CN110117597B

CN110117597B - 一种苹果4-香豆酸：辅酶a连接酶4基因及其编码蛋白和应用

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Publication number: CN110117597B
Application number: CN201910371292.2A
Authority: CN
Inventors: 王海波; 何平; 常源升; 王森; 王传增; 何晓文; 徐丽; 李林光
Original assignee: Shandong Institute of Pomology
Current assignee: Shandong Institute of Pomology
Priority date: 2019-05-06
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2039-05-06
Also published as: CN110117597A; NL2025428B1; NL2025428A

Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种苹果4‑香豆酸：辅酶A连接酶基因Md4CL4及其编码蛋白和应用。该基因为从苹果中克隆得到的4CL基因Md4CL4。本发明为首次从苹果中克隆制备，为植物分子育种提供基因资源。利用转基因技术，将Md4CL4基因的超表达载体转入烟草中，获得转基因烟草。本发明在苹果中首次发现了Md4CL4基因高响应盐胁迫，获得了一种从苹果中分离克隆出的促进盐胁迫耐受性的基因的完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用Md4CL4基因在烟草中超量表达之后的转基因材料耐盐性明显提高。利用该基因有助于培育高耐盐的植物新品种。

Description

一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶4基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶基因Md4CL4及其编码蛋白和应用。

背景技术

全球气候变化导致的严重干旱和人类不合理的耕作，造成土壤次生盐渍化问题日益凸显，盐渍化土壤占世界陆地面积的7.6%，而我国盐渍化土壤面积0.27亿公顷，占总耕地面积的28.1%。土壤盐渍化已经成为制约农业发展的重要限制因子。苹果（Malus domestica）是全球最具经济重要性的园艺作物之一，也是栽培区域最为广泛的果树树种之一。由于苹果属（Malus）植物地理起源不一，导致品种类型变异丰富，目前已鉴定到包括栽培苹果在内的类型大约14个。丰富的种质多样性也使苹果的各类表型存在较大的差异，如小金海棠（M. xiaojinensis Chen et Jian.）、珠美海棠（M. mandshurica XM, seboldiiRehd.）、毛山定子（M. mandshurica (Maxim.) Kom.）等种的耐盐性强，而楸子（M. prunifolia（Willd）Borkh.）、新疆野苹果（M. sieversii（Ledeb.）Roem.）和西府海棠（M. micromalus Hemsl.）等种的耐旱性较强。在苹果栽培品种中，不同品种之间对逆境的抗性也表现出显著的差异性，对此已开展了较多研究。如世界范围主栽的苹果品种‘金冠’、我国西北旱区主栽的‘秦冠’等，抗旱性突出，对土壤有限水资源的利用效率高，而且对盐渍化土壤具有较强的耐受能力。充分发掘蕴藏在这些特异品种中的优异抗逆基因并开展应用，对于提升苹果的抗逆性，拓宽栽培区域，促进生产发展具有重要意义。盐胁迫是影响植物生长发育的主要限制因素之一，为适应盐胁迫，植物在分子水平上进化形成了相应的机制，即通过逆境诱导的胁迫相关基因的表达，调控植物的生理生化活动来抵御逆境。

在高等植物中，4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）是一类重要的酶，通过将4-香豆酸和其它肉桂酸酯衍生物转化为相应的辅酶A硫醇酯，催化苯丙烷类代谢途径的最后一步反应，是苯丙烷类合成途径的关键限速酶。通过苯丙烷类代谢途径合成木质素、类黄酮类等次生化合物，在植物生理、生态及生长发育等方面发挥着极其重要的作用。其中木质素是植物细胞次生壁的主要成分之一，广泛存在于维管植物的木质组织中，与纤维素和半纤维素紧密黏合形成交织网来硬化细胞壁，在植物生长发育中起着重要的作用；类黄酮类物质参与植物病虫害防御、紫外线保护、生长素的运输、根系发育及向重性、种子和花粉的萌发、共生微生物的信号传递和植物的相生相克等生理过程。现有技术中，尚未有4CL编码基因在耐盐性调控中的应用。

充分利用特异基因开展基因工程改良植物抗性、提高植物品种选育效率日益受到重视，其中关键基因的挖掘和功能研究是前提。

发明内容

为解决植物抗逆遗传改良的技术问题，本发明提供了一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶基因Md4CL4，

本发明还提供了一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶基因Md4CL4编码蛋白和应用，以达到为植物分子育种提供基因资源的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶基因，该基因为从苹果中克隆得到的4CL基因Md4CL4，cDNA序列为SEQ ID NO.1。

上述Md4CL4基因分子量为65.59 kDa，等电点为5.5。

本发明还提供了一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶基因的编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明首次发现了苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶基因Md4CL4提高植物耐盐性的应用。

进一步的，具体包括以下步骤：

（1）响应盐胁迫Md4CL的分析：采用“Trizol法”提取盐胁迫处理的‘金冠’（Malus domestica cv. 'Golden Delicious'）叶片总RNA，以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR反转录，合成cDNA第一链；设计Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4的四对特异引物序列，qPCRMd4CL1-F和qPCR4CL1-R、qPCRMd4CL2-F和qPCR4CL2-R、qPCRMd4CL3-F和qPCR4CL3-R、qPCRMd4CL4-F和qPCR4CL4-R，分析盐胁迫下Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4相对表达水平，筛选显著受盐胁迫诱导的Md4CL4基因；

（2）苹果Md4CL4基因的克隆：设计一对引物序列Md4CL4-F和Md4CL4-R，以反转录cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得Md4CL4全长cDNA序列；

（3）苹果Md4CL4基因提高植物耐盐性的应用：设计一对含有BamHI和SalI酶切位点的引物pBI121-Md4CL4-F和pBI121-Md4CL4-R，利用PCR扩增目的基因Md4CL4的编码区，构建表达载体pBI121-Md4CL4，转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacien）EHA105，叶盘转化法转化烟草（Nicotiana tabacum）‘NC89’，获得阳性转基因烟草后代。

进一步的，步骤（1）中，所述引物序列qPCRMd4CL1-F和qPCR4CL1-R、qPCRMd4CL2-F和qPCR4CL2-R、qPCRMd4CL3-F和qPCR4CL3-R、qPCRMd4CL4-F和qPCR4CL4-R如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示。

进一步的，步骤（2）中，所述引物序列Md4CL4-F和Md4CL4-R如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示。

进一步的，步骤（3）中，所述引物序列pBI121-Md4CL4-F和pBI121-Md4CL4-R如SEQID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

进一步的，步骤（4）中，所述表达载体pBI121-Md4CL4转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacien）EHA105的具体方法如下：接种农杆菌EHA105于10 mL含利福平（50 mg L^-1）、链霉素（30 mg L^-1）和卡那霉素（30 mg L^-1）的LB液体筛选培养基中，振荡培养24 h（28℃）；其后，继续取0.4 mL培养物转接于10 mL LB液体培养基，继续培养，使其OD₆₀₀达到0.6~0.8；而后将该培养物冰浴30 min，4℃下5000 rpm离心5 min；弃去上清后，加入5 mL预冷的CaCl₂（0.05 mol L^-1）悬浮菌液，继续于4℃下5000 rpm离心5 min；弃去上清后，加入0.4 mL预冷的CaCl₂（0.02 mol L^-1）悬浮菌液，继续加入1/3体积的甘油，液氮速冻，保存至-80℃冰箱。

进一步的，述步骤（4）中，所述叶盘转化法转化烟草（Nicotianatabacum'NC89'）的具体方法如下：将烟草‘NC89’种子催芽、播种，按常规管理至2～3片真叶期；随后，取烟草叶片，用70%乙醇消毒10 s，再用0.1% HgCl₂消毒8 min，最后用无菌水冲洗数次后将叶片剪成0.5cm×0.5cm小叶块，置于MS分化培养基上，28℃预培养 2 d，培养光照时间为16h/d，光照强度为2000 Lx；预培养后的烟草叶片浸入制备的EHA105菌液10 min，然后用无菌吸水纸吸干多余菌液，转到MS基本培养基上，28℃、弱光下共培养2d；共培养后的外植体先用无菌水洗3次（含羧苄青霉素250mg/L），再用MS基本培养液（含羧苄青霉素250mg/L）洗1次，用无菌吸水纸吸干液体，转到MS分化培养基上（含卡那霉素100mg/L，羧苄青霉素250mg/L），28℃下筛选培养；待芽体长至1cm 左右时，切下芽体移到生根培养基中（含卡那霉素50mg/l，头孢霉素200mg/l），促其生根；待根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，用塑料薄膜保湿 2d 后，置于温室常规管理；经过继续繁殖培养获得T3代转基因烟草株系。

经过苹果基因组4CL结构域扫描、鉴定、耐盐功能分析，获得一种具有提高植物耐盐性的苹果Md4CL4基因，为从苹果中克隆得到的4CL基因，命名为其cDNA全长1833 bp，cDNA序列为SEQ ID NO.1；其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，核苷酸序列中含有1个AMP结合域，1个AMP结合域_C域和2个保守域：Box I和Box II，属于被子植物4CL基因家族第Ⅱ类成员。

本发明提供的Md4CL4基因分子量为65.59 kDa，等电点为5.5，编码蛋白包含610个氨基酸，显著受盐胁迫诱导，可提高转基因烟草在盐胁迫下的生长量。

本发明苹果4CL基因鉴定：利用HMMER软件自苹果基因组中扫描包含保守结构域：AMP结合域（PF00501）和AMP结合域_C域（PF13193）的基因，利用保守结构域搜索、系统发育分析、基因功能注释等方法鉴定出苹果4CL（Md4CL）基因：Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4；鉴定方法如下：自GDR数据库下载苹果参考基因组（v1.0）序列；自Pfam数据库（31.0）下载HMM（隐马尔可夫模型）文件PF00501（AMP结合域）和PF13193（AMP结合域_C域），用HMMER软件（版本3.1b2）的hmmsearch功能搜索苹果基因组（默认E值为0.05）；从TAIR数据库获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）4个4CL（At4CL）和9个4CL-like（At4CL-like）的蛋白序列；利用MEGA 7.0对筛选的蛋白序列与4个At4CL和9个At4CL-like蛋白序列进行系统发育分析；根据聚类结果分析苹果的推定苹果4CL（Md4CL）蛋白；进一步使用NCBI保守域搜索和Pfam数据库确认候选Md4CL蛋白质序列的可靠性，确保每个候选蛋白中存在保守结构域AMP结合域和AMP结合域_C域；进一步使用blastp和NCBI nr蛋白质数据库注释推定蛋白质；进一步使用blastp方法将4个At4CL和9个At4CL-like蛋白用作查询序列，在GDR数据库中搜索预测的苹果蛋白，验证上述结果，获得了4个最终的Md4CL候选蛋白序列，被命名为Md4CL1~Md4CL4，和25个最终的Md4CL-like候选蛋白序列，被命名为Md4CL-like1~Md4CL-like25。

本发明的有益效果为：

（1）本发明提供的苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶4基因为首次从苹果中克隆制备，为植物分子育种提供基因资源，本发明在苹果中首次发现了Md4CL4基因高响应盐胁迫，获得了一种从苹果中分离克隆出的促进盐胁迫耐受性的基因的完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用Md4CL4基因在烟草中超量表达之后的转基因材料耐盐性明显提高。利用该基因有助于培育高耐盐的植物新品种。

（2）利用本发明可以通过基因工程技术提高植物的耐盐性。为利用基因工程手段培育抗逆植物新品种奠定基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例所公开的苹果Md4CL基因与其它物种4CL基因的多物种进化分析示意图；

图2为本发明实施例所公开的苹果Md4CL基因编码Md4CL蛋白的氨基酸序列与拟南芥、杨树、水稻4CL蛋白的氨基酸序列比对示意图；

图3为本发明实施例所公开的200 mmol NaCl胁迫处理下Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3、Md4CL4基因的表达情况示意图；

图4为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因的电泳图；

图5为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因过表达烟草株系‘OE-2’、‘OE-3’、‘OE-4’和野生型株系‘WT’目的基因Md4CL4的PCR检测电泳图；

图6为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因过表达烟草株系‘OE-2’、‘OE-3’、‘OE-4’和野生型株系‘WT’目的基因Md4CL4表达量的qRT-PCR检测示意图；

图7为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因过表达烟草株系‘OE-2’、‘OE-3’、‘OE-4’和野生型株系‘WT’在对照MS培养基和分别添加200 mmol NaCl、300 mmol NaClMS培养基上的生长情况示意图；

图8为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因过表达烟草株系‘OE-2’、‘OE-3’、‘OE-4’和野生型株系‘WT’在对照MS培养基和分别添加200 mmol NaCl、300 mmol NaClMS培养基上植株的根长和鲜重示意图；

图9为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因过表达烟草株系‘OE-2’、‘OE-3’、‘OE-4’和野生型株系‘WT’在对照MS培养基和分别添加200 mmol NaCl、300 mmol NaClMS培养基上植株的叶片丙二醛（MDA）含量示意图；

图10为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因过表达烟草株系‘OE-2’、‘OE-3’、‘OE-4’和野生型株系‘WT’在对照MS培养基和分别添加200 mmol NaCl、300 mmol NaClMS培养基上植株的叶片相对电解质渗透率示意图；

图11为本发明实施例所公开的一种苹果Md4CL4基因过表达烟草株系‘OE-2’、‘OE-3’、‘OE-4’和野生型株系‘WT’在对照MS培养基和分别添加200 mmol NaCl、300 mmol NaClMS培养基上植株的叶片游离脯氨酸含量示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明提供了一种苹果4-香豆酸辅酶A连接酶（Md4CL4）基因及其编码蛋白和应用，具体实施例如下：

一种苹果4-香豆酸辅酶A连接酶（Md4CL4）基因及其编码蛋白和应用，包括如下步骤：

（1）苹果4CL基因鉴定：使用苹果参考基因组v1.0序列（下载自GDR数据库，http://www.rosaceae.org/）。从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org；版本31.0）下载获得 HMM（隐马尔可夫模型）文件PF00501（AMP结合域）和PF13193（AMP结合域_C域），并运用HMMER软件（版本3.1b2）的hmmsearch功能搜索苹果基因组（默认E值为0.05）。从TAIR数据库（http://www.arabidopsis.org/）获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）4个4CL（At4CL）和9个4CL-like（At4CL-like）的蛋白序列。利用MEGA 7.0对余下的蛋白序列与4个At4CL和9个At4CL-like蛋白序列进行系统发育分析。根据聚类结果分析苹果的推定苹果4CL（Md4CL）蛋白。为了确认候选Md4CL蛋白质序列的可靠性，确保每个候选蛋白中存在保守结构域AMP结合域和AMP结合域_C域。为此，使用了NCBI保守域搜索（CDD:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和Pfam数据库（Pfam31.0:http://pfam.xfam.org/）。进一步使用blastp和NCBI nr蛋白质数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）注释推定蛋白质。为了进一步验证上述结果，再次使用blastp方法将4个At4CL和9个At4CL-like蛋白用作查询序列，在GDR数据库（http://www.rosaceae.org/tools/ncbi_blast）中搜索预测的苹果蛋白，获得4个最终的Md4CL候选蛋白序列，被命名为Md4CL1~Md4CL4，和25个最终的Md4CL-like候选蛋白序列，被命名为Md4CL-like1~Md4CL-like25。

（2）响应盐胁迫Md4CL的分析：RNA的提取：采用200 mM NaCl处理3个月大的‘金冠’（M. domestica cv. 'Golden Delicious'）苹果苗，分别在处理的0、3、6、12、24、48 h采集苗干中部叶片。采用“Trizol法”提取各处理时期‘金冠’叶片总RNA。具体方法如下：称取0.2g叶片组织，于液氮中研磨成粉末，向研钵中加入2 mL Trizol充分匀浆，室温放置10 min；匀浆吸入1.5 mL的离心管中，加入200µL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，室温放置10min；4℃离心，12 000r/min，15 min，取上层液相移入另一管；加入500 µL等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10 min；4℃离心，12 000 r/min，15 min，用枪小心吸去所有上清；1 mL 75%乙醇洗两遍，离心4℃，8 000 r/min，10 min，用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5 min；加入适量DEPC处理水，65℃促溶10-15min，保存在-80℃备用。

cDNA的合成：以提取总RNA为模板，进行RT-PCR反转录，得到cDNA第一链；反转录反应体系中含有总RNA 2 μg，2×TS Reation Mix 10 μL，随机引物2 pmol，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH₂O至20 μL，混匀；42℃孵育30 min，冰上冷却2 min，-20℃保存备用。

根据参考基因组序列信息设计四对候选基因特异引物序列，qPCRMd4CL1-F和qPCR4CL1-R、qPCRMd4CL2-F和qPCR4CL2-R、qPCRMd4CL3-F和qPCR4CL3-R、qPCRMd4CL4-F和qPCR4CL4-R，序列分别见SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析盐胁迫下Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4相对表达水平。qRT-PCR在BIO-RAD iQ5 设备上进行，反应体系20 µL，包含10 µL of SYBR^®Premix Ex Taq™（TaKaRa），1.0 μL cDNA，各0.5μL上下游引物和9 μL ddH₂O。扩增程序包括：95℃ 3min；而后是95℃ 10 s、58℃ 30 s、72℃ 15 s 40个循环；然后72℃ 3min。每样品设置3次测定重复。使用苹果MdMDH作为内参基因，计算△Ct值。相对表达量根据2^-△△Ct方法计算，根据溶解曲线确定特异性扩增。

（3）基因的克隆：设计一对引物序列Md4CL4-F和Md4CL4-R，序列分别见 SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12，以反转录cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得Md4CL4全长cDNA序列。

PCR扩增体系为50 μL，在200 μL离心管中分别加入以下成分：Md4CL4-F和Md4CL4-R（均为10 µM）各1 µL，5× TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5 mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，模板2μL，加ddH₂O至50μL，混匀。

PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30 s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

最后，将获得的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（Solarbio）回收目的片段：将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽可能切除多余部分），放入干净的离心管中，称量计算凝胶重量（提前记录离心管重量）；向胶块中加入1倍体积Buffer PG（如凝胶重为100 mg，其体积可视为100μL，依此类推）；50℃水浴温育，其间每隔2~3 min温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解；柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱（Spin Columns DM）中加入200 μLBuffer PS，13 000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；将上述溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2 min，13 000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入450 μl Buffer PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13 000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；13 000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放到一个新的1.5 mL离心管（自备）中，向吸附膜中间位置悬空滴加50 μL Buffer EB，室温放置2 min。13 000 rpm离心1 min，收集DNA溶液。

回收产物连接pEASY-Blunt载体，连接体系为5 μL，取PCR产物4 μL和pEASY-Blunt载体1 μL轻轻混合，室温37℃反应5 min。反应结束后，放置于冰上。然后热激法转化大肠杆菌DH5α：取-80℃保存的 DH5α感受态细胞 100 μL，冰上解冻后迅速加入连接产物5 μL，轻轻混匀，冰浴30 min，42℃水浴中热激1 min，立即置冰上3 min，加入1 mL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1 h，然后5000 rpm，离心10 min，吸出上清液，沉淀用100 μL LB培养液悬浮，将菌液均涂于含抗生素的LB固体培养基上，37℃培养，过夜至长出单菌落。筛选阳性克隆，菌落PCR检测，挑取5个阳性菌落送交上海生工生物公司测序。

利用NCBI提供的在线ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）寻找基因的开放阅读框（ORF）。用ProtParam（http://us.expasy.org/tools/ProtParam.html）预测编码蛋白的分子量、等电点等理化特性。

（4）烟草中过表达苹果Md4CL4基因：构建表达载体pBI121-Md4CL4：设计一对含有BamHI和SalI酶切位点的引物pBI121-Md4CL4-F和pBI121-Md4CL4-R扩增目的基因Md4CL4的编码区，引物序列见 SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。PCR反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性60 s，60℃退火1 min，72℃ 2 min， 30个循环；72℃延伸10 min。而后对PCR产物进行回收和测序，操作方法同基因克隆。用SalI和BamHI酶切该cDNA，并在CaMV35S启动子的控制下连接到二元载体pBI121（Clontech）的SalI和BamHI位点，10 μL连接体系包括目的片段4 μL，回收PBI载体1 μL，Ligation Solution I 5 μL。

表达载体pBI121-Md4CL4转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacien）EHA105。接种农杆菌EHA105于10 mL含利福平（50 mg L^-1）、链霉素（30 mg L^-1）和卡那霉素（30 mg L^-1）的LB液体筛选培养基中，振荡培养24 h（28℃）；其后，继续取0.4 mL培养物转接于10 mLLB液体培养基，继续培养，使其OD₆₀₀达到0.6~0.8；而后将该培养物冰浴30 min，4℃下5000rpm离心5 min；弃去上清后，加入5 mL预冷的CaCl₂（0.05 mol L^-1）悬浮菌液，继续于4℃下5000 rpm离心5 min；弃去上清后，加入0.4 mL预冷的CaCl₂（0.02 mol L^-1）悬浮菌液，继续加入1/3体积的甘油，液氮速冻，保存至-80℃冰箱。

利用叶盘转化法转化烟草（Nicotiana tabacum 'NC89'）。将烟草‘NC89’种子催芽、播种，按常规管理至2～3片真叶期。取烟草叶片，用70%乙醇消毒10 s，再用0.1% HgCl₂消毒8 min，最后用无菌水冲洗数次后将叶片剪成 0.5cm×0.5cm小叶块，置于MS分化培养基上，28℃预培养 2 d，培养光照时间为16h/d，光照强度为2000 Lx。预培养后的烟草叶片浸入制备的EHA105菌液10 min，然后用无菌吸水纸吸干多余菌液，转到MS基本培养基上，28℃、弱光下共培养2d。共培养后的外植体先用无菌水洗3次（含羧苄青霉素250mg/L），再用MS基本培养液（含羧苄青霉素250mg/L）洗1次，用无菌吸水纸吸干液体，转到MS 分化培养基上（含卡那霉素100mg/L，羧苄青霉素250mg/L），28℃下筛选培养。待芽体长至1cm 左右时，切下芽体移到生根培养基中（含卡那霉素50mg/l，头孢霉素200mg/l），促其生根。待根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，用塑料薄膜保湿 2d 后，置于温室常规管理。经过继续繁殖培养获得T3代转基因烟草株系。

（5）转基因烟草株系耐盐性评价：将5 d大的转基因烟草株系（OE-2、OE-3、OE-4）和野生型（WT）幼苗分别移栽至对照MS培养基、添加200 mM NaCl的MS培养基和添加300 mMNaCl的MS培养基，验证Md4CL4对植物耐盐性的提高作用。经过14 d的培养，测定在不同培养基上各烟草株系（OE-2、OE-3、OE-4和WT）植株的鲜重、根长，以及叶片丙二醛（MDA）、电解质渗透率、游离脯氨酸等指标。

MDA测定：将0.1 g叶片或组织加入1.2 mL预冷的0.1% TCA（三氯乙酸）溶液研磨，4°C下10000 rpm离心15 min，取0.5 mL上清液加入1.0 mL 0.65% TBA（硫代巴比妥酸），混匀后沸水浴30 min，立即冰浴终止反应，4°C下5000 rpm离心10 min。测定样品液在波长532nm和600 nm下吸光值，计算MDA含量。

相对电解质渗透率测定：称取0.1 g叶片用蒸馏水冲洗3~5次，浸泡于10 mL去离子水中，室温下放置12 h，使用Mettler Toledo Inlab 738电导率仪测定初始电导率（E1）；然后将样品煮沸30 min，而后在室温下冷却放置12 h；最后，测定样品电解质液的终电导率（E2）；电解质渗透率通过公式：EL（%）=E1/E2× 100计算。

游离脯氨酸含量测定：称取0.2g叶片或组织，置于试管中，加入5mL 3%的磺基水杨酸溶液，封闭管口，沸水浴10min。室温冷却，取2.0 mL上清液，加2.0 mL冰乙酸和2.0 mL2.5%的酸性茚三酮显色液，继续沸水浴40min，冷却后加入5.0 mL甲苯振荡混匀，萃取红色物质。静置分层后，吸取测定甲苯层在波长520nm下的吸光值，计算脯氨酸含量。

检测结果如下：

利用HMMER软件自苹果基因组中扫描包含保守结构域：AMP结合域（PF00501）和AMP结合域_C域（PF13193）的基因，利用保守结构域搜索、系统发育分析、基因功能注释等方法鉴定出4个苹果4CL（Md4CL）基因：Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4，4个Md4CL基因与其它物种的多物种进化分析如图1所示。结果表明，Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4与桃（Prunus persica）的4CL进化关系较近，其中Md4CL1与PPE_003G09700最近，Md4CL2与PPE_001G08080最近，而Md4CL3、Md4CL4与PPE_002G31220聚在一起；根据4个Md4CL基因与拟南芥（Arabidopsis thaliana）4CL（At4CL）、水稻（Oryza sativa）4CL（Os4CL）聚类结果表明，Md4CL1、Md4CL2属于被子植物4CL基因家族第I类成员，Md4CL3、Md4CL4属于被子植物4CL基因家族第II类成员。

利用DNAMAN 6.0.3.99软件，对根据苹果v1.0参考基因组推导得出的4个苹果4CL蛋白序列，与已知的4个拟南芥4CL蛋白（At4CL）、5个杨树4CL蛋白（Ptr4CL）、4个水稻4CL（Os4CL）蛋白序列进行比对分析，如图2所示。结果表明，多序列比对显示4种植物的4CL蛋白质序列除了均包含AMP结合域、AMP结合域_C域以外，还包含保守的Box I和Box II，其中BoxI域中的1，19，21，23~33和37位氨基酸，以及Box II域的1，3， 5~8，10~13，28，31~34和36~37位氨基酸在拟南芥、杨树、水稻和苹果的4CL蛋白中高度保守，验证了筛选苹果Md4CL的正确性。

分析盐胁迫下Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4相对表达水平，筛选显著受盐胁迫诱导的Md4CL基因。结果表明，Md4CL1和Md4CL2基因盐处理2 h时与对照相比，即开始显著下调表达，并随盐胁迫持续，表达一直受到显著抑制，而Md4CL3和Md4CL4则表现出相反的基因表达趋势，在盐胁迫处理的2 h即显著上调，随胁迫持续，表达一直受到显著诱导，其中Md4CL3在胁迫的24 h达到诱导高峰，是对照的5.5倍，而Md4CL4在胁迫的6 h达到诱导高峰，是对照的69.9倍，并且表达量随胁迫持续显著较高（图3）。上述结果表明Md4CL3和Md4CL4均显著受盐胁迫诱导表达，特别是Md4CL4在盐胁迫下的表达量极高，表明该基因在应对盐胁迫中起重要作用。

自‘金冠’苹果中克隆Md4CL4基因，以反转录cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得Md4CL4全长cDNA序列，电泳图见图4。其cDNA全长1833 bp，序列为SEQ ID NO.1；其编码蛋白包含610个氨基酸，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，核苷酸序列中含有1个AMP结合域，1个AMP结合域_C域和2个保守域：Box I和Box II。Md4CL4基因分子量为65.59 kDa，等电点为5.5。

苹果Md4CL4基因提高植物耐盐性的应用：设计一对含有SalI和BamHI酶切位点的引物扩增遗传转化的目的基因Md4CL4的编码区，构建表达载体pBI121-Md4CL4，转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacien）EHA105。叶盘转化法转化烟草（Nicotiana tabacum）‘NC89’，获得阳性转基因烟草后代。过表达Md4CL烟草株系的PCR和qRT-PCR检测结果分别如图5和图6所示，图5中：“+”为阳性对照（plasmid DNA of 35S::Md4CL pRI101AN vector），“-”为阴性对照（水），“M”为DL2000 DNA marker。对转基因烟草株系进行盐胁迫处理评价，证明Md4CL4对植物耐盐性的提高作用。结果表明，将烟草转Md4CL基因株系OE-2、OE-3、OE-4以及野生型‘WT’5 d大的幼苗转移至MS固体培养基和添加200 mM NaCl、300 mM NaCl的MS固体培养基上，评价过表达Md4CL4对烟草盐胁迫耐受性的影响。在对照培养基上时，烟草野生型‘WT’和各转基因株系生长未表现出显著差异，但添加NaCl后对烟草野生型和各转基因株系均表现出生长抑制作用，并且随盐浓度的增加，这种抑制作用增强，但对野生型‘WT’生长的抑制作用比转基因株系更强（图7），逆境下各株系植株的鲜重和根长均以野生型最低（图8）。这一结果表明盐胁迫下Md4CL4的过量表达可以缓解该逆境对烟草植株生长的不利作用，提高了烟草的耐盐性。进一步测定不同株系叶片的MDA、电解质渗透率和由梨脯氨酸含量，结果表明，3个转基因株系叶片MDA含量、电解质渗透率水平均均低于野生型株系，而脯氨酸含量高于野生型，而在处理前这些指标在各株系间均没有显著差异（图9~图11），在生理上说明了Md4CL基因过量表达提高了烟草的耐盐性。该研究能够为植物抗盐分子辅助育种提供基因资源，并为利用基因工程手段培育抗逆植物新品种奠定基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

核苷酸序列表

<110>山东省果树研究所

<120>一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶4基因及其编码蛋白和应用

<160>14

<210>1

<211>1833

<212>DNA

<213>苹果（Malus domestica）

<220>

<223>

<400>1

atgaccattg cttccagttc cgtcgaaact caaaagccgg cagacatacc taccaatctc 60

atgccgtctg agattaattc tacctctcaa caaaatctaa cccaattgca acccgccgcc 120

tgcaccaaca atattattga ttccaccacc gccacctcca ccgccactgc caccactaac 180

catgtattca gatcaaaact accagacata ccyatcccca accacctccc tctccacact 240

tactgcttcc agaacctccc cgagttctcc gacagaccct gcttgatagt gggctcaacc 300

ggaaaatcat actctttctc cgagactcac ctcattgctc agaagaccgg cgcaggcctc 360

tccaacctcg gcatccaaaa aggtgaggtc atcatgattc tcctccaaaa ctgtgctgag 420

ttcgtcttcg ccttcatggg cgcttccatg atcggcgccg tcaccaccac cgccaacccc 480

ttttacactg ccgccgaggt tttcaagcag gtcaaggccg ctaatgccaa actcatcatc 540

actcaatccc agtacgtcaa taagctccgc gaacatccct cctccgccga cggcacggac 600

caaaataact tcccgaaact cggcgaagac tttaagatcg tcacgatcga caatcctccg 660

gagaattgct tgcatttctc agtgctctcc gaggccaacg agaaggagct tccggacgtg 720

gtgatcgacg cagaggaccc ggtggccctc ccgttctctt cggggacgac cgggctcccc 780

aagggagtca ttcttacaca caagagcttg gtcaccagcg tggcccaaca ggtggacgga 840

gagaatccaa acctctactt gaaggaggac gatgtcgtat tgtgcgtgct gccgttgttt 900

cacatattct cgttgaacag cgtgctgctg tgctcgctgc gagcaggggc gggagttctg 960

ctgatgcaca agtttgagat aggtacgctg ctggagctga ttcagcggta ccgagtgtcg 1020

gtggcggcgg tggtgccgcc gctggtgata gcactggcga agaacccaat ggtggcggag 1080

ttcgacctga gctctattag ggtggtgttg tctggagcgg cgccgctggg gaaggagctg 1140

gaggaggcgc tcaagagccg agtccctgag gcagtgttgg gtcagggtta tgggatgacg 1200

gaggcagggc cggtgttgtc aatgtgcatg gcatttgcaa aggaaccgat gccaaccaag 1260

tcagggtcgt gtgggacggt ggtccgaaat gcagagctca aggtccttga ccttgaaact 1320

ggtctctcac tcggctataa ccaatccggc gagatttgca tccgtggctc tcaaatcatg 1380

aaaggatatt tgaatgatgt tgcggctacg gcaaccaccg tagacacgga gggctggctt 1440

cacactggtg acgtgggtta tgtggatgat gacaatgaga ttttcatcgt tgatagagcc 1500

aaggagctca tcaaattcaa aggcttccaa gtgccaccag ctgagctgga gtccctactt 1560

ataagccatc catccattgc agatgcagcc gtcgttccgc aaaaagatga tgctgctggt 1620

gaggttcccg ttgcatttgt ggttcggtct aatggtctcg aacttactga agaggctgta 1680

aaagaattta tagcaaaaca ggtagtgttt tacaagagac tgcacaaggt gcacttcgtc 1740

catgcaattc caaagtctcc gtctggaaag atcttgagaa aagacctcag agccaagctt 1800

gcaaccgcaa ccccttctgc cctggctaat taa 1833

<210>2

<211>610

<212> PRT

<213>苹果（Malus domestica）

<220>

<223>

<400>2

Met Thr Ile Ala Ser Ser Ser Val Glu Thr Gln Lys Pro Ala Asp Ile Pro Thr Asn Leu 20

Met Pro Ser Glu Ile Asn Ser Thr Ser Gln Gln Asn Leu Thr Gln Leu Gln Pro Ala Ala 40

Cys Thr Asn Asn Ile Ile Asp Ser Thr Thr Ala Thr Ser Thr Ala Thr Ala Thr Thr Asn 60

His Val Phe Arg Ser Lys Leu Pro Asp Ile Pro Ile Pro Asn His Leu Pro Leu His Thr 80

Tyr Cys Phe Gln Asn Leu Pro Glu Phe Ser Asp Arg Pro Cys Leu Ile Val Gly Ser Thr 100

Gly Lys Ser Tyr Ser Phe Ser Glu Thr His Leu Ile Ala Gln Lys Thr Gly Ala Gly Leu 120

Ser Asn Leu Gly Ile Gln Lys Gly Glu Val Ile Met Ile Leu Leu Gln Asn Cys Ala Glu 140

Phe Val Phe Ala Phe Met Gly Ala Ser Met Ile Gly Ala Val Thr Thr Thr Ala Asn Pro 160

Phe Tyr Thr Ala Ala Glu Val Phe Lys Gln Val Lys Ala Ala Asn Ala Lys Leu Ile Ile 180

Thr Gln Ser Gln Tyr Val Asn Lys Leu Arg Glu His Pro Ser Ser Ala Asp Gly Thr Asp 200

Gln Asn Asn Phe Pro Lys Leu Gly Glu Asp Phe Lys Ile Val Thr Ile Asp Asn Pro Pro 220

Glu Asn Cys Leu His Phe Ser Val Leu Ser Glu Ala Asn Glu Lys Glu Leu Pro Asp Val 240

Val Ile Asp Ala Glu Asp Pro Val Ala Leu Pro Phe Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro 260

Lys Gly Val Ile Leu Thr His Lys Ser Leu Val Thr Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly 280

Glu Asn Pro Asn Leu Tyr Leu Lys Glu Asp Asp Val Val Leu Cys Val Leu Pro Leu Phe 300

His Ile Phe Ser Leu Asn Ser Val Leu Leu Cys Ser Leu Arg Ala Gly Ala Gly Val Leu 320

Leu Met His Lys Phe Glu Ile Gly Thr Leu Leu Glu Leu Ile Gln Arg Tyr Arg Val Ser 340

Val Ala Ala Val Val Pro Pro Leu Val Ile Ala Leu Ala Lys Asn Pro Met Val Ala Glu 360

Phe Asp Leu Ser Ser Ile Arg Val Val Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly Lys Glu Leu 380

Glu Glu Ala Leu Lys Ser Arg Val Pro Glu Ala Val Leu Gly Gln Gly Tyr Gly Met Thr 400

Glu Ala Gly Pro Val Leu Ser Met Cys Met Ala Phe Ala Lys Glu Pro Met Pro Thr Lys 420

Ser Gly Ser Cys Gly Thr Val Val Arg Asn Ala Glu Leu Lys Val Leu Asp Leu Glu Thr 440

Gly Leu Ser Leu Gly Tyr Asn Gln Ser Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Ser Gln Ile Met 460

Lys Gly Tyr Leu Asn Asp Val Ala Ala Thr Ala Thr Thr Val Asp Thr Glu Gly Trp Leu 480

His Thr Gly Asp Val Gly Tyr Val Asp Asp Asp Asn Glu Ile Phe Ile Val Asp Arg Ala 500

Lys Glu Leu Ile Lys Phe Lys Gly Phe Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Leu Leu 520

Ile Ser His Pro Ser Ile Ala Asp Ala Ala Val Val Pro Gln Lys Asp Asp Ala Ala Gly 540

Glu Val Pro Val Ala Phe Val Val Arg Ser Asn Gly Leu Glu Leu Thr Glu Glu Ala Val 560

Lys Glu Phe Ile Ala Lys Gln Val Val Phe Tyr Lys Arg Leu His Lys Val His Phe Val 580

His Ala Ile Pro Lys Ser Pro Ser Gly Lys Ile Leu Arg Lys Asp Leu Arg Ala Lys Leu 600

Ala Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ala Asn 610

<210>3

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

gaagccattc cgaagtcacc 20

<210>4

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>4

ttccttcaaa atggcagggc 20

<210>5

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>5

ggctccttct ggcaaaatct 20

<210>6

<211>18

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>6

cgcccacacg ctgatatg 18

<210>7

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>7

ttcatttctg ctagcctgct 20

<210>8

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>8

cggaactgga agcaatggag 20

<210>9

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>9

cgatcgatgc gtgttgactt 20

<210>10

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>10

gatccccgac ttcagaagct 20

<210>11

<211>23

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>11

atgaccattg cttccagttc cgt 23

<210>12

<211>23

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>12

ttaattagcc agggcagaag ggg 23

<210>13

<211>25

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

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<400>13

cgggatccat gaccattgct tccag 25

<210>14

<211>25

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>14

gcgtcgactt aattagccag ggcag 25

Claims

1.一种苹果4-香豆酸：辅酶A连接酶基因Md4CL4提高植物耐盐性的应用，其特征在于，该基因为从苹果中克隆得到的4CL基因Md4CL4，cDNA序列为SEQ ID NO.1；所述Md4CL4基因分子量为65.59 kDa，等电点为5.5；所述植物为苹果或烟草。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）响应盐胁迫Md4CL的分析：采用“Trizol法”提取盐胁迫处理的‘金冠’（Malusdomesticacv. 'Golden Delicious'）叶片总RNA，以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR反转录，合成cDNA第一链；设计Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4的四对特异引物序列，qPCRMd4CL1-F和qPCR4CL1-R、qPCRMd4CL2-F和qPCR4CL2-R、qPCRMd4CL3-F和qPCR4CL3-R、qPCRMd4CL4-F和qPCR4CL4-R，分析盐胁迫下Md4CL1、Md4CL2、Md4CL3和Md4CL4相对表达水平，筛选显著受盐胁迫诱导的Md4CL4基因；

（3）苹果Md4CL4基因提高植物耐盐性的应用：设计一对含有BamHI和SalI酶切位点的引物pBI121-Md4CL4-F和pBI121-Md4CL4-R，利用PCR扩增目的基因Md4CL4的编码区，构建表达载体pBI121-Md4CL4，转入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefacien）EHA105，叶盘转化法转化烟草（Nicotianatabacum）‘NC89’，获得阳性转基因烟草后代。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述引物序列qPCRMd4CL1-F和qPCR4CL1-R、qPCRMd4CL2-F和qPCR4CL2-R、qPCRMd4CL3-F和qPCR4CL3-R、qPCRMd4CL4-F和qPCR4CL4-R如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述引物序列Md4CL4-F和Md4CL4-R如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述引物序列pBI121-Md4CL4-F和pBI121-Md4CL4-R如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

6.根据权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述表达载体pBI121-Md4CL4转入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefacien）EHA105的具体方法如下：接种农杆菌EHA105于10 mL、含50 mg. L^-1利福平、30 mg. L^-1链霉素和30 mg. L^-1卡那霉素的LB液体筛选培养基中，28℃振荡培养24 h；其后，继续取0.4 mL培养物转接于10 mL LB液体培养基，继续培养，使其OD₆₀₀达到0.6~0.8；而后将该培养物冰浴30 min，4℃下5000 rpm离心5min；弃去上清后，加入5 mL、 0.05 mol. L^-1预冷的CaCl₂悬浮菌液，继续于4℃下5000 rpm离心5 min；弃去上清后，加入0.4 mL、0.02 mol. L^-1预冷的CaCl₂悬浮菌液，继续加入1/3体积的甘油，液氮速冻，保存至-80℃冰箱。

7.根据权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述叶盘转化法转化烟草（Nicotianatabacum）‘NC89’的具体方法如下：将烟草‘NC89’种子催芽、播种，按常规管理至2～3片真叶期；随后，取烟草叶片，用70%乙醇消毒10 s，再用0.1% HgCl₂消毒8 min，最后用无菌水冲洗数次后将叶片剪成 0.5cm×0.5cm小叶块，置于MS分化培养基上，28℃预培养 2 d，培养光照时间为16h/d，光照强度为2000 Lx；预培养后的烟草叶片浸入制备的EHA105菌液10 min，然后用无菌吸水纸吸干多余菌液，转到MS基本培养基上，28℃、弱光下共培养2d；共培养后的外植体先用含250mg/L羧苄青霉素的无菌水洗3次，再用含250mg/L羧苄青霉素的MS基本培养液洗1次，用无菌吸水纸吸干液体，转到含100mg/L卡那霉素，250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基上，28℃下筛选培养；待芽体长至1cm 左右时，切下芽体移到含50mg/l卡那霉素，200mg/l头孢霉素的生根培养基中，促其生根；待根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，用塑料薄膜保湿 2 d 后，置于温室常规管理；经过继续繁殖培养获得T3代转基因烟草株系。