继续培养直至收获种子。
3.转基因株系的筛选：将转基因拟南芥收获的种子，经表面消毒后，种在含有50mg/L潮霉素的MS平板上进一步筛选，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的CbDREB2AL过表达的拟南芥T2代转基因株系。
4.转基因CbDREB2AL拟南芥株系的抗冻性测定：将萌发4周的转基因拟南芥和野生型拟南芥放入低温培养箱，梯度降温，每小时降2℃，降至-8℃开始计时，处理6小时，4℃恢复2天后正常培养，统计存活率。结果显示CbDREB2AL的过表达可以显著增强拟南芥的抗冻性，如图3所示，使低温处理之后的拟南芥的存活率提高了20％左右，如图4所示。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一种冰缘植物抗冻基因及其用于制备抗冻转基因植物应用
<141> 2017-12-29
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1002
<212> DNA
<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)
<400> 1
atggcagtat acgatcagag tggagaagtc aatagaaccc aactcgatac atcgaggaaa 60
aggaaatcta gaagtagagg tgatggtaca acagtggcag agaggttaaa gagatggaaa 120
gagtacaatg cgactgtaga agaagcatca gccacaaaga aaaggaaagt acctgcaaaa 180
gggtctaaga aaggttgtat gaaaggcaaa ggaggaccag agaatggtcg ttgtagtttc 240
agaggagtta gacaaaggat ttggggtaaa tgggttgctg agattagaga gcctaataga 300
ggaagtagac tttggctcgg cactttccca acagctgaag cagctgcctc tgcttatgat 360
gaggctgcta aagccatgta tggtcctttg gctcgtctta atttccctca atccgctgct 420
tctgatgtca cgagtacttc tagtcagtct gaggtgtgta cggctgagac ttatcctggt 480
ggtggtgttc atgtgaaaac agaggatgca gattgcgaat ccaaaccatc tgttatgtat 540
catcaggaga acggtgtaaa tgctgaagag acgatgaagg atgttaagaa agatgattgg 600
ctgagcgagt tcgagcagaa gtattggagt ggagttgtga aggagaaaga gaaacagaag 660
aaggagattg atgaaacttg tcatcagcaa caacagcaac aacaacaaca acaagagcaa 720
gtagattcgc tttctgtttc ggattacggt tggccttgtg atgtggatca ggctcaatgg 780
gactcgtctg agatgtttga tgttaatgag cttctaggag acatcaatgg cgacattttc 840
acaggtttga accaggatca atactcaggg aacaatgttg gattatccga ggcagagaag 900
cagcaaagcg ggtactatgc tctagactct ggttatggat tgcctccact tcaaatcgaa 960
gcgccggatg gtttcgactt gagtttcttg gatctggaga ag 1002
<210> 2
<211> 334
<212> PRT
<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)
<400> 2
Met Ala Val Tyr Asp Gln Ser Gly Glu Val Asn Arg Thr Gln Leu Asp
1 5 10 15
Thr Ser Arg Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val
20 25 30
Ala Glu Arg Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Ala Thr Val Glu Glu
35 40 45
Ala Ser Ala Thr Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys
50 55 60
Gly Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Gly Arg Cys Ser Phe
65 70 75 80
Arg Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg
85 90 95
Glu Pro Asn Arg Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala
100 105 110
Glu Ala Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly
115 120 125
Pro Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Ala Ala Ser Asp Val Thr
130 135 140
Ser Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Ala Glu Thr Tyr Pro Gly
145 150 155 160
Gly Gly Val His Val Lys Thr Glu Asp Ala Asp Cys Glu Ser Lys Pro
165 170 175
Ser Val Met Tyr His Gln Glu Asn Gly Val Asn Ala Glu Glu Thr Met
180 185 190
Lys Asp Val Lys Lys Asp Asp Trp Leu Ser Glu Phe Glu Gln Lys Tyr
195 200 205
Trp Ser Gly Val Val Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Lys Glu Ile Asp
210 215 220
Glu Thr Cys His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln
225 230 235 240
Val Asp Ser Leu Ser Val Ser Asp Tyr Gly Trp Pro Cys Asp Val Asp
245 250 255
Gln Ala Gln Trp Asp Ser Ser Glu Met Phe Asp Val Asn Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Asp Ile Asn Gly Asp Ile Phe Thr Gly Leu Asn Gln Asp Gln Tyr
275 280 285
Ser Gly Asn Asn Val Gly Leu Ser Glu Ala Glu Lys Gln Gln Ser Gly
290 295 300
Tyr Tyr Ala Leu Asp Ser Gly Tyr Gly Leu Pro Pro Leu Gln Ile Glu
305 310 315 320
Ala Pro Asp Gly Phe Asp Leu Ser Phe Leu Asp Leu Glu Lys
325 330

Claims (7)

1.一种高山离子芥抗冻基因CbDREB2AL，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种由权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL编码的蛋白质CbDREB2AL，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL的表达载体。
4.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL的细胞系。
5.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL的宿主菌。
6.一种如权利要求1所述抗冻基因CbDREB2AL用于转化双子叶植物以产生抗冻转基因双子叶植物的用途。
7.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL的植物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)表达载体的构建；(2)农杆菌介导的转化；(3)转基因株系的筛选。
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