CN111235160B - 一种密罗木基因MfWRKY70及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种密罗木基因MfWRKY70及其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对密罗木抗旱WRKY转录因子的研究，以对植物的抗逆性能进行改良，提高植物的抗逆能力。

Description

一种密罗木基因MfWRKY70及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种密罗木基因MfWRKY70及其应用。

背景技术

干旱和盐渍化是当今植物面临的主要非生物灾害之一，其主要作用机理是使植物内外渗透压不一致导致机体脱水。人口的增长，城镇建设的快速发展，不仅导致民用、工业、农业用水竞争日益激烈，也造成污染加剧，生态系统破坏，水资源短缺，土壤盐渍化现象日益加剧等现象。因此，发掘抗逆基因，培育抗逆性强的植物新品种，对加快建设资源节约型、环境友好型社会，大力发展绿色经济，增强可持续发展能力，实现经济发展和生态文明的有机统一具有重要作用。

基因工程技术是植物抗逆性改良的重要手段。目前，已有不少抗逆基因被报道和应用，其中转录因子基因通过与其调控的下游基因启动子区的顺式作用元件结合而调控靶基因的表达，以对外界不良环境做出响应。与植物抗逆性有关的转录因子很多，如MYB类、bZIP类、WRKY类、AP2/ERF类和NAC类等。WRKY转录因子在植物胁迫响应信号转导过程也扮演着重要角色。WRKY转录因子属于一类大的转录因子家族，参与调控植物生长发育中的多种信号途径，其典型特征为N端存在着由一段长度大约60个氨基酸所组成的保守WRKY结构域。已有大量研究表明WRKY转录因子可受到多种逆境条件如干旱、盐、射线、低温、高温等的诱导，并在植物对逆境的抗性反应中发挥作用。

密罗木主要分布在南非，是地球上为数不多的极耐旱复苏植物之一，也是唯一的木本复苏植物。它能够像种子一样耐受高度脱水干燥，在组织含水量仅存7％-11％时仍能保持遇水复活的特性。因此，密罗木是一种理想地研究植物抗旱性的材料。然而过去，研究人员主要通过形态学、生理、生化等方面研究了该植物的抗旱机理，但对于其中与抗逆相关的基因及其分子机制还不清楚，也尚未见密罗木中抗逆WRKY转录因子及其应用的相关报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种密罗木基因MfWRKY70及其应用，该基因能在干旱脱水早期快速响应，提高植物的抗旱耐盐性能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种密罗木基因MfWRKY70，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，序列表SEQ ID NO.1从密罗木叶片RNA中通过PCR克隆，全长885bp。

采用上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.2由294个氨基酸组成，有一个核定位信号：RRGCYKRRRTTETW；其含有一个WRKY保守结构域，位于127～182个氨基酸的位置，并且还含有一个典型C2HC型锌指结构，为第三类WRKY转录因子家族。

包含上述密罗木MfWRKY70基因的质粒。

包含上述密罗木MfWRKY70基因的重组表达载体。

包含上述密罗木MfWRKY70基因的转基因细胞系。

包含上述密罗木MfWRKY70基因的工程菌。

密罗木基因MfWRKY70在植物抗旱耐盐过程中的应用。

本发明的有益效果为：

1.获得了对干旱及盐胁迫有较高耐受性的转基因拟南芥。

2.密罗木基因MfWRKY70能在干旱脱水期快速响应，为利用该基因提高其他植物的干旱耐受性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1为本发明的密罗木基因MfWRKY70的系统进化树；

图2为本发明的密罗木基因MfWRKY70亚细胞定位的结果；

图3为转MfWRKY70基因拟南芥植株的阳性鉴定结果；

图4为野生型和转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株在干旱胁迫处理后的生长状态；其中，图4a为野生型和转基因拟南芥在干旱胁迫处理后的根部生长状态；图4b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图4c为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态；

图5为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；其中，图5a为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根部生长状态；图5b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根长；图5c为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；

图6为野生型和转基因拟南芥植株失水率测定；

图7为野生型和转基因拟南芥植株的脯氨酸含量测定；

图8为野生型和转基因拟南芥植株的叶绿素测定；

图9为野生型和转基因拟南芥植株的MDA(丙二醛)测定；

图10为野生型和转基因拟南芥植株的可溶性蛋白质含量测定；

图11为野生型和转基因拟南芥植株的SOD(超氧化物歧化酶)测定；

图12为野生型和转基因拟南芥植株的POD(过氧化物酶)测定；

图13为野生型和转基因拟南芥植株的CAT(过氧化氢酶)测定；

图14为野生型和转基因拟南芥植株的H₂O₂(过氧化氢)含量测定；

图15为野生型和转基因拟南芥植株的二氨基联苯胺(DAB)染色；

图16为野生型和转基因拟南芥植株的氮蓝四唑染色(NBT)染色；

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1克隆密罗木MfWRKY70基因

1、取密罗木叶片，液氮速冻，放置-80℃冰箱中保存以备提取总RNA；总RNA提取采用成都兰博生物公司购买的Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒来提取；密罗木cDNA的合成使用大连宝生物科技公司的Reverse Transcriptase M–MLV(RNaseH-)，按其产品说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F：5’-CATGCCATGGAGTCACCTTGGTCGGA-3’(SEQ ID NO.3)和R：5’-GACTAGTTCAGAAGTCGAAAATGACATCG-3’(SEQ ID NO.4)为引物，为了后续的酶切及重组连接，在设计引物时加上NcoI和SpeI这两个酶切位点，利用PCR进行cDNA扩增，扩增体系见表1，扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

表1 PCR扩增体系

2、PCR结束后进行电泳分析，采用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收约885bp的扩增片段，将扩增片段连接到Peasy-T1 Simple克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到成都擎科生物科技有限公司测定密罗木基因MfWRKY70的编码序列，其序如SEQ ID NO.1所示，再利用ORF Finder软件将所得基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2密罗木MfWRKY70的序列同源与同源性分析

根据序列测序结果，在NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与WRKY家族转录因子同源关系最近，将该转录因子与其它WRKY转录因子家族成员的蛋白序列进行比对，发现其锌指结构类型为C2HC型，依据该DNA结合域的结构特征，该MfWRKY70蛋白属于第三类WRKY转录因子家族；进一步利用比对的同源性较高物种的氨基酸序列构建系统进化树(如图1)，发现密罗木MfWRKY70与其他物种的亲缘关系较远，其结构域较为保守。

实施例3：密罗木基因MfWRKY70植物表达载体的构建

将上述经测序正确的菌液提取质粒，含MfWRKY70基因的克隆载体质粒经NcoI+SpeI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收885bp左右的DNA片段，将此片段与相应酶切的pGSA1403表达载体相连，获得的载体命名为35S:MfWRKY70-pGSA1403。

实施例4 MfWRKY70的亚细胞定位

根据亚细胞载体pHB-YFP上的碱基和酶切位点情况，以及ClonExpressII同源重组试剂盒的说明，选择HindIII和BamHI这两个酶切位点来设计引物；引物由成都擎科生物公司合成。

采用已合成的带有同源臂的引物，以密罗木cDNA为模板进行扩增，其引物的具体序列如下:

F：5’-ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGGAGTCACCTTGGTCGGA-3’(SEQ ID NO.5)

R:5’-GCTCACCATACTAGTGGATCCGAAGTCGAAAATGACATCG-3’(SEQ ID NO.6)

将扩增得到的PCR产物回收后，与经过HindIII和BamHI内切酶切除的pHB载体相连，构建融合载体35S:MfWRKY70-pHB-YFP，通过将转入pHB-YFP质粒的野生型本氏烟草和转入35S:MfWRKY70-pHB-YFP质粒的野生型本氏烟草叶片制成切片，在激光共聚焦显微镜下观察结果如图2所示；从图2中可看出，只转入pHB-YFP的烟草叶片的荧光信号分布在烟草细胞内的各个部位，而转入MfWRKY70-pHB-YFP质粒的烟草叶片的荧光信号则只出现在细胞核中，说明MfWRKY70基因定位于细胞核中，并在细胞核中起作用。

实施例5：MfWRKY70基因的遗传转化

将农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰上解冻，取5μL重组质粒35S:MfWRKY70-pGSA1403于200μL感受态中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水浴5min，冰上放置2min后加入800μL LB液体培养基，在恒温培养箱中29℃，120r/min，培养2～4h。将上述菌液均匀涂布在含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，然后挑取单菌斑接种于5mL LB液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养24h。取1mL上述菌液转入50mL含10μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于28℃，250r/min，振荡培养至OD₆₀₀≈1.5。将上述OD值达标的菌液4℃，8000r/min离心10min收集菌体，弃掉上清，用等体积的5％蔗糖溶液将菌体重悬，在菌液中加入Silwet-77并混匀，使溶液浓度达到0.02％且菌液OD₆₀₀≈0.8。

转化前需剪掉成熟的果荚，颠倒植株让植株浸入农杆菌细胞悬浮液2min，然后将浸好的植株用滤纸擦干并用塑料薄膜包裹，暗处理24h后于光照培养箱中正常培养，一周后可重复浸染一次。待种荚黄化后收种，记为T0代。继续将T0代拟南芥种子放入含有50μg/mL卡那霉素的培养基里，转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。因此筛选出能正常生长且颜色呈深绿色的植株，对深绿色植株提取DNA并进行PCR检测阳性，获得T₁代转基因植株，继续筛选获得T2代转基因植株，对T2代的不同植株进行筛选(如图3)，图3中条带由左至右依次为：Marker、WT、H₂O、OE3-1～OE3-5、OE10-1～OE10-5、OE11-1～OE11-5。

其中，“WT”和“H₂O”为阴性对照，OE3-1～OE3-5为OE3株系的不同植株，OE10-1～OE10-5为OE10株系的不同植株，OE11-1～OE11-5为OE11的不同植株，均检测到了目的基因条带，均为阳性植株，后续株系重复筛选步骤直至筛选出阳性过表达纯系植株。

实施例6：转基因拟南芥的胁迫处理

对于幼苗处理，是将野生型和过表达T3代纯系(OE3，OE10，OE11)分别播种于配置含NaCl(75mM，100mM，125mM)、甘露醇(200mM，250mM，300mM)的1/2MS培养基中，对照组只添加正常成分，记为CK。每个方形培养皿中三种株系分成两排点播，每排15株左右，每个处理重复三次，4℃暗处理2d后移入光照培养箱中垂直放置，继续培养2周，在根系分析仪下拍照并测量根长。

干旱胁迫下的幼苗表型如图4，其中，图4a为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根部生长状态；图4b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图4c为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态。

盐胁迫下的幼苗表型如图5，其中，图5a为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根部生长状态；图5b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根长；图5c为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态。

对于成株的处理，是将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(OE3，OE10，OE11)种子播种在1/2MS圆形培养皿，4℃暗处理3d后移入光照培养箱中培养至四叶期后移入花盆中，培养3周左右，选择长势一致的植株进行抗逆性分析。

干旱胁迫处理：对照组(记为CK)正常浇水管理，其余组均不浇水使其自然干旱失水，期间不断观察拍照并记录植株生长状况，失水4周左右，处理期间拍照观察。野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态如图4c；每个株系10株重复。

盐胁迫处理：对照组不作处理，记为CK，其余组每隔3天浇一次300mM的氯化钠处理液。2周后观察WT与过表达植株表型差异。野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态如图5c；每个株系10株重复。

通过研究野生型与过表达拟南芥幼苗和成株在干旱及氯化钠胁迫下的表型，发现过表达MfWRKY70基因株系OE3，OE10和OE11对干旱及盐的耐受性均明显强于WT，说明过表达MfWRKY70基因提高了拟南芥对盐及干旱胁迫的抗性。

实施例7：相关生理指标的测定

(1)拟南芥的培养

将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(OE3，OE10，OE11)种子播撒在1/2MS圆形培养皿，4℃暗处理3d后转入光照培养箱中培养7天，移栽至50孔穴盘内(已等量分装好营养土并浇足水)，继续培养4周左右。

(2)失水率的处理及测定

将穴盘中培养的WT，OE3，OE10和OE11浇足水分，剪去莲座叶对其取样，在天平上用定量滤纸称取三个株系各0.5g叶片，此时叶片含水量为初始含水量，记为m0，此后将叶片放入恒温光照培养箱中让其自然干旱(25℃，60％相对湿度)，在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h时分别称取叶片即时重量。每个时间点的实时失水率WR(Water lose rate)＝(m₀-m_t/m₀)*100％，其中m_t为每个时间点的即时含水量，m₀为初始含水量。结果如图6所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫下的离体叶片自然失水率。

在同等条件下，随着时间的推移各株系均有持续失水的趋势，而转基因株系OE3，OE10和OE11虽然失水率持续上升，但其失水率始终低于WT，且水分散失速率一直处于较为稳定平缓增长的状态，这说明转基因株系能够更好地控制自身机能适应环境的变化，将外部逆境胁迫对植株本身造成的伤害速率放缓，这能将一些不可逆的机体损伤降到最低。

(3)脯氨酸含量的测定

在天平上准确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内用少量蒸馏水溶解后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg；取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3mL，用蒸馏水定容至刻度并混匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL。

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，OE3，OE10和OE11三种植株进行自然干旱和浇灌300mM氯化钠溶液处理(自然干旱处理14d，氯化钠处理2d)，随后取正常条件和经过干旱、氯化钠处理的WT，OE3，OE10和OE11植株叶片鲜样各0.5g，加入少许石英砂和少许3％的磺基水杨酸溶液在研钵中磨碎，倒入10mL离心管并定容至10mL，4500r离心3min。取上清液并用3％的磺基水杨酸溶液定容至10mL。吸取2mL提取液至一洁净干燥玻璃试管中，加入2mL酸性茚三酮和2mL冰乙酸，100℃加热1h，放入冰水中终止反应，加入4mL甲苯，充分振荡15～20s，静置分层后用移液枪轻轻吸取上层红色溶液于比色皿中，以甲苯为对照，在分光光度计520nm波长处比色并求得吸光度值，此步骤重复两次，结果如图7所示。

在受到逆境胁迫时，WT体内脯氨酸积累量有一定的升高，但OE3，OE10和OE11体内的脯氨酸合成量远高于野生型。说明在干旱和盐的逆境条件下，过表达MfWRKY70基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(4)盐胁迫下叶绿素含量的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，OE3，OE10和OE11三种植株浇灌200mM氯化钠溶液处理2天，随后取正常生长和经氯化钠处理的WT，OE3，OE10和OE11植株叶片鲜样各0.5g，将其叶中脉剪掉并剪碎叶片，加入到50mL的棕色容量瓶中，分别加入上述95％乙醇提取液50mL，将容量瓶加塞放入25℃的恒温培养箱中暗中提取48h。因为95％乙醇提取液在波长为649nm和665nm处具有最大吸光值A649和A665，所以用紫外分光光度计测量A649和A665，以95％乙醇提取液作为空白对照，此步骤重复两次；结果如图8所示。

过表达MfWRKY70株系OE3，OE10和OE11在氯化钠处理的条件下，仍能维持较高的叶绿素含量，且在受到盐胁迫后各转基因的叶绿素含量有所上调，而WT叶绿素含量则明显降低。说明过表达MfbHLH38基因表现出优于野生型拟南芥对盐胁迫的耐受能力。

(5)MDA(丙二醛)含量的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，培养4w后对WT和转基因拟南芥(OE3，OE10和OE11)进行300mM氯化钠溶液的浇灌以及自然干旱处理，其中氯化钠处理7d，自然干旱处理7d，随后取正常培养及经过氯化钠和干旱处理的WT，转基因拟南芥(OE3，OE10和OE11)的叶片鲜样各0.5g以作后续生理指标测量(所有指标测量做三个重复)。

称取受胁迫处理的叶片0.5g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加8mL10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。取4支干净试管，编号，3支为样品管(三个重复)，各加入提取液2mL，对照管加蒸馏水2mL，然后各管再加入2mL 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液注入酶标板中放入酶标仪，分别在532、600和450nm波长下测定吸光度(A)值，其结果如图9所示。

在干旱和盐的胁迫下，WT，OE3，OE10和OE11株系植株叶片的MDA含量均有不同程度的升高，且OE3，OE10和OE11株系植株的MDA含量均低于WT株系，部分差异显著，部分差异极显著。

(6)可溶性蛋白质含量的测定

称取鲜样0.2g，用5mL磷酸缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。此为实验用植物酶液。吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释)，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查找蛋白质的含量，其检测结果如图10所示。

在受到逆境胁迫时，WT体内脯氨酸积累量有一定的升高，但过表达MfWRKY70株系OE3，OE10和OE11体内的可溶性蛋白合成量远高于野生型。说明在干旱和盐的逆境条件下，过表达MfWRKY70基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(7)SOD(超氧化物歧化酶)含量的测定

分别取Met：162mL，EDTA-Na2：6mL，NBT：6mL，核黄素：6mL于烧杯中混匀备用。取型号相同的试管，吸取40μL的酶液，并分别加入3mL的混合反应液，同时取两支试管作对照，一支加入40μL磷酸缓冲液和3mL混合反应液作空白对照，一支40μL磷酸缓冲液和3mL混合反应液用锡箔纸包好避光以作测定时调零。将试管置于光照培养箱中4000Lux，25℃下反应20min。以黑暗处理下的试管调零，测定各反应液560nm下吸光度值，其结果如图11所示。

超氧物歧化酶可以清除植物体内的超氧阴离子自由基，提高植物的抗逆性。测量结果显示，干旱和盐胁迫下，WT，OE3，OE10和OE11株系植株叶片的SOD活性均有不同程度的升高，且OE3，OE10和OE11株系植株的SOD活性均高于WT株系，说明在干旱和盐的逆境条件下，过表达MfWRKY70基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(8)POD(过氧化物酶)含量的测定

取0.1MPH 6.0的磷酸缓冲液50mL于烧杯中，加入愈创木酚28μL，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30％H₂O 219μL，保存于冰箱中备用。取40μL酶液+3mL反应液于试管中混匀，对照管加入40μL磷酸缓冲液+3mL反应液。在OD＝470nm下每隔1min读数一次，共读三次，以每分钟内△A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)，其结果如图12所示。

检测结果显示，干旱和盐胁迫下，WT，OE3，OE10和OE11株系植株叶片的POD活性均有不同程度的升高，且Line A，OE3，OE10和OE11株系植株的POD活性均高于WT株系，说明在干旱和盐的逆境条件下，过表达MfWRKY70基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(9)CAT(过氧化氢酶)含量的测定

配置0.1M H₂O₂溶液：0.568mL 30％H₂O₂定容至100mL，避光。0.1M pH7.0磷酸缓冲液：97.5mL A液+152.5mL B液，定容至500mL。0.1M的H₂O₂ 5mL+0.1M的PH7.0的磷酸缓冲液20mL(即按1：4的比例)混匀，即为CAT反应液。0.1mL(或50μL)酶液+2.5mL反应液，以PBS为对照调零，240(紫外)纳米下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次，其结果如图13所示。

过氧化氢酶活性可以反映出植物的代谢强度、以及自身的耐胁迫和抗病能力。检测结果显示，干旱和盐胁迫下，WT，OE3，OE10和OE11株系植株叶片的CAT活性均有不同程度的升高，且OE3，OE10和OE11株系植株的CAT活性均高于WT株系，说明在干旱和盐的逆境条件下，过表达MfWRKY70基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(10)H₂O₂(过氧化氢)含量的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，培养4w后对WT和转基因拟南芥(OE3，OE10和OE11)进行300mM氯化钠溶液的浇灌以及自然干旱处理，其中氯化钠处理7d，自然干旱处理7d，随后取正常培养及经过氯化钠和干旱处理的WT，转基因拟南芥(OE3，OE10和OE11)的叶片鲜样各0.3g。配置0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液。3000r/min离心10min，上清液备用。此为实验用植物酶液。具体操作按照Hydrogen Peroxide assay kit试剂盒进行，其结果如图14所示。

植物在胁迫下会积累过多的活性氧，而过量的活性氧会对植物蛋白造成严重损伤。在干旱和盐胁迫下，OE3，OE10和OE11转基因株系的活性氧积累量在不同程度上少于野生型拟南芥，说明MfWRKY70基因在拟南芥中的过表达能够帮助植株消除活性氧的累积，从而减轻过氧化物对其造成的损伤。

(11)二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四唑染色(NBT)染色

拟南芥的培养同步骤(1)，培养4w后对WT和转基因拟南芥(OE3，OE10和OE11)进行300mM氯化钠溶液的浇灌以及自然干旱处理，其中氯化钠处理7d，自然干旱处理7d，随后取正常培养及经过氯化钠和干旱处理的WT叶片，转基因拟南芥(OE3，OE10和OE11)的新鲜叶片放入配好的DAB溶液中和NBT溶液中，DAB溶液中叶片需暗处浸泡8h，NBT溶液中处理的叶片则浸泡3h，期间注意叶片分散，不要压在一起；DAB溶液中叶片暗处浸泡8h后光下放置1h，出现红棕色斑点后用95％的乙醇浸泡脱色后拍照。NBT溶液中处理的叶片浸泡好后可直接拍照，其结果如图15和图16所示。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种密罗木基因MfWRKY70及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> 密罗木(Myrothamnus flabellifolia)

<400> 1

atggagtcac cttggtcgga aaatctatca gctgaccggg aaagagcaat agaggagctg 60

gttcgaggac aagaattcac aaagcagctc cgaactctac tcgataaacc aaaaggagat 120

gatcataaag ctttctctgc cggggacctt atcaccagaa tattgagatc attcaacgaa 180

tcaatctcca tactgactta cagtcaatcc gacgaggttt ctcagattcc ggcggataag 240

gatggccaga agtctgaaga ttccggcgag agtaggaaga gctccggact gaaagaccga 300

cggggctgct ataaaagaag aaggacaaca gaaacatgga caaaagttac cgatactctt 360

gtggacgatg gacatgcatg gaggaaatat gggcaaaagg tcatccttaa tgcgacgcac 420

ccgaggaatt actataggtg tacacacaag acagatcagg gatgccaagc gacgaaacaa 480

gtgcagagaa ccgacgaaga cgataagccg acgtacagga ccacctacta cggccaccat 540

acctgccgga ctctcttgaa agcccctcag atcatcttgg gcgcggcagc tcctaatttc 600

gccaatcatt ccccttcttc ttccgcatcc attattctaa acttcggatc caacgatagg 660

cacaataatc atcatcgtca ttcgttcatc acaccggagg ttataaagca agaagactcg 720

tcgtccgatt atcttttctc gccggatcta aggccgtttg gttccgagca cggcgacctg 780

gacgtcatct ccggcgcgca ctcctccgcg gagagcagtc gtagttttga aatggatttg 840

atgacctgct ccgttgattt cgacgatgtc attttcgact tctga 885

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> 密罗木(Myrothamnus flabellifolia)

<400> 2

Met Glu Ser Pro Trp Ser Glu Asn Leu Ser Ala Asp Arg Glu Arg Ala

1 5 10 15

Ile Glu Glu Leu Val Arg Gly Gln Glu Phe Thr Lys Gln Leu Arg Thr

20 25 30

Leu Leu Asp Lys Pro Lys Gly Asp Asp His Lys Ala Phe Ser Ala Gly

35 40 45

Asp Leu Ile Thr Arg Ile Leu Arg Ser Phe Asn Glu Ser Ile Ser Ile

50 55 60

Leu Thr Tyr Ser Gln Ser Asp Glu Val Ser Gln Ile Pro Ala Asp Lys

65 70 75 80

Asp Gly Gln Lys Ser Glu Asp Ser Gly Glu Ser Arg Lys Ser Ser Gly

85 90 95

Leu Lys Asp Arg Arg Gly Cys Tyr Lys Arg Arg Arg Thr Thr Glu Thr

100 105 110

Trp Thr Lys Val Thr Asp Thr Leu Val Asp Asp Gly His Ala Trp Arg

115 120 125

Lys Tyr Gly Gln Lys Val Ile Leu Asn Ala Thr His Pro Arg Asn Tyr

130 135 140

Tyr Arg Cys Thr His Lys Thr Asp Gln Gly Cys Gln Ala Thr Lys Gln

145 150 155 160

Val Gln Arg Thr Asp Glu Asp Asp Lys Pro Thr Tyr Arg Thr Thr Tyr

165 170 175

Tyr Gly His His Thr Cys Arg Thr Leu Leu Lys Ala Pro Gln Ile Ile

180 185 190

Leu Gly Ala Ala Ala Pro Asn Phe Ala Asn His Ser Pro Ser Ser Ser

195 200 205

Ala Ser Ile Ile Leu Asn Phe Gly Ser Asn Asp Arg His Asn Asn His

210 215 220

His Arg His Ser Phe Ile Thr Pro Glu Val Ile Lys Gln Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ser Ser Asp Tyr Leu Phe Ser Pro Asp Leu Arg Pro Phe Gly Ser Glu

245 250 255

His Gly Asp Leu Asp Val Ile Ser Gly Ala His Ser Ser Ala Glu Ser

260 265 270

Ser Arg Ser Phe Glu Met Asp Leu Met Thr Cys Ser Val Asp Phe Asp

275 280 285

Asp Val Ile Phe Asp Phe

290

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg agtcaccttg gtcgga 26

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gactagttca gaagtcgaaa atgacatcg 29

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accagtctct ctctcaagct tatggagtca ccttggtcgg a 41

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcaccata ctagtggatc cgaagtcgaa aatgacatcg 40

Claims (6)

1.一种密罗木基因MfWRKY70，其特征在于，所述基因MfWRKY70的编码序列如SEQ IDNO.1所示。

2.采用权利要求1所述基因MfWRKY70编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求1所述密罗木基因MfWRKY70的质粒。

4.一种包含权利要求1所述密罗木基因MfWRKY70的重组表达载体。

5.一种包含权利要求1所述密罗木基因MfWRKY70的工程菌。

6.权利要求1所述的密罗木基因MfWRKY70在植物抗旱耐盐改良过程中的应用。

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