CN103951740A - 狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1及其编码基因和应用。本发明从狗牙根中克隆了CCAAT转录因子的cDNA序列CdtNF-YC1，并将获得的CdtNF-YC1基因与植物表达载体连接，构建了重组表达载体，用构建的重组表达载体转化植物组织，然后培育成转基因植株。CdtNF-YC1基因受脱水，盐胁迫和脱落酸刺激的诱导；本发明提供了利用CdtNF-YC1基因培育耐逆境植物的方法，将该基因在植物过量表达后，提高了转基因植物的耐旱性和耐盐性。

Description

狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1及其编码基因和应用。 

背景技术

环境中的非生物胁迫，例如干旱、盐碱、冷害和热害等影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，也影响林木、果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长和品质，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。然而，植物耐逆性是一个数量性状，涉及至少几百个基因的作用，因此从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。 

转录因子是指能够和真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白或能够与这些蛋白发生相互作用的相关蛋白质，即指能够特异性的激活或抑制转录的关键因子。真核核转录Y因子(Nuc1ear Factor Y,NF-Y)是特异性结合启动子区域CCAAT的转录因子。CCAAT盒与TATA盒以及GC盒一样，是真核生物中最广泛分布的启动子序列之一。该类转录因子参与各类细胞生命活动的重要过程，调控与发育、分化和代谢相关的众多重要基因的表达(Mantovani R.The molecular biology of the CCAAT-binding factor NF-Y[J].Gene,1999,239(1):15-27.)。NF-Y结构上由A、B、C三个亚基(subunit)聚合而成，三亚基蛋白各自的功能结构域在真核生物间极其保守。 

植物NF-Y基因还参与干旱胁迫、盐胁迫、内质网胁迫以及ABA诱导的响应。超表达拟南芥NF-YB1或玉米NF-YB2能够提高转基因植株的抗旱性(Nelson D E,Repetti P P,Adams T R,et al.Plant nuclear factor Y(NF-Y)B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2007,104(42):16450-16455.)。拟南芥NF-YA5和小分子RNA mir169组成的调控网络在拟南芥适应干旱胁迫中起关键作用(Li W X,Oono Y,Zhu J,et al.The Arabidopsis NFYA5transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance [J].The Plant Cell,2008,20(8):2238-2251.)。超表达NF-YA1提高拟南芥的耐盐性(Li Y J,Fang Y,Fu Y R,et al.NFYA1Is Involved in Regulation of Postgermination Growth Arrest Under Salt Stress in Arabidopsis[J].PloS ONE,2013,8(4):e61289.)。NF-YA4与NF-YB3/NF-YC2二聚体相互作用，响应来自内质网的信号，参与蛋白正确折叠的调控(Liu J X,Howell S H.bZIP28and NF-Y transcription factors are activated by ER stress and assemble into a transcriptional complex to regulate stress response genes in Arabidopsis[J].The Plant Cell,2010,22(3):782-796.)。目前，NF-Y在植物抗逆方面的功能研究还不多，许多NF-Y家族的成员表达量都受到了一些胁迫的调控，但是其具体的功能还需进一步研究。拟南芥NF-YC2基因受强光、过氧化氢、干旱和高温等逆境诱导，超表达NF-FC2的转基因拟南芥没有提高抗逆性，却导致早花表型(Hackenberg D,Keetman U,Grimm B.Homologous NF-YC2subunit from Arabidopsis and tobacco is activated by photooxidative stress and induces flowering[J].International Journal of Molecular Sciences,2012,13(3):3458-3477.)。 

狗牙根是一种非常抗旱的草坪草种，因其繁殖力强，抗旱，耐践踏，质地纤细，色泽好等优点，被国内外广泛用于建植公共绿地、运动场及固土护坡。从狗牙根中克隆抗逆基因，能为转基因育种提供更为优良的目的基因，而且对于农林植物抗逆分子育种尤为重要和迫切。 

发明内容

为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的是提供一种狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1。 

本发明的另一目的在于提供编码上述的狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的基因。 

本发明的再一目的在于提供上述狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的应用。 

本发明的目的通过下述技术方案实现： 

一种狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1，其氨基酸序列如下所示： 

MEPSSQPQPAMGVAAGGSQVYPASAYPPAATIAAAPAGAPPGSQPVQPFPANPAQMSSQHRLVYQQAQQFHQQLQQQQQRQLQQFWAERLADIEQTTDFKNHSLPLARIKKIMKADEDVRMISAEAPVVFAKACEIFILELTLRSWMHTEENKRRTLQKNDIAAAITRTDIYDFLVDIVPRDDMKEEGVGLPRAGVPPIGGPAD AYPYYYMPQQQMAGAGMVYGGQQGHPVTYMWQEPHEQQERQGAEEQRSLHESG； 

编码所述的狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的核苷酸序列如下所示： 

ATGGAACCATCCTCTCAACCTCAGCCTGCGATGGGTGTTGCTGCTGGTGGATCACAAGTGTATCCTGCCTCTGCCTATCCACCTGCAGCAACAATAGCCGCCGCCCCTGCAGGTGCACCTCCCGGTTCACAGCCGGTGCAGCCATTCCCAGCCAACCCGGCTCAGATGAGCTCTCAGCATCGGCTTGTATATCAGCAAGCCCAGCAATTTCACCAACAGCTCCAGCAGCAGCAACAGCGGCAACTCCAGCAGTTCTGGGCTGAACGCCTGGCTGACATTGAGCAGACCACTGACTTCAAGAATCACAGTTTGCCGCTTGCAAGAATAAAGAAGATTATGAAGGCTGATGAGGATGTCCGCATGATCTCAGCCGAAGCTCCTGTCGTGTTTGCGAAAGCTTGTGAGATCTTCATACTGGAGCTGACACTGAGGTCATGGATGCATACTGAGGAGAATAAGCGGAGGACCTTGCAGAAGAACGACATTGCTGCTGCTATCACTAGGACCGACATTTACGACTTCTTGGTGGACATTGTTCCCAGGGATGATATGAAGGAGGAGGGTGTTGGGCTTCCTAGGGCTGGGGTGCCACCCATTGGAGGCCCGGCTGATGCGTACCCGTACTACTACATGCCGCAGCAGCAGATGGCAGGTGCAGGAATGGTGTACGGTGGCCAGCAGGGTCATCCAGTGACGTATATGTGGCAGGAGCCTCACGAGCAGCAGGAGCGGCAGGGTGCTGAAGAGCAGCGATCTCTGCATGAAAGTGGCTGA； 

所述狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1在提高植物抗旱性和耐盐性中的应用，该应用包括用CdtNF-YC1基因和植物表达载体构建含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体；用含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植株； 

所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体以及用于单子叶基因枪转化的载体；所述的双元农杆菌载体包括pBI121、pCAMBIA系列载体；所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应mRNA加工或基因表达的DNA片段； 

构建含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可使用任何一种强启动子或诱导型启动子；所述强启动子或诱导型启动子包括但不限于泛素(Ubiqutin)启动子和花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外，构建含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体时，还可使用增强子，这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码 子和邻接区域。起始密码子必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。 

为了便于对转基因植株进行鉴定及筛选，可对所使用的植物表达载体进行加工，包括加入或替换植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或具有抗性的抗生素标记物；所述的除草剂包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 

含有CdtNF-YC1基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。 

所述的含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体转化植物组织可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化，显微注射、电穿孔等各种常规或特异的遗传转化方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是单子叶植物或双子叶植物。 

一种含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体，是通过将上述核苷酸序列与植物表达载体连接得到的； 

所述的植物表达载体优选为pYLox.5； 

所述含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体的制备方法，包含以下步骤： 

(1)引物设计 

引物①为CdtNF-YC1扩增上游引物ZG971： 

5’-AAGACAAACAAGAGCTGAGATGGA-3’； 

引物②为CdtNF-YC1扩增下游引物ZG972： 

5’-AATTAGCTAACGAGAACCTGAAGTTT-3’； 

引物③为引入kpn I酶切位点的上游引物ZG1289： 

5’-AAGGTACCCAAGAGCTGAGATGGAACCATCC-3’； 

引物④为引入BamHⅠ酶切位点的下游引物ZG1290： 

5’-GAGGATCCGAATTCAGTGATATGCTAAATGTG-3’； 

(2)CdtNF-YC1基因片段的获得： 

以狗牙根的cDNA为模板，使用引物①和引物②扩增CdtNF-YC1基因片段，并与pGEM-T easy载体连接，构建获得pGEM-CdtNF-YC1载体； 

(3)含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的构建： 

以pGEM-CdtNF-YC1载体为模板，使用引物③和引物④使CdtNF-YC1基因 片段引入kpn I和BamHⅠ两个酶切位点，并与植物表达载体pYLox.5连接，进而构建获得含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1； 

步骤(2)中所述的狗牙根优选为狗牙根(Cynodon dactylon×Cynodon transvaalensis)品种Tifeagle。 

一种表达狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的转基因植株，是通过将上述含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体转化植物组织，并将转化的植物组织培育成转基因植株得到的。 

所述的植物优选为水稻； 

所述表达狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的转基因植株的制备方法，包含如下步骤： 

(1)用电转的方法将重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1导入根瘤农杆菌EHA105中，获得含有重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的农杆菌阳性菌落； 

(2)将活化的含有重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的农杆菌EHA105浸染水稻愈伤组织，经共培养和抗生素筛选，获得转基因水稻。 

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 

(1)本发明从狗牙根中克隆了CCAAT转录因子的cDNA序列CdtNF-YC1，该CdtNF-YC1基因的表达受干旱、盐和ABA诱导。 

(2)本发明将获得的CdtNF-YC1基因与植物表达载体连接，构建了适合于单子叶植物的重组表达载体，并转化单子叶模式植物水稻，转基因植株明显提高了抗旱和耐盐性。 

(3)本发明提供了利用CdtNF-YC1基因培育耐逆境植物的方法。 

附图说明

图1是重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的表达框示意图。 

图2是CdtNF-YC1基因开放阅读框序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；泳道1是CdtNF-YC1基因的扩增片段。 

图3是重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；泳道3、5是阳性重组子；泳道1、2、4、6是阴性重组子；P是阳性对照。 

图4是脱水、盐处理和脱落酸(ABA)诱导CdtNF-YC1基因表达的结果分析柱状图，其中，(A)是脱水对CdtNF-YC1基因转录的影响，(B)是盐处理对CdtNF-YC1基因转录的影响，(C)是ABA对CdtNF-YC1基因转录的影响；柱 上方的字母a、b、c、d和e表示不同处理之间的差异显著(P≤0.05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示差异显著。 

图5是导入CdtNF-YC1基因的转基因水稻的PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图，其中，W表示野生型；P表示pYLox.5-CdtNF-YC1载体，为阳性对照；编号OE1～10表示不同的转CdtNF-YC1基因水稻。 

图6是6个导入CdtNF-YC1基因的转基因水稻的Southern杂交、实时定量PCR结果分析图，其中，WT表示野生型；编号OE3～10表示不同的转基因水稻；(A)是Southern杂交，(B)是实时定量PCR检测；柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著(P≤0.05)。 

图7是导入CdtNF-YC1基因的转基因水稻抗旱性检测结果分析图，其中，(A)是干旱处理后各个植系的相对含水量；(B)是干旱处理后各个植系的相对电导率；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之间的差异显著(P≤0.05)。 

图8是导入CdtNF-YC1基因的转基因水稻耐盐性检测结果分析图，其中，(A)是盐处理后各个植系的相对含水量；(B)是盐处理后各个植系的叶绿素含量；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之间的差异显著(P≤0.05)。 

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

狗牙根(Cynodon dactylon×C.transvaalensis)品种Tifeagle(Lu S,Wang Z,Peng X,et al.An efficient callus suspension culture system for triploid bermudagrass(Cynodon transvaalensis×C.dactylon)and somaclonal variations[J].Plant cell,tissue and organ culture,2006,87(1):77-84.)，购于句容市神州草坪苗木基地。 

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105：购自北京天恩泽基因科技有限公司。 

水稻(Oryza sativa L.)种子：品种为中花11(陈远玲,张群宇,简玉瑜,等.利用反义基因沉默策略构建水稻突变体库及突变体筛选[J].华南农业大学学报,2004,25(4):53-57)，由华南农业大学遗传工程实验室提供。 

pYLox.5超表达载体:由华南农业大学遗传工程实验室提供(Zhou H,Liu Q,Li J,et al.Photoperiod-and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA[J].Cell Research,2012,22(4):649-660.)。 

大肠杆菌DH5α：购自上海超研生物科技有限公司。 

实施例1CdtNF-YC1基因的克隆 

一、狗牙根cDNA模板制备 

狗牙根取自华南农业大学增城试验基地，移苗至混合培养基质(泥炭土：珍珠岩＝3：1(体积比)中栽培，于温室中进行培养，温度28℃/25℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(光/暗)，湿度75％，光照强度800μmol·m^-2·s^-1；对其进行定期修剪并施以适量的复合肥(N：P：K＝15：15：15)溶液；待材料生长均匀一致后用于试验处理，取狗牙根的成熟叶片，用Trizol方法提取总RNA，用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)反转录获得cDNA模板，-20℃保存备用。 

二、扩增CdtNF-YC1基因引物 

根据GenBank数据库禾本科植物NF-YC2基因的cDNA序列，进行同源性比对，在此基础上设计扩增狗牙根CdtNF-YC1cDNA开放阅读框(由Invitrogen合成)的引物。扩增CdtNF-YC1的上游引物ZG971，序列为：5’-AAGACAAACAAGAGCTGAGATGGA-3’；扩增CdtNF-YC1的下游引物ZG972，序列为：5’-AATTAGCTAACGAGAACCTGAAGTTT-3’； 

三、扩增获得CdtNF-YC1基因并构建载体 

用上述步骤一制备的模板和步骤二设计的引物进行PCR扩增： 

PCR反应体系(50μL)：KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO公司，1U·μL^-1)1μL，10×buffer5μL，dNTPs(10mmol·L^-1)5μL，MgSO₄(25mmol·L^-1)2μL，上游引物(10μmol·L^-1)1.5μL，下游引物(10μmol·L^-1)1.5μL，反转录第一链cDNA2μL，ddH₂O补足至50μL； 

PCR反应程序：PCR反应程序：94℃3min；94℃0.5min，55℃0.5min，72℃0.5min，35个循环；72℃10min；扩增产物以质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测(图2)； 

获得一条长约900bp的序列(图2)，将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收； 

将PCR回收片段与pGEM-T easy(TaKaRa)按摩尔比3:1的比例进行连接，反应体系如下：pMD18-T Vector(0.03pmol)1μL，回收的目的片段0.1pmol～0.3pmol，补水到5μL，再加入5μL的Solution I，16℃连接2h，获得连接产物； 

大肠杆菌感受态细胞的制备：用接种环取保存于-80℃超低温冰箱的大肠杆菌DH5α菌液，在SOB固体培养基上划板，于37℃培养箱内培养过夜；挑取大 肠杆菌DH5α单菌落接种于1mL的SOB液体培养基中，在37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养约6h，接种于200mL SOB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD₅₅₀＝0.6；以2500rpm离心10min收集菌体，加入预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌；重复用预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌，最后将细菌分装，于-80℃保存备用； 

连接产物热激转化大肠杆菌：将连接产物加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min；42℃热激90s后，再在冰中放置2min；热激后的菌体转入1mL SOC液体中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养1h。取100μL菌液涂布于含IPTG和X-gal的LB固体(含100μg/mL Amp)培养基上，于37℃培养箱内倒置培养过夜。 

重组质粒pGEM-CdtNF-YC1的筛选、纯化及测序：呈蓝斑的菌落不含插入片段，仅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR检测。挑取PCR阳性菌落，接种于2mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜；吸取2mL菌液，用质粒DNA纯化试剂盒(Qiagen公司)提质粒，4℃保存备用。纯化的重组质粒命名为pGEM-CdtNF-YC1，送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果如下： 

AAGACAAACAAGAGCTGAGATGGAACCATCCTCTCAACCTCAGCCTGCGATGGGTGTTGCTGCTGGTGGATCACAAGTGTATCCTGCCTCTGCCTATCCACCTGCAGCAACAATAGCCGCCGCCCCTGCAGGTGCACCTCCCGGTTCACAGCCGGTGCAGCCATTCCCAGCCAACCCGGCTCAGATGAGCTCTCAGCATCGGCTTGTATATCAGCAAGCCCAGCAATTTCACCAACAGCTCCAGCAGCAGCAACAGCGGCAACTCCAGCAGTTCTGGGCTGAACGCCTGGCTGACATTGAGCAGACCACTGACTTCAAGAATCACAGTTTGCCGCTTGCAAGAATAAAGAAGATTATGAAGGCTGATGAGGATGTCCGCATGATCTCAGCCGAAGCTCCTGTCGTGTTTGCGAAAGCTTGTGAGATCTTCATACTGGAGCTGACACTGAGGTCATGGATGCATACTGAGGAGAATAAGCGGAGGACCTTGCAGAAGAACGACATTGCTGCTGCTATCACTAGGACCGACATTTACGACTTCTTGGTGGACATTGTTCCCAGGGATGATATGAAGGAGGAGGGTGTTGGGCTTCCTAGGGCTGGGGTGCCACCCATTGGAGGCCCGGCTGATGCGTACCCGTACTACTACATGCCGCAGCAGCAGATGGCAGGTGCAGGAATGGTGTACGGTGGCCAGCAGGGTCATCCAGTGACGTATATGTGGCAGGAGCCTCACGAGCAGCAGGAGCGGCAGGGTGCTGAAGAGCAGCGATCTCTGCATGAAAGTGGCTGAGATGTGTCGCGCACATTTAGCATATCACTGAATTCAGGATTTCTCGTTTTAGGTTGCCTAAACTTCAGGTTCTCGTTAGCTAATT 

测序结果与文库的序列进行比对，证明所扩增出的PCR产物为CdtNF-YC1基因。编码所述的逆境诱导的核转录因子CdtNF-YC1的基因由878个碱基组成，其中CdtNF-YC1的蛋白质编码区(Sequence coding for amino acids in protein，CDS)由20位～793位的774个碱基组成，编码257个氨基酸。 

实施例2重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的构建 

根据实施例1获得的CdtNF-YC1开放阅读框序列，设计带有kpn I和BamHⅠ酶切位点的扩增引物： 

引入kpn I酶切位点的上游引物ZG1289：5’-AAGGTACCCAAGAGCTGAGATGGAACCATCC-3’； 

引入BamH I酶切位点的下游引物ZG1290：5’-GAGGATCCGAATTCAGTGATATGCTAAATGTG-3’； 

以实施例1构建的克隆载体pGEM-CdtNF-YC1为模板，以ZG1289和ZG1290为上下游引物，进行CdtNF-YC1基因PCR扩增，纯化回收扩增获得的CdtNF-YC1基因片段。 

将上述获得的CdtNF-YC1基因片段和pYLox.5表达载体分别用限制性内切酶kpn I(TaKaRa公司)和BamHⅠ(TaKaRa公司)双酶切，分别回收CdtNF-YC1基因目的片段和酶切后载体大片段，连接后，将CdtNF-YC1基因插入到表达质粒pYLox.5Ubi启动子下游多克隆位点的kpn I和BamHⅠ之间，构建获得重组表达载体，将构建获得的重组表达载体命名为pYLox.5-CdtNF-YC1，其中，图1是重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的表达框示意图。 

通过PCR检测，证明获得了重组子(图3)。进一步对插入片段测序，结果表明，插入片段的序列与CdtNF-YC1编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1，重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的表达框示意图如图1。 

实施例3CdtNF-YC1受逆境诱导的表达情况 

一、获得逆境条件下的狗牙根模板 

狗牙根，2009年4月取自华南农业大学增城试验基地，移苗至混合培养基 质(泥炭土：珍珠岩＝3：1)中栽培，于温室中进行培养，温度28℃/25℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(光/暗)，湿度75％，光照强度800μmol·m^-2·s^-1。对其进行定期修剪并施以适量的复合肥(N：P：K＝15：15：15)溶液，待材料生长均匀一致后用于试验处理； 

脱水处理 

狗牙根叶片脱水处理：取狗牙根的叶片，置于超净工作台(上海锦屏仪器公司，型号：SW-CJ-2)内，变压器调至75V，室内温度为28℃，对样品进行吹风模拟干旱处理(Yang J,Guo Z.Cloning of a9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene(SgNCED1)from Stylosanthes guianensis and its expression in response to abiotic stresses[J].Plant cell reports,2007,26(8):1383-1390)，分别于0h、0.5h、1h、2h、3h和5h后取样，取样时剪取叶片，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用。 

盐处理 

选取长势一致的狗牙根，每盆浇500mL的0.2M NaCl溶液，分别处理0h、0.5h、1h、3h、6h和12h后取样，取样时剪取成熟叶片，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用； 

外源ABA处理 

选取长势一致的狗牙根，剪取植株叶片，置于去离子水1h，然后移到含100μM的脱落酸(ABA)溶液，分别于处理0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h后取成熟叶片。用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用； 

将以上存放于-80℃冰箱中保存备用的样品取出放于液氮中，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂(TaKaRa公司)提取叶片的总RNA，采用PrimeScript^TM RT reagent Kit(TAKaRa公司)进行反转录制备获得cDNA模板； 

二、设计特异检测引物 

根据CdtNF-YC1基因cDNA序列和狗牙根β-actin的序列，用Beacon Designer7.0软件设计出检测用定量引物： 

CdtNF-YC1基因的上游定量引物ZG1637：5’-AAGATTATGAAGGCTGATGAG-3’； 

CdtNF-YC1基因的下游定量引物ZG1638：5’-TCCACCAAGAAGTCGTAA-3’； 

β-actin基因的上游定量引物ZG1603：5’-CTCTTCCAGCCATCCAT-3’； 

β-actin基因的下游定量引物ZG1604：5’-CTCATACGGTCAGCAATG-3’； 

三、定量PCR检测表达差异 

将步骤一制备的模板cDNA稀释50倍用于定量PCR的模板，反应体系为10μL：SYBR Premix Ex Taq(2×)5μL，上游和下游引物(10μM)各0.5μL，cDNA模板1μL，无菌水3μL；使用仪器为Bio-Rad公司生产的Mini Option Real-Time PCR System，PCR反应条件设置为：95℃10s；94℃5s，59℃25s，40个循环；以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以持家基因β-actin作为内参基因；反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95％以上，利用Bio-Rad CFX Manager(version1.6)软件自动计算基因的相对表达量； 

实时定量PCR的结果显示，CdtNF-YC1表达在脱水处理1h开始受到诱导，并在2h表达量最高，此后表达量逐渐降低(图4A)；CdtNF-YC1基因表达在盐处理0.5h后开始受到诱导，此后表达量逐渐降低(图4B)；CdtNF-YC1基因表达在基因表达在ABA处理0.25h后开始受到诱导，并在12h表达量最高(图4C)；结果表明，脱水、盐和ABA都能诱导CdtNF-YC1基因的表达。 

实施例4转基因水稻的产生及分子检测 

一、转基因水稻的产生 

1、将重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1导入根癌农杆菌EHA105 

EHA105感受态的制备参考J.萨姆布鲁克(黄培堂,王嘉玺,朱厚础.J萨姆布鲁克,DW拉塞尔,著[J].分子克隆实验指南,2002:27-30)的方法并加以改进：取EHA105菌种于MYB平板上划线，28℃培养48h，挑取单菌落，接种于50mL液体SOC中，28℃培养过夜，吸取0.5mL菌液，接种于500mL液体SOC中，28℃培养8h，至OD₆₀₀为0.6，冰浴冷却10min，倒入经灭菌的200mL离心管中，平衡后4℃4000rpm离心10min，收集菌体，倒去SOC，倒置于灭过菌的纸巾上，控干水分，加入50mL预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：MYB液体培养基)，于冰上摇动，悬浮菌体，4℃4000rpm离心15min，收集菌体，重复洗涤一次，加入2mL预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：MYB液体培养基)，悬浮菌体，分装，25μL/管，加液氮速冻后于-80℃冰箱保存。把感受态细胞置于冰上解冻，将0.2cm内径的电击杯置于冰上预冷，在超净工作台内，将1.5μL pYLox.5-CdtNF-YC1质粒(20ng/μL)加至20μL解冻的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴1min后，转移至电击杯中，置于电击仪(MicroPulser， Bio-RAD公司)的电极间，选定程序Agr，进行电击；电击结束后，在超净工作台内，迅速将1mL YEB液体培养基倒入电击杯，再用移液枪转移至摇菌管中，28℃轻柔振荡培养2h；吸取0.3mL菌液，涂布在YEB平板(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)上，28℃培养箱内倒置培养48h； 

2、含重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1农杆菌阳性菌落的鉴定 

挑取平板上的单菌落进行菌落PCR检测，并做好标记；进一步挑取PCR阳性菌落至3mL YEB液体培养基(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡培养40h；取2mL菌液用碱裂解法抽提质粒，用限制性内切酶kpn I(TaKaRa公司)和BamHⅠ(TaKaRa公司)进行酶切检测，确定阳性克隆中含有植物表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1；取0.8mL农杆菌液，加0.2mL体积分数为80％的甘油(甘油：MYB液体培养基)，混匀后保存于-80℃超低温冰箱备用。 

3、转基因水稻植株的获得 

(1)水稻愈伤组织的诱导和继代 

选取饱满健康的水稻中花11成熟种子去皮，用体积分数为70％的酒精浸泡1min，蒸馏水洗1次，再用质量分数为0.1％的升汞溶液封口处理15min，期间在摇床上不断摇动；然后在超净工作台中，倒掉升汞，灭菌蒸馏水洗5次，放在3张灭菌的大滤纸上晾干；最后，灭菌种子均匀平放于NB诱导培养基上，25℃黑暗条件下诱导愈伤组织；诱导的种子暗培养25天，当见到淡黄色颗粒状愈伤长出后，把愈伤组织接于继代培养基上继续诱导愈伤； 

(2)农杆菌的活化与悬浮 

取含有重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的农杆菌EHA105贮存液，在YEB平板(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)上划线，28℃培养；挑分离良好的单菌落，接种于2mL液体YEB(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡暗培养24h；吸取菌液20μL，涂布于含同样抗生素的YEB平板上，28℃倒置暗培养36h；将新长出的农杆菌刮下来，用MS液体培养基悬浮稀释，使OD₆₀₀为0.08； 

(3)侵染、共培养及转基因苗的产生 

在超净工作台内，将提前干燥好的愈伤组织和农杆菌侵染液按一定比例混合(应保证农杆菌侵染液淹没愈伤组织)，再加入一定量的乙酰丁香酮，终浓度为100μM，然后在摇床上，150rpm，28℃黑暗侵染20min。在超净工作台内，倒出侵染液，将愈伤组织置于多层灭菌滤纸的小平皿上干燥约10min，再将愈伤组织转移到有3层灭菌滤纸的大平皿上，在风机下吹，干燥约2h，然后将愈伤组织接 到有一张新灭菌滤纸的固体共培养基上，在风机下吹，再干燥2h；经干燥处理过的愈伤组织，于超净工作台内，在风机下吹0.5h后，分别接入筛选培养基，然后封口，于25℃下暗培养2周，共筛选2次； 

抗性愈伤的预分化和分化：挑选生长状态好的抗性愈伤接入预分化培养基，于25℃，光暗交替下(16h/8h)培养，直到长出新愈伤，预分化约为4周。将有绿点的愈伤组织移至分化培养基中继续分化出苗。 

(4)转基因水稻的生长 

待分化苗长至3～5cm时，将其从分化培养基中转移到100mL的三角瓶生根壮苗培养基中，25℃光暗(16h/8h)交替培养4周，直到长出新的根。如果苗生长良好，新的根长得比较快，则可以提前移栽练苗。当幼苗根部长出新的长根时，将幼苗从培养基中移出，并把根部的培养基冲洗干净，分单株移栽到盆中。用木村B水稻营养液，在自然光照强度条件培养3周。最后移入土中进行，于温室外自然条件培养。 

二转基因水稻的PCR检测 

1.微量法快速提取DNA 

取1.5mL离心管盖般大小的叶片于1.5mL离心管，加入400μL预热到80℃的提取液(200mM Tris-HCl pH8.0，250mM NaCl，25mM EDTA，质量分数为0.5％的SDS溶液)，用小研锤在1.5mL离心管中充分研磨，70℃水浴10min，然后在冰上放置2min；13000rpm离心1min，取300μL上清液，加等体积异丙醇，混匀，室温静置5min；13000rpm离心2min，弃尽上清液；DNA沉淀风干后溶于50μL TE(1M NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)，保存于-20℃冰箱； 

2.转基因水稻的PCR检测 

由于侵染植物的载体pYLox.5在其左右边界区内还带有homomycin(HPT)抗性基因，因此使用能特异识别该基因的引物ZG599(5’-CGAAATTGCCGTCAAC CAAGCTCT-3’)和ZG600(5’-CAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCT-3’)来检测目的基因是否成功转入到植物基因组；以上一步骤微抽得到的DNA为模板进行PCR扩增，以pYLox.5-CdtNF-YC1重组质粒为阳性对照。反应体系(20μL)：TaqDNA聚合酶0.1μL、PCR10×buffer2μL、dNTP(10mM)1.6μL、ZG599(10μM)0.5μL、ZG600(10μM)0.5μL、DNA1μL(pYLox.5-CdtNF-YC1质粒20ng)、ddH₂O14μL；PCR反应程序：94℃2min；94℃0.5min，57℃0.5min，72℃30s，35个循环；72℃5min。质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 

三转基因水稻的Southern杂交 

1.基因组DNA的提取 

取1g水稻嫩叶，置液氮中研磨成粉末，转移至50mL离心管，立即加入6mL预热到70℃的1.5×CTAB提取液(质量分数为1.5％的CTAB，75mM Tris-HClpH8.0，1M NaCl，15mM EDTA)，涡漩振荡10sec，混匀；70℃水浴1h，间断混匀；水浴结束，加入5mL氯仿，旋紧管盖，上下颠倒混匀10min，5000rpm离心15min；用剪去尖端的1mL枪头小心吸取上清液至50mL离心管，并记录体积，加入1/10体积的质量分数为10％CTAB溶液，摇匀；加入4/5体积的氯仿，上下颠倒混匀10min，5000rpm离心15min；用剪去尖端的1mL枪头小心吸取上清液至50mL离心管，并记录体积，加入等体积的沉淀液(质量分数为1％的CTAB，50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA)，轻柔上下颠倒混匀，室温放置15min(或55℃水浴10min)沉淀DNA；5000rpm离心10min，小心倒掉上清液，再6000rpm离心1min，用移液枪吸尽上清液；加入2mL高盐TE(1M NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)和5μL10mg/mL的RNAase(用10mM Tris-HCl pH7.5和15mM NaCl溶液配制，经过100℃水浴15min灭活DNA酶)，在55℃摇床中轻摇至沉淀完全溶解(30～40min)。加入2倍体积的无水乙醇，轻柔地上下颠倒混匀；用枪头钩出絮状DNA，在体积分数为70％的乙醇中漂洗，然后移至1.5mL离心管。短暂离心，弃上清液，适当风干沉淀，用0.1～0.2mL TE(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)溶解沉淀。取2μL稀释10倍的DNA溶液，用质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的质量，测OD₂₆₀nm和OD₂₈₀，确定DNA的纯度和浓度； 

2.DNA酶切、电泳及转膜 

具体操作参考DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ(Roche)使用说明书。电泳结束后将胶简单冲洗后进行变性和中和，再用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到尼龙膜Hybond N+(Amersham公司)上；将膜放在用20×SSC湿润的滤纸上，进行紫外交联，800s，2次；用双蒸水简单漂洗后晾干，用保鲜膜包好，做好标记，保存于4℃备用； 

3.探针的制备与标记 

以引物ZG599和ZG600，pYLox.5-CdtNF-YC1重组质粒为模板扩增出潮霉素基因的部分序列，用TaKaRa凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)纯化回收PCR产物作为杂交的探针模板，并电泳定量，用DIG-High Prime对探针进行标记；参考说明书方法向一个反应管中加入1μg模板DNA和高压灭菌的双蒸水，终体积16μL； 沸水浴10min以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中；取4μL DIG-High Prime加入到变性DNA中，混合并简单离心，37℃孵育过夜，然后65℃加热10min终止反应； 

4.Southern杂交 

膜放到已经用10×SSC浸透的Whatman3MM滤纸上，紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，将10mL适量体积的杂交缓冲液(10mL/100cm²滤膜)提前预热到杂交温度(37～42℃)。将NC膜放入杂交缓冲液中在杂交炉中预杂交1h；将3制备的探针放入沸水浴中煮5min后快速放入冰水混合物中冷却，将变性的地高辛标记探针加入到预热的地高辛杂交缓冲液(每100cm²的膜加入3.5mL杂交缓冲液)中，充分混合；倒出预杂交液，加入探针杂交液的混合物，42℃杂交炉中孵育过夜。用2×SSC，0.1％SDS连续振荡洗涤两次，每次5min，20℃；在80mL封阻液中孵育45min，在20mL抗体溶液中孵育30min，用100mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min，在20mL检测缓冲液中平衡5min；将膜平放在保鲜膜上，均匀滴加500μL CSPD显色液，铺上一层保鲜膜，由内向外轻轻摊平显色液，并挤掉多余的显色液，用纸吸掉；将弄好的膜放于暗室5min，后置于37℃中避光1h，成像软件扫描成像； 

采用PCR法检测(使用引物对ZG599和ZG600)转基因水稻，阳性植株能扩增出500bp的特异带，与以植物表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1(阳性对照)为模板扩出的特异带大小一致，而野生型对照植物不能扩出该特异带(图5)，证明CdtNF-YC1基因已导入到转基因水稻中； 

Southern杂交结果显示，在野生型水稻中没有HPT基因的特异杂交信号，转基因水稻植株中有HPT基因的特异杂交信号，表明CdtNF-YC1基因已整合到转基因水稻的基因组中(图6A)； 

用实时定量PCR检测了CdtNF-YC1基因在水稻的表达，结果表明，转基因水稻中能检测出CdtNF-YC1基因的mRNA，而不能从野生型水稻检测出来(图6B)。 

实施例5转基因水稻的抗旱性和耐盐性鉴定 

一、抗旱性测定 

将转基因水稻及其野生型水稻植株幼苗种于同一桶中，在玻璃房内生长40天后，停止浇水10天。当观察到野生型植株表现出明显萎焉时，收集倒二片叶片测量相对含水量(relative water content，RWC)及电导率(Ion leakage)。 

测定方法为： 

剪下叶片后立刻称鲜重，然后将它们放在烧杯中，暗中放置24h后称饱和重，之后于鼓风烘箱中在80℃恒温下烘干48h，称干重；3次重复，取平均值为该次取样植物叶片的相对含水量；计算公式：RWC(％)＝(鲜重一干重)/(饱和重一干重)×100％。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值； 

将叶片放入含20mL去离子水的三角瓶内，4℃过夜，用电导仪测定溶液电导值(C1)；将三角瓶移到沸水浴中保温20min，冷却至室温，再次用电导仪测定溶液电导值(C2)；通过公式(C1/C2)×100计算相对电导率。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值； 

从图7可以看到，经过10d的干旱处理后，转基因水稻的相对含水量比野生型的高，而相对电导率比野生型的低。这说明在干旱胁迫下，相比野生型植株，转基因水稻提高了抗旱性。 

二、耐盐性测定 

将转基因水稻及其野生型种于同一桶中，在玻璃房内生长40天后，用100mM的NaCl溶液处理了15d后，统计绿叶面积及取相同叶位的叶片测量相对含水量(relative water content，RWC)和叶绿素含量。 

测定方法为： 

剪下叶片后立刻称鲜重，然后将它们放在烧杯中，暗中放置24h后称饱和重，之后于鼓风烘箱中在80℃恒温下烘干48h，称干重，3次重复，取平均值为该次取样植物叶片的相对含水量。计算公式：RWC(％)＝(鲜重一干重)/(饱和重一干重)×100％。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值； 

选取相同部位的叶片0.1g，加入2mL乙醇和石英砂研磨，再用3mL乙醇冲洗一次，定容到10mL刻度试管。放置过夜，中间颠倒混匀一次。在663、645nm波长下测定吸光度值，记为D663、D645，叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量，分别用Ca、Cb和Ct表示，单位为mg/L。根据Lamber-Beer定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：Ca＝12.72*D663–2.59*D645，Cb＝22.88×D645–4.68×D663，Ct＝Ca+Cb＝8.02×D663+20.29×D645。叶绿素含量(mg/g叶)＝Ct(mg/L)×提取液总量(L)×稀释倍数/材料鲜重(g)。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值； 

其结果如图8所示，经过15天的盐处理后，转基因水稻的相对含水量和叶绿素含量比野生型高，这说明在盐胁迫下，相比野生型植株，转基因水稻受到的伤害比野生型转基因水稻小，提高了耐盐性。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (10)

1.一种狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1在提高植物抗旱性和耐盐性中的应用。

4.根据权利要求3所述的狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1在提高植物抗旱性和耐盐性中的应用，其特征在于：

该应用包括用CdtNF-YC1基因和植物表达载体构建含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体；用含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植株。

5.一种含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体，其特征在于：是通过将权利要求2所述的核苷酸序列与植物表达载体连接得到的。

6.根据权利要求5所述的含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体，其特征在于：所述的植物表达载体为pYLox.5。

7.权利要求6所述的含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)引物设计

引物①为CdtNF-YC1扩增上游引物ZG971：

5’-AAGACAAACAAGAGCTGAGATGGA-3’；

引物②为CdtNF-YC1扩增下游引物ZG972：

5’-AATTAGCTAACGAGAACCTGAAGTTT-3’；

引物③为引入kpn I酶切位点的上游引物ZG1289：

5’-AAGGTACCCAAGAGCTGAGATGGAACCATCC-3’；

引物④为引入BamHⅠ酶切位点的下游引物ZG1290：

5’-GAGGATCCGAATTCAGTGATATGCTAAATGTG-3’；

(2)CdtNF-YC1基因片段的获得：

以狗牙根的cDNA为模板，使用引物①和引物②扩增CdtNF-YC1基因片段，并与pGEM-T easy载体连接，构建获得pGEM-CdtNF-YC1载体；

(3)含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的构建：

以pGEM-CdtNF-YC1载体为模板，使用引物③和引物④使CdtNF-YC1基因片段引入kpn I和BamHⅠ两个酶切位点，并与植物表达载体pYLox.5连接，进而构建获得含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1；

所述狗牙根为狗牙根品种Tifeagle。

8.一种表达狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的转基因植株，其特征在于：是通过将权利要求5或6所述的含有CdtNF-YC1基因的重组表达载体转化植物组织，并将转化的植物组织培育成转基因植株得到的。

9.根据权利要求8所述的表达狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的转基因植株，其特征在于：所述植物为水稻。

10.权利要求9所述的表达狗牙根CCAAT转录因子CdtNF-YC1的转基因植株的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)用电转的方法将重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1导入根瘤农杆菌EHA105中，获得含有重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的农杆菌阳性菌落；

(2)将活化的含有重组表达载体pYLox.5-CdtNF-YC1的农杆菌EHA105浸染水稻愈伤组织，经共培养和抗生素筛选，获得转基因水稻。