CN115976036B

CN115976036B - 密罗木基因MfbHLH104及其编码蛋白和在改善植物抗旱耐盐性能中的用途

Info

Publication number: CN115976036B
Application number: CN202210910192.4A
Authority: CN
Inventors: 黄卓; 向香盈; 徐文欣; 黄富荣; 陈朵儿; 蒋才忠
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-07-29
Filing date: 2022-07-29
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-07-29
Also published as: CN115976036A

Abstract

本发明公开了一种密罗木基因MfbHLH104及其编码蛋白和在改善植物抗旱耐盐性能中的用途。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对密罗木MfbHLH104转录因子的研究，以对植物的抗旱耐盐性能进行改良，提高植物的抗旱耐盐性能。

Description

密罗木基因MfbHLH104及其编码蛋白和在改善植物抗旱耐盐性能中的用途

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种密罗木基因MfbHLH104及其编码蛋白和在改善植物抗旱耐盐性能中的用途。

背景技术

干旱是植物目前所面临的主要的环境胁迫之一，不仅限制了许多植物的生存和生长，且对于作物的经济效益产生了巨大的负面影响。发掘抗旱耐盐基因，培育抗旱耐盐、节水的植物新品种，对加快建设资源节约型、环境友好型社会，大力发展绿色经济，增强可持续发展能力，实现经济发展和生态文明的有机统一具有重要作用。植物中的抗旱植物可以通过各种机制抵抗干旱，比如在干旱下合成更多的渗透调节物质从而维持植物细胞的渗透平衡，或者提高自身的抗氧化酶活维持植物的氧化还原稳态。在植物抵抗干旱的信号网络之中，转录因子扮演着极其重要的调控角色，许多家族的转录因子被发现对于植物的非生物胁迫有着重要作用，比如MYB，bHLH，DREB和WRKY家族等。

bHLH转录因子广泛存在于真核生物中，不仅在动物的细胞中出现，在高等植物中也有表达。其特殊的螺旋-环-螺旋结构域(basic helix-loop-helix,bHLH)是一段拥有近60个氨基酸的片段,因其上游富含碱性氨基酸而得名，其特殊之处在于除开HLH保守结构域之外，其序列中远端基序非常灵活，具有较高变异性。其N端与HLH基序相邻，包含6个共有氨基酸残基，属于DNA结合域，而bHLH结构域的C端则包含HLH序列作为二聚体化功能域，它主要由含有两个亲水亲脂α螺旋的疏水残基组成的环形结构组成，两个螺旋之间被不同长度的环分开，从而形成三位一体结构域。bHLH的特殊结构使其不同转录因子或同源转录因子之间能够形成同源或异源二聚体，与靶基因启动子特异性结合，起到转录调控的作用。已有大量研究表明bHLH转录因子可受到多种逆境条件如干旱、盐、射线、低温、高温等能都诱导，并在植物对逆境的抗性反应发挥作用。

密罗木主要分布在干燥的南非地区，是目前发现，唯一的木本复苏植物。密罗木极其耐干燥，在组织含水量仅存7％-11％时仍能保持遇水复活。因此，密罗木是一种理想地研究植物耐旱耐盐性的材料。现目前对于密罗木的耐旱耐盐研究都主要停留在形态学、生理、生化等方面，对于其与脱水响应相关的基因及其耐旱分子机制尚不清楚。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种密罗木基因MfbHLH104及其编码蛋白和在改善植物抗旱耐盐性能中的用途，该基因能在干旱脱水期快速响应，提高作物的抗旱耐盐性能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种密罗木基因MfbHLH104，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，序列表SEQ ID NO.1从密罗木叶片RNA中通过PCR克隆，核心编码区长度为639bp。

进一步地，该基因还可以是与SEQ ID NO.1所示序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白的基因序列。

采用上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.2由212个氨基酸组成，蛋白分子量为24.28kDa，等电点(pI)为6.17，包含1个最长、最完整的开放阅读框，其中有一个始于47aa的单一型核定位信号“DNGCKRKREQ”，对MfbHLH104氨基酸序列进行结构域分析发现，bHLH域位于66aa～119aa处，可以看出MfbHLH104具备bHLH结构域，属于bHLH类转录因子。

包含上述密罗木MfbHLH104基因的质粒。

包含上述密罗木MfbHLH104基因的重组表达载体。

包含上述密罗木MfbHLH104基因的转基因细胞系。

包含上述密罗木MfbHLH104基因的工程菌。

一种基因芯片，包括上述密罗木基因MfbHLH104。

上述密罗木基因MfbHLH104、质粒、重组表达载体、工程菌或基因芯片在植物抗旱改良过程中的用途。

上述密罗木基因MfbHLH104、质粒、重组表达载体、工程菌或基因芯片在植物抗盐改良过程中的用途。

本发明的有益效果为：

1.获得了对干旱有较高耐受性的转基因拟南芥。

2.密罗木基因MfbHLH104能在干旱脱水期快速响应，为利用该基因提高其他植物的干旱和盐耐受性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1为本发明的密罗木基因MfbHLH104的同源序列比对结果；

图2为本发明的密罗木基因MfbHLH104的系统进化树；

图3为实施图4的植物表达载体；

图4为35S：pGSA1403-MfbHLH104重组质粒的构建图；

图5为转MfbHLH104基因植株的阳性鉴定结果；

图6为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；其中，图6a为野生型和转基因拟南芥幼苗植株在氯化钠胁迫处理后的植株根系生长状态；图6b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；

图7为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态；其中，图7a为野生型和转基因拟南芥幼苗植株在模拟干旱胁迫处理后的植株根系生长状态；图7b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态；

图8为野生型和转基因拟南芥植株离体叶片失水率测定；

图9为野生型和转基因拟南芥植株的脯氨酸含量测定；

图10为野生型和转基因拟南芥植株的气孔测定；其中，图10a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状检测图；图10b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔闭合度统计图；

图11为野生型和转基因拟南芥植株的叶绿素测定；

图12为野生型和转基因拟南芥植株在胁迫下丙二醛(MDA)含量的测定；

图13为野生型和转基因拟南芥植株在胁迫下可溶性蛋白含量的测定；

图14为野生型和转基因拟南芥植株在胁迫下CAT酶活性的测定；

图15为野生型和转基因拟南芥植株在胁迫下SOD活性的测定；

图16为野生型和转基因拟南芥植株在胁迫下POD活性的测定。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1：提取密罗木MfbHLH104基因

1、取密罗木叶片，液氮速冻，放置-80℃冰箱中保存以备提取总RNA；总RNA提取采用成都兰博生物公司购买的Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒来提取；cDNA的合成使用大连宝生物科技公司的Reverse Transcriptase M–mLV(RNaseH-)，按其产品说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F：5’-TCCCCCGGGATGGAGTCTTTTGGGGACAG-3’(SEQ ID NO.3)和R：5’-GACTAGTCTAAGCAACTGGAGGTCTAA-3’(SEQ ID NO.4)为引物，添加的酶切位点分别为F：SamI和R：SpeI，利用PCR以cDNA为模板进行扩增，扩增体系见表1，扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

表1 PCR扩增体系

试剂	用量
		DNA	100～150ng
引物F	5pmol
		引物R	5pmol
Taq plus聚合酶	1U
		10×PCR缓冲液	2.5μL
Mg²⁺	1.5mM
		ddH₂O	Up to 25μL

2、PCR结束后进行电泳分析，采用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收约639bp的扩增片段，将扩增片段连接到Peasy-T1 Simple克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到成都擎科生物科技有限公司测定密罗木基因MfbHLH104的编码序列，其序如SEQ ID NO.1所示，再利用ORF Finder软件将所得基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：密罗木MfbHLH104的序列同源与同源性分析

根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆得到的基因序列与bHLH家族转录因子同源关系最近。将该转录因子与其它bHLH转录因子家族成员的蛋白序列进行比对，使用SMART对MfbHLH104氨基酸序列进行结构域的分析，bHLH域位于66aa～119aa处，可以看出MfbHLH104具备bHLH结构域，属于bHLH类转录因子(如图1)；进一步利用比对的同源性较高物种的氨基酸序列构建系统进化树(如图2)，发现密罗木MfbHLH104与其他物种的亲缘关系较远，其结构域较为保守。

实施例3：密罗木基因MfbHLH104植物表达载体的构建

将上述经测序正确的菌液提取质粒，含MfbHLH104基因的克隆载体质粒经SamI和SpeI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收DNA片段，将此片段与相应酶切的pGSA1403表达载体(如图3)相连，获得的载体命名为35S：pGSA1403-MfbHLH104，载体构建过程及结果如图4。

实施例4：MfbHLH104基因的遗传转化

将农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰上解冻，取5μL重组质粒35S:pGSA1403-MfbHLH104于200μL感受态中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水浴5min，冰上放置2min后加入800μL LB液体培养基，在恒温培养箱中29℃，120r/min，培养2～4h。将上述菌液均匀涂布在含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，然后挑取单菌斑接种于5mL LB液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养24h。取1mL上述菌液转入50mL含10μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于28℃，250r/min，振荡培养至OD₆₀₀≈1.5；将上述OD值达标的菌液4℃，8000r/min离心10min收集菌体，弃掉上清，用等体积的5％蔗糖溶液将菌体重悬，在菌液中加入Silwet-77并混匀，使溶液浓度达到0.02％且菌液OD₆₀₀≈0.8。

转化前需剪掉成熟的果荚，让植株浸入农杆菌细胞悬浮液2min，将浸好的植株暗处理24h后于光照培养箱中正常培养，一周后可重复浸染一次。待种荚黄化后收种，记为T0代。继续将T0代拟南芥种子放入含有50μg/mL卡那霉素的培养基里，转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。因此筛选出能正常生长且颜色呈深绿色的植株，对深绿色植株提取DNA并进行PCR检测阳性(如图5)，获得T₁代转基因植株，重复筛选步骤直至筛选出阳性过表达纯系植株。

实施例5：转基因拟南芥的胁迫处理

对于幼苗处理：将野生型和过表达T3代纯系(Line-A，Line-B，Line-D)分别播种于配置含NaCl(50mM，75mM，100mM)、甘露醇(200mM，250mM，300mM)的1/2MS培养基中，对照组只添加正常成分，记为control。每个方形培养皿中对照和三种株系分成两排点播，每种15株左右，每个处理重复三次，4℃暗处理2d后移入光照培养箱中垂直放置，继续培养2周，在根系分析仪下拍照并测量根长。

对于成株的处理：将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(Line-A，Line-B，Line-D)种子播种在花钵中，培养4周左右，选择长势一致的植株进行抗逆性分析。

盐胁迫处理：对照组不作处理，记为control，其余组每隔3天浇一次300mM的氯化钠处理液，持续观察WT与过表达植株表型差异并拍照记录(如图6)，每个株系播种10株于一个花钵，记为1个重复，3次重复。

干旱胁迫处理：对照组(记为control)正常浇水管理，其余组均不浇水使其自然干旱失水，期间持续观察并拍照记录植株生长状况(如图7)。每个株系播种10株于一个花钵，记为1个重复，3次重复。

盐胁迫下的幼苗表型如图6，其中，图6a为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的植株及根系生长状态；图6b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态。干旱胁迫下的幼苗表型如图7，其中，图7a为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的植株及根系生长状态；图7b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态。

通过研究野生型与过表达拟南芥幼苗根系和成株在干旱及氯化钠胁迫下的表型，发现过表达MfbHLH104基因株系Line-A，Line-B和Line-D对干旱及盐的耐受性均强于WT，说明过表达MfbHLH104基因提高了拟南芥对盐及干旱胁迫的耐受性。

实施例6：相关生理指标的测定

(1)拟南芥的培养

将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(Line-A，Line-B，Line-D)种子播撒在50孔穴盘内(已等量分装好营养土并浇足水)，继续培养4周左右。

(2)失水率的处理及测定

将穴盘中培养的WT，Line-A，Line-B，Line-D浇足水分，剪取莲座叶对其取样，在天平上用定量滤纸称取WT及三个株系叶片各0.5g，此时叶片含水量为初始含水量，记为m0，此后将叶片放入恒温光照培养箱中让其自然干旱(25℃，60％相对湿度)，在1h，2h，3h，4h，5h，6h分别称取叶片即时重量。结果(如图8)。

(3)脯氨酸含量的测定

在天平上准确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内用少量蒸馏水溶解后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg；取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，用蒸馏水定容至刻度并混匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5，6μg/mL。

拟南芥的培养同步骤(1)，生长4周后对WT，Line-A，Line-B，Line-D进行10％的PEG6000干旱处理和300mM氯化钠的盐处理，分别处理5d后，取正常条件和经过PEG6000和氯化钠处理的WT，Line-A，Line-B，Line-D植株叶片鲜样各0.5g，加入少许石英砂和少许3％的磺基水杨酸溶液在研钵中磨碎，倒入10mL离心管并定容至10mL，4500r离心3min。取上清液并用3％的磺基水杨酸溶液定容至10mL。吸取2mL提取液至一洁净干燥玻璃试管中，加入2mL酸性茚三酮和2mL冰乙酸，100℃加热1h，放入冰水中终止反应，加入4mL甲苯，充分振荡15～20s，静置分层后用移液枪轻轻吸取上层红色溶液于比色皿中，以甲苯为对照，在分光光度计520nm波长处比色并求得吸光度值，此步骤重复两次。3次重复，结果如图9所示。

(4)甘露醇处理下气孔开度的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，取WT，Line-A，Line-B，Line-D的莲座叶叶片，每个株系撕取5块下表皮，置于100mL的MES-KCl缓冲液(50mM KCl，0.1mM CaCl₂，10mM MES，pH6.15)中光诱导2.5h，然后每个株系取5块下表皮分别置于100mL不含甘露醇以及含300mM甘露醇的MES-KCl缓冲液(50mM KCl，0.1mM CaCl₂，10mM MES，pH6.15)中光下处理2h，处理完后放在荧光显微镜(10*40)下观察，气孔闭合程度(宽与长的比)作为统计气孔开度的指标，每个表皮随机选取4个视野，每个视野随机测量5个气孔，共统计100个气孔。3次重复，结果如图10所示，其中，图10a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状检测图；图10b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔闭合度统计图。

(5)盐胁迫下叶绿素含量的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-A，Line-B，Line-D浇灌200mM氯化钠溶液处理2天，随后分别取正常生长和经氯化钠处理的WT，Line-A，Line-B，Line-D植株叶片鲜样各0.5g，将叶中脉剪掉并剪碎叶片，加入到50mL的棕色容量瓶中，分别加入95％乙醇提取液50mL，将容量瓶加塞放入25℃的恒温培养箱中暗提取48h。因为95％乙醇提取液在波长为649nm和665nm处具有最大吸光值A649和A665，所以用紫外分光光度计测量A649和A665，以95％乙醇提取液作为空白对照，此步骤重复两次。3次重复，结果如图11所示。

(6)胁迫下MDA含量的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-A，Line-B，Line-D进行10％PEG干旱处理和300mM氯化钠溶液的盐处理，处理5d后取正常条件和经过PEG和氯化钠处理的WT，Line-A，Line-B，Line-D植株叶片鲜样各0.3g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加8mL 10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。取4支干净试管，编号，3支为样品管(三个重复)，各加入提取液2mL，1支为对照管，对照管加蒸馏水2mL，然后各管再加入2mL 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液注入酶标板中放入酶标仪，分别在532、600和450nm波长下测定吸光度(A)值。按公式计算MDA的含量，3次重复，结果如图12所示。

(7)胁迫下可溶性蛋白含量的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-A，Line-B，Line-D进行10％PEG干旱处理和300mM氯化钠溶液的盐处理，处理5d后取正常条件和经过PEG和氯化钠处理的WT，Line-A，Line-B，Line-D植株叶片鲜样各0.3g，用5mL磷酸缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释)，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查找蛋白质的含量。3次重复，结果如图13所示。

(8)胁迫下CAT酶活性的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-A，Line-B，Line-D进行10％PEG干旱处理和300mM氯化钠溶液的盐处理，处理5d后取正常条件和经过PEG和氯化钠处理的WT，Line-A，Line-B，Line-D植株叶片鲜样各0.3g，吸取50μL的酶液，并分别加入2.5mL的混合反应液，以PBS为对照调零，240nm比色，每隔一分钟测一次，一共测三次。按公式计算CAT活性，3次重复，结果如图14所示。

(9)胁迫下SOD活性的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-A，Line-B，Line-D进行10％PEG干旱处理和300mM氯化钠溶液的盐处理，处理5d后取正常条件和经过PEG和氯化钠处理的WT，Line-A，Line-B，Line-D植株叶片鲜样各0.3g，取型号相同的试管，吸取40μL的酶液，并分别加入3mL的混合反应液，同时取两支试管作对照，一支加入40μL磷酸缓冲液+3mL混合反应液作空白对照，一支40μL磷酸缓冲液+3mL混合反应液用锡箔纸包好避光以作测定时调零。将试管置于光照培养箱中4000Lux，25℃下反应20min。以黑暗处理下的试管调零，测定各反应液560nm下吸光度值。SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％作为一个酶活性单位(u)，按公式计算SOD活性，3次重复，结果如图15所示。

(10)胁迫下POD活性的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-A，Line-B，Line-D进行10％PEG干旱处理和300mM氯化钠溶液的盐处理，处理5d后取正常条件和经过PEG和氯化钠处理的WT，Line-A，Line-B，Line-D植株叶片鲜样各0.3g，取40μL酶液+3mL反应液于试管中混匀，对照管加入40μL磷酸缓冲液+3mL反应液。在OD＝470nm下每隔1min读数一次，共读三次，以每分钟内△A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)，按公式计算POD活性。3次重复，结果如图16所示。

Claims

1.一种密罗木基因MfbHLH104，其特征在于，所述基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

2.采用权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求1所述密罗木MfbHLH104基因的质粒。

4.一种包含权利要求1所述密罗木MfbHLH104基因的重组表达载体。

5.一种包含权利要求1所述密罗木MfbHLH104基因的工程菌。

6.一种基因芯片，其特征在于，包括权利要求1所述的密罗木基因MfbHLH104。

7.权利要求1所述的密罗木基因MfbHLH104、权利要求3所述质粒、权利要求4所述重组表达载体、权利要求5所述工程菌或权利要求6所述基因芯片在拟南芥抗旱改良过程中的用途。

8.权利要求1所述的密罗木基因MfbHLH104、权利要求3所述质粒、权利要求4所述重组表达载体、权利要求5所述工程菌或权利要求6所述基因芯片在拟南芥耐盐改良过程中的用途。