CN109797157B

CN109797157B - 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用

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Publication number: CN109797157B
Application number: CN201811174607.6A
Authority: CN
Inventors: 黄小三; 高浚芝; 刘月; 邢才华; 赵粱怡; 张绍铃; 王春孟; 金玉妍; 陶书田; 吴巨友; 吴俊�; 谢智华
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2018-10-09
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2038-10-09
Also published as: CN109797157A

Abstract

本发明提供了一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92，属于植物基因工程技术领域，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明从杜梨中筛选到一种能够提高植物抗非生物逆境能力的转录因子PbrbHLH92，其编码的蛋白质属于核蛋白。试验表明，本发明提供的抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92在植物抗旱、抗盐胁迫能力中起到重要作用，并且能够提高植物对于脱落酸的敏感性，在多种非生物逆境对抗中具有重要作用。本发明将所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92转入到烟草或杜梨中，所得的转基因植物与野生株相比能够有效增强转基因植株的活性氧清除能力，有效提高了转基因烟草的抗旱性能。

Description

一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用。

背景技术

梨属植物全世界约30多个种，其中起源于我国的有13个种，野生梨种在我国分布广泛，我国各个省都有梨树的栽培。所谓东方梨就是栽培中国梨的总称，为我国栽培分布最广的树种。我国梨树的栽培面积和产量均居世界首位。梨优势产区的布局与规划极大地促进了我国梨产业的发展，但正是因为分布广泛，所以选育新品种便成为了梨产业发展最至关重要的因素。由于其很容易受到各种环境因素的的影响，如干旱、涝害、盐碱等。因此，是否能培育出优良的抗逆性强的梨新品种至关重要。梨在育种方面存在诸多困难，如遗传背景复杂、童期长、自交不亲和、育种目标不可确定性等原因，这使得常规的育种方法不能满足现代梨栽培生产的品种需求。因此，怎样在较短的时间内培育出能用于梨产区生产栽培所需的抗逆性强及性状优良的新品种，已经成为当代育种科学家急需解决的一道难题。随着植物组织培养技术与植物生物技术的迅速进步，植物新品种的选育又有了新的途径，如组织培养技术育种、遗传转化育种、体细胞杂交等方法。利用植物基因工程技术对植物的性状进行改良，使得梨抗逆新品种的高效准确培育成为了可能。

干旱对植物的影响非常严重，它可以表现在植物生长发育的各个阶段，如种子萌发、营养生长和生殖生长，直到开花结实。同时影响各种生理代谢过程，如光合作用、呼吸代谢、水分和营养元素的吸收运转、各种酶的活性和有机物质的转化、运输、积累等。

当植物受到干旱胁迫后会导致植物体内出现多种不良反应，如细胞内活性氧的积累及渗透压的变化等。干旱胁迫通常能触发植物基因表达增强或减弱、代谢产物增加或减少、特异蛋白合成等应答活动。在干旱胁迫的情况下，植物为抵御干旱胁迫，其细胞内可以大量地合成甜菜碱、脯氨酸、海藻糖、甘露醇等渗透性的有机小分子物质，以期增加细胞的渗透势，缩小与周围环境的渗透势差，从而使植物避免因高渗透势差导致细胞过度失水死亡。植物能通过积累多胺类化合物，如腐胺、亚精胺、精胺，来应答干旱胁迫。植物主要通过积累多胺类化合物、细胞内活性氧的清除、细胞内渗透压的调节来提高植物的抗旱性。

bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子是一种广泛地存在于动植物中的转录因子家族，是植物中最大的转录因子家族之一，具有重要的生物学功能。目前，报道的植物基因组中bHLH转录因子数目已经超过了动物的bHLH转录因子数量(Pires et al,2010)，其中，在主要的农作物中发现的bHLH转录因子已超过630个(Carretero et al,2010)。利用基因组学、生物信息学等方法，对包括模式植物在内的重要物种进行研究中，发现了拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻(Oryza sativa L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)和葡萄(Vitis vinfera L.)中分别有164个、180个、190个和至少191个bHLH转录因子(Xionget al,2005；Rushton et al,2008；Jaillon et al,2007)。虽然bHLH转录因子数量庞大，但是真正地验证了其功能的基因则很少。植物bHLH转录因子在植物的生长发育、抗逆性和信号转导等方面发挥着极其重要的作用(Ledent et al,2001；Heim et al,2003；Toledo etal, 2003；Xu et al,2010)。

bHLH转录因子是一类含有basic helix-loop-helix(bHLH)结构域的转录因子。bHLH 结构域约含60个氨基酸，分为碱性区域(basicregion)和α螺旋1-环-α螺旋2(helix-loop-helix) (Ma et al,1994)。碱性区域由15-20个氨基酸组成，能与DNA结合，其保守氨基酸可识别E-box(5'-CANNTG-3')；同时，81％的bHLH可识别G-box(5'-CACGTG-3')元件(Toledo et al,2003；Li et al,2006)。大多数植物bHLH蛋白与具CACGTG特征的E-box 元件结合(Pires et al,2010)。α螺旋-环-α螺旋结构依赖疏水氨基酸的相互作用能促进蛋白形成同型或异型二聚体，因此，bHLH转录因子常以二聚体的形式发挥作用(Ferre et al,1993)。同时，在紫苏中发现bHLH转录因子Myc-RP的两个位点(K157和A159)的氨基酸对其活性具有重要影响(Pattanaik et al,2008)。

目前对bHLH转录因子的分类主要有两种方式。根据bHLH与DNA结合模式的不同可分为3类(He et al,2004)，分别是能与E-box增强子结合的bHLH、能与N-box抑制子序列结合的bHLH和不能与DNA结合的bHLH。由于植物和动物bHLH转录因子的系谱发生具有相对独立性，在植物中分类存在分歧，Buck和Atchley曾将植物bHLH基因分为15个进化枝，而Heim等和Toeldo-Oritz等分别将拟南芥bHLH基因分为12个主要组和21个家族(Buck et al,2003；Chen et al,2010；Li et al,2008)。2006年，Li等将水稻 bHLH基因分为22个家族，以及Pires和Dolan认为植物bHLH蛋白由26个亚家族组成 (Chen et al,2010；Pires et al,2010；Li et al,2008)。目前，植物bHLH转录因子家族分类未有明确定论，因此各个家族也没有相应的名称。

干旱胁迫的耐受性属于一种复杂的数量性状，植物在感知干旱等非生物胁迫信号过程中，许多干旱胁迫相关基因被诱导表达，其中转录因子是非常重要的一类调控基因，通过调控目标基因的表达来调节植物对各种非生物胁迫的响应(Chen et al,2012)。据报道，NAC、MYB、bHLH、CBF/DREB、AREB/ABF、WRKY、NFYA、HD-ZIP等家族在干旱等非生物胁迫过程中发挥了十分重要的作用(Balazadeh et al,2010)。第一个含有 bHLH结构域的bHLH转录因子是在玉米中发现的，它是参与花青素合成相关的基因 (Ludwig et al,1989)。随后该家族的许多基因陆续从拟南芥、烟草、水稻、小麦等分离出来，并证明bHLH转录因子在植物的生长发育、生物与非生物胁迫响应过程中均发挥了十分重要的作用(李宇伟,等,2012)。

bHLH转录因子在植物应对环境胁迫反应的分子调控过程中起着重要的作用。在植物耐旱方面研究发现，OsbHLH148能够通过参与茉莉酸信号途径对水稻的干旱耐受性起调节作用。当用茉莉酸甲酯(MeJA)或干旱胁迫处理水稻时，OsbHLH148的转录水平迅速增加。过表达该基因会诱导参与逆境应答和茉莉酸信号途径的相关基因表达水平上调，如OsDREB、OsJAZ(能够与OsbHLH148互作)等。这些说明OsbHLH148在干旱胁迫过程中作为一个起始应答因子来调控茉莉酸信号途径相关基因的表达(Seo et al,2011)。另外，在拟南芥中发现bHLH蛋白RD22BP1能够参与ABA信号途径的脱水胁迫反应(Abe et al,1997)。而另一个bHLH转录因子AtMYC2在干旱胁迫条件下对ABA诱导型的基因表达起转录激活作用。过表达At-MYC2的转基因植株不仅对ABA的敏感性增强，而且RD22等ABA诱导型基因在转基因植株中的表达量也都显著增加(Abe et al,2003)。以上结果表明，干旱胁迫下，AtMYC2能够通过ABA信号途径调控RD22等目的基因的表达。在耐盐方面发现一个水稻bHLH基因OrbHLH2，该基因编码蛋白与拟南芥中的ICE1 蛋白有较高的同源性。在拟南芥中过表达OrbHLH2能够增强转基因植株的耐盐性，同时胁迫响应的相关基因(DREB1A/CBF3、RD29A、COR15A和KIN1)在转基因植株中也都上调表达，但是该基因的过表达不能增强植株的耐冷性(Zhou et al,2009)。说明该基因与ICE1参与调控代谢途径不同，而且该基因在响应盐胁迫时不依赖于ABA。上述研究结果表明bHLH转录因子家族参与植物耐逆反应并不是独立的，除了与特定的顺式作用元件结合之外，还参与各种激素信号传导通路，同一个家族的不同成员可能参与不同的激素信号途径来响应逆境胁迫。

根据统计，全世界每年农作物50％的产量损失与非生物胁迫相关，20％的产量损失与病虫害等生物胁迫有关。因此，研究非生物胁迫下的bHLH基因的调控途径及作用机理具有十分重要的意义。根据前人研究发现，在拟南芥、烟草、水稻、小麦、柑橘、苹果等植物中已经被证明，bHLH基因的过表达能提高转基因植株的抗旱性。但是，在梨当中还未曾有过bHLH基因的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92，所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92能够提高植物的抗旱、抗盐能力、提高植物对脱落酸的敏感度，有效地提高植物对于非生物逆境的抗性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1 所示。

本发明提供了一种扩增上述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92的引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供了一种前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种重组表达载体，含有前述技术方案所述的抗非生物逆境转录因子 PbrbHLH92。

优选的，所述重组表达载体以表达载体为基础、在表达载体的多克隆位点插入前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92构建得到。

优选的，所述表达载体选自pMV、pB1101、pB121、pB221、pCAMB1A1300、pCAMB1A1301、pCAMB1A1302、pCAMB1A1303、pCAMB1A1304、pCAMB1A1305、 pCAMB1A2300、pCAMB1A2301、pCAMB1A3300、pCAMB1A3301、pCAMB1A1380、 pCAMB1A1390、LBA4404、EHA103、EHA105或GV3101。

本发明提供了前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92、前述技术方案所述引物对或上述技术方案所述的表达载体在提高植物抗非生物逆境能力中的应用。

优选的，所述抗非生物逆境包括抗干旱和/或抗盐。

优选的，所述抗非生物逆境能力为提高脱落酸敏感性。

优选的，所述植物包括烟草或梨。

有益效果：

本发明提供了一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1 所示。本发明从杜梨中筛选到一种能够提高植物抗非生物逆境能力的转录因子PbrbHLH92，其编码的蛋白质属于核蛋白。试验表明：PbrbHLH92的转录水平在植物受到脱水处理后提高了8倍以上，PbrbHLH92的转录水平在植物受到脱落酸(ABA)处理后提高了30倍以上，PbrbHLH92的转录水平在植物受到盐胁迫处理后提高了10倍以上，表明本发明提供的抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92在植物抗旱、抗盐胁迫能力中起到重要作用，并且能够提高植物对于脱落酸的敏感性，表明本发明提供的转录因子 PbrbHLH92可在多种非生物逆境对抗中具有重要作用。

本发明将所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92转入到烟草或杜梨中，得到的转基因植物中转录因子PbrbHLH92过量表达，所得的转基因植物与野生株相比能够有效增强转基因植株的活性氧清除能力，细胞损伤更小，有效提高了转基因烟草的抗旱性能。

附图说明

图1是本发明的流程示意图；

图2是实施例2中转录因子PbrbHLH92在脱水﹑脱落酸和盐胁迫下的表达示意图；

其中图2A为脱水处理下转录因子PbrbHLH92的转录相对表达量；图2B为脱落酸处理下转录因子PbrbHLH92转录水平的相对表达量；图2C为盐胁迫下转录因子 PbrbHLH92转录水平的相对表达量；

图3是实施例3中本发明转录因子PbrbHLH92亚细胞定位图；

图4是实施例4中表达重组载体的构建流程和载体结构图，其中图4A是重组表达载体的构建流程，图4B是pMV载体结构图；

图5是实施例4中PbrbHLH92转化烟草及植株再生过程示意图；其中图5A是转化后的照片；图5B是在筛选培养基上生长30天的材料；图5C是再生芽诱导生根；图5D 是转基因植株移载土里生长30天的照片；图5E是利用基因特异引物进行PCR鉴定烟草后T0代转基因植株；M：Marker，+：质粒，-：野生型植株，1-6：转基因株系；图5F，实时定量PCR分析烟草不同转基因株系中的PbrbHLH92基因的表达量，选取TG4，TG5 和TG6为超表达系，为后面的抗旱性评估株系；

图6是实施例4中转PbrbHLH92基因烟草株系及野生型(WT)盆栽干旱处理前后的表型和生理指标测定图；

图7是实施例5中PbrbHLH92基因瞬时转化杜梨株系(TG1，TG2和TG3)及野生型植株(WT)室温下干旱处理16天后的表型和生理指标测定图；

图8是实施例4中烟草植株和实施例5杜梨植株，在室温下干旱处理后未转化株系和转化株系组织中过氧化氢含量、抗超氧阴离子自由基含量和丙二醛含量的测定结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1 所示。在本发明中，所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92，能够提高植物的抗旱能力、抗盐能力，还可提高植物对脱落酸的敏感性。本发明所述转录因子PbrbHLH92包含753bp的开放阅读框，编码240个氨基酸，等电点为6.66，分子量为61.82KDa。

本发明还提供一种扩增上述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92的引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

正向引物(SEQ ID No.3)：5’-cgccacatgatcaacgagcgcatgagg-3’；

反向引物(SEQ ID No.4)：5’-caatggaggcacagtattcctctcggct-3’。

在本发明中，所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92的制备方法，优选的包括以下步骤：

以梨的cDNA为模版，以上述技术方案所述转录因子PbrbHLH92的引物对进行PCR扩增，得到抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92。

在本发明中，所述梨cDNA的制备方法优选包括：从梨叶片中提取RNA，将得到的RNA反转录得到cDNA。本发明对所述提取RNA的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规提取植物RNA的方法即可。

在本发明中，所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92优选的来源于杜梨(Pyrusbretschneideri)，引物对是根据基因PbrbHLH92的开放阅读框进行设计得到的。

在本发明中，所述PCR扩增使用的体系优选包括：模板DNA 1μL、PCRbuffer 2μL、dNTD Mix(2.5mmol/L)1.6μL、正向引物和反向引物各0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U) 0.2μL和无核酶水14.4μL。

在本发明中，所述PCR扩增的条件优选包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。

本发明提供了一种前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。ExPASTX分析显示，转录因子PbrbHLH92编码的蛋白质中有一个核定位信号，亚细胞定位表明，转录因子PbrbHLH92编码的蛋白质属于核蛋白。

本发明提供了一种重组表达载体，其中含有前述技术方案所述的抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92。本发明优选的，所述重组表达载体以表达载体为基础、在表达载体的多克隆位点插入前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92构建得到。本发明优选的，所述表达载体包括pMV、pB1101、pB121、pB221、pCAMB1A1300、pCAMB1A1301、pCAMB1A1302、pCAMB1A1303、pCAMB1A1304、pCAMB1A1305、 pCAMB1A2300、pCAMB1A2301、pCAMB1A3300、pCAMB1A3301、pCAMB1A1380、 pCAMB1A1390、LBA4404、EHA103、EHA105或GV3101。本发明对于具体的重组表达载体构建方法无特殊限定，采用已知方法即可。

本发明提供了前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92、前述技术方案所述引物对或上述技术方案所述的重组表达载体在提高植物抗旱能力中的应用。将所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92在转基因植物中过表达后，可有效增强转基因植株的活性氧清楚能力，降低细胞损伤，提高转基因植株在干旱胁迫下的成活率，即提高了植物的抗旱能力。

本发明提供了前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92、前述技术方案所述引物对或上述技术方案所述的重组表达载体在提高植物抗盐能力中的应用。

本发明提供了前述技术方案所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92、前述技术方案所述引物对或上述技术方案所述的重组表达载体在提高植物脱落酸的敏感性中的应用。

在本发明中，所述具体提高植物抗旱、抗盐或脱落酸敏感性的方式为构建转基因植株，使得所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92在转基因植株中过量表达。

在本发明中，所述植物优选包括烟草或梨，所述梨优选为杜梨。

在本发明中，当所述植物为烟草时，所述提高烟草的抗旱能力、抗盐能力以及脱落酸敏感性的方法为构建转基因烟草，具体包括以下步骤：

将所述转录因子PbrbHLH92与pMV表达载体连接，得到重组表达载体；

将所述重组表达载体转入根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；

将所述重组农杆菌侵染烟草。

在本发明中，所述转录因子PbrbHLH92在连接前优选的进行双酶切，所述双酶切反应的体系每20μL优选包括：转录因子PbrbHLH9210μL、10×G缓冲液2μL、KpnⅠ以及SaⅡ各1μL、双蒸水6μL。

在本发明中，所述pMV表达载体在连接前优选的进行双酶切，所述双酶切反应的体系每20μL优选包括：pMV表达载体8μL、10×G缓冲液2μL、KpnⅠ以及SaⅡ各1μL、双蒸水8μL。

本发明优选的将分别经过双酶切的转录因子PbrbHLH92与pMV表达载体进行连接，所述连接时转录因子PbrbHLH92与pMV表达载体的摩尔比优选为3:1，连接时的反应体系每10μL优选包括：10×buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL、双酶切后的转录因子 PbrbHLH924μL、双酶切后的pMV表达载体2μL、双蒸水2μL，所述连接反应优选的在 16℃下进行，连接14～16h后得到连接产物，即所述重组表达载体。

本发明对所述载体的种类没有特殊限定，除pMV表达载体外也可采用其他表达载体，具体构建方法按照本领域常规技术手段调整即可。

本发明对所述重组表达载体转入根癌农杆菌中获得重组根癌农杆菌的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规将载体转入根癌农杆菌的方法即可。

本发明对所述重组农杆菌侵染烟草的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规重组农杆菌侵染烟草的方法即可。

在本发明中，当所述植物为梨时，所述提高梨的抗旱能力、抗盐能力或脱落酸敏感性的方法包括：采用瞬时转化方法将所述转录因子PbrbHLH92转入到梨中。

本发明对所述采用的瞬时转化方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的瞬时转化方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

PbrbHLH92基因克隆及表达分析

1、RNA提取

研究材料杜梨种植在南京农业大学梨工程中心，其苗龄为60天。挑选生长势健壮的杜梨幼苗，随机称取0.1g样品，迅速用液氮进行速冻。RNA的提取采用索来宝公司的总RNA提取试剂盒，具体方法如下：

(1)样品处理：取新鲜或-70℃冻存0.1g组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀，得到匀浆样品；

(2)将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离；

(3)向室温放置后的匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3～5分钟，得到混悬液；

(4)将混悬液在2～8℃、12000rpm的条件下离心10分钟，RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀，得到上清液；

(5)吸附柱前处理：在吸附柱中加入500μL洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

(6)第4步收集的上清液中加入200μL无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃、 12000rpm离心2min，弃废液；

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃、12000rpm离心2min，弃废液；

(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

(9)12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除；

(10)将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100μL的RNase free ddH₂O，室温放置 5min，12000rpm室温离心2min即得到杜梨RNA。

将提取到的杜梨RNA立即于-80℃超低温冰箱中保存以备用。取1～2μL杜梨RNA用于琼脂糖凝胶电泳，用Nano-drop仪进行检测，检测其浓度为300ng/μL。

2、基因扩增

取杜梨RNA 1μg经1U的DNase I 37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μL 50mMEDTA，65℃处理10min后立即置于冰上。cDNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行，将提取得到的杜梨RNA反转录为cDAN。所得的第一链cDNA用于 PbrbHLH92基因的扩增。

PCR扩增引物如下：

正向引物(SEQ ID No.3)：5’-cgccacatgatcaacgagcgcatgagg-3’；

反向引物(SEQ ID No.4)：5’-caatggaggcacagtattcctctcggct-3’。

所述PCR扩增体系为：模板DNA 1μL、PCRbuffer 2μL、dNTD Mix(2.5mmol/L)1.6μL、正向引物和反向引物各0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U)0.2μL和无核酶水14.4μL。

PCR按以下程序完成：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。

扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用康为世纪生物科技有限公司的胶回收试剂盒，并按照使用说明提取步骤，回收特异目的条带。

回收纯化的溶液与pMD19-T载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为3:1连接。反应总体积是10μL，其中5μLbuffer，4.5μL的PCR纯化的产物，0.5μL载体。16℃连接过夜，采用热击法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，采用北京全式金生物技术有限公司生产的大肠感受态，以目的基因序列引物进行PCR验证(与上述基因扩增时的PCR程序一致)并测序(由上海英潍捷基公司完成)。

生物信息学分析cDNA序列显示，PbrbHLH92基因全长753bp，它包括的编码阅读框编码240个氨基酸，等电点为6.66，预测的分子量为61.82KDa。BLASTX分析该序列与已知的(所有已发表的文献和数据库)的植物序列高度同源。ExPASy分析表明编码的氨基酸PbrbHLH92有一个核定位信号。根据氨基酸的多序列比对构建的进化树来看，梨 PbrbHLH92基因同拟南芥AtbHLH92进化上亲缘关系最近。

实施例2不同逆境条件处理下转录因子PbrbHLH92基因的qRT-PCR分析

为了分析杜梨中PbrbHLH92基因对脱水(图2A)、脱落酸(图2B)和盐(图2C)的响应模式，使用Real-time PCR技术对PbrbHLH92基因的表达模式进行分析。

采用试剂盒法提取RNA(RNA提取方法参照实施例1)。cDNA第一链的合成参照北京全式金生物技术有限公司的TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。

定量PCR(qRT-PCR)检测PbrbHLH92基因表达量进行测定：

定量PCR检测时，在20μL的反应体系中有：10μL 2×Mix，0.1μL cDNA，5μL引物 (以ubiqutin为内参引物，长度为208bp)，4.9μL水。

定量PCR的程序如下：

表1定量PCR程序

处理过程如下：

从基质中挖出完整的杜梨幼苗，用蒸馏水将根部清洗干净，使用洁净的滤纸吸干多余水分，以保持幼苗根的完整性，将其放入装有蒸馏水的洁净培养瓶中，置于25℃培养室中预培养24小时。将预培养后的杜梨幼苗分别进行脱水、盐和和脱落酸(ABA) 处理。每个因素处理时，最少选用20株梨苗，采集叶片的方法为随机混合采样，采完样品后，标记，并快速放入液氮中进行速冻，所采样品均保存在-80℃超低温冰箱。

脱水处理：将杜梨幼苗根部水吸干后，置于洁净的滤纸上分别进行脱水处理，取样时间分别为0、1、1.5、3、6、9h；

ABA处理：将预培养后的杜梨幼苗放入100uM的ABA溶液中，取样时间分别为0、1、3、6、9、12h。

盐处理：将预培养后的杜梨幼苗放入200mM/L的氯化钠溶液中，取样时间分别为0、1、9、48、72、96h；盐采用南京于寿德生物科技有限公司购买的固体氯化钠颗粒，规格：AR500g，相对分子量为58.44。

当对植株进行脱水处理时，如图2A所示，PbrbHLH92基因的转录水平在植物受到脱水处理后转录水平逐渐上升，在9h的时候达到最高，是未处理时的8倍多，表明了PbrbHLH92基因对脱水有强烈的响应。

当对植株进行ABA处理时，如图2B所示，PbrbHLH92基因的转录水平在植物受到ABA处理后转录水平逐渐上升，在9h的时候达到最高，是未处理时的30倍多，表明了PbrbHLH92基因ABA有强烈的响应。

当对植株进行盐处理时，如图2C所示，PbrbHLH92基因的转录水平在植物受到盐处理后转录水平逐渐上升，在48h的时候达到最高，是未处理时的10倍多，表明了 PbrbHLH92基因盐有强烈的响应。

可以看出，本发明所述的PbrbHLH92基因可以在多种非生物胁迫中发挥作用，对于提高植物抗旱能力、抗盐能力以及脱落酸敏感性有显著影响。

实施例3转录因子PbrbHLH92基因的亚细胞定位

根据PbrbHLH92基因的核苷酸序列和pJIT166-GFP载体图，在基因序列前后分别加入NCOI和BSTPI酶切位点。酶切位点的序列如下所示：

NCOI：CCATGG

BSTPI：GGTGACC

以杜梨的cDNA为作为模板，用加入酶切位点的引物扩增，加入酶切位点的引物序列如下所示：

D-F1：gccatggccacatgatcaacgagcgcatgagg(SEQ ID No.5)；

D-R1：caggtgaccatggaggcacagtattcctctcggct(SEQ ID No.6)。

加入酶切位点的引物序列的划线部分为添加的酶切位点。基因3′去除了终止密码子 TAG，目的是让基因与GFP融合。

PCR反应体系为：模板DNA 1μL、PCRbuffer 2μL、dNTD Mix(2.5mmol/L)1.6μL、正向引物和反向引物各0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U)0.2μL和无核酶水14.4μL。所用 PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min 30s，35 个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增得到添加NCOI和BSTPI酶切位点的PbrbHLH92基因，所得PCR产物经 1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。回收纯化的扩增片段克隆到 pMD19-T载体中，转化到大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR 鉴定呈阳性的菌液送去测序，提取测序结果正确菌液和pJIT166-GFP载体的质粒。将两者均用SalI和BamHI进行双酶切，分别纯化回收酶切过后的产物PbrbHLH92基因和 pJIT166-GFP载体。两者经T4-DNA连接酶连接，16℃过夜，转化大肠杆菌感受态DH5α，将得到的重组载体命名为pJIT166-GFP-PbrbHLH92。

采用原生质体转化的试剂和方法，所用试剂：拟南芥原生质体酶解液(提前一天晚上配好，4℃保存)：0.4M甘露醇；1％纤维素酶；0.1％离析酶；5mM MES；0.1％果胶酶。

方法：在55℃水浴中加热10min，使各种蛋白酶失活，同时增强纤维素酶等的溶解性，然后冷却到室温，再加入以下两种试剂：0.15％的BSA和8mM CaCl；MaMg溶液： 0.4M甘露醇；0.1％MgCl；4mM MES；W5溶液(现配现用，培养时注意加羧苄抗生素)：154mM NaCl；125mMCaCl；5mM KCl；2mM MES；PEG solution(40％，v/v)：4g PEG 4000(sigma-Fluka，#81240)溶于4mL水中；0.72868g甘露醇加入到3mL水中加入1mL 1M CaCl溶解，如不溶解的话，可以放到65℃助溶。将两者混到一起，完全混匀后，定容到10mL，最后用KOH调pH到7.5-8.0。

通过将pJIT166-GFP-PbrbHLH92和对照空载体pJIT166-GFP的质粒转化到拟南芥的原生质体中，通过检测原生质体中的GFP荧光的位置来确定PbrbHLH92蛋白定位的定位情况，结果如图3所示，绿色荧光分布在细胞核上，而未在其他地方发现绿色荧光。结果表明，PbrbHLH92基因定位在细胞核，是一个核蛋白。

实施例4转录因子PbrbHLH92在提高烟草抗旱性中的应用

1.重组表达载体的构建

取pMV载体(切除GUS基因的植物二元转化载体pBI121)中的多克隆位点和PbrbHLH92基因的编码区序列(如SEQ ID No.1所示)，以KpnI及SalI分别对二者进行双酶切。重组表达载体的构建流程如图4A所示，pMV载体结构如图4B所示。

PbrbHLH92基因的双酶切体系：PCR的纯化产物10μL，10×G缓冲液2μL，KpnI 及SalI各1μL，双蒸水6μL。酶切在37℃中进行，酶切过夜后做胶纯化回收。

pMV载体双酶切反应体积为20μL，其中：有pMV的载体质粒8μL，10×M缓冲液2μL，KpnI及XhoI各1μL，加双蒸水8μL。同样放置于37℃酶切过夜后纯化回收。

在连接反应体系中加入PbrbHLH92基因与载体pMV的摩尔比为3:1，反应总体积为10μL。其中含有：10×buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，双酶切回收的PbrbHLH92基因4μL，双酶切回收的pMV载体产物2μL，双蒸水2μL，在16℃反应14-16h得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养。将筛选出的阳性克隆，调点后摇菌，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为pMV-PbrbHLH92重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pMV-PbrbHLH92导入到农杆菌GV3101中。

2.农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱(-80℃)中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB的平板培养基上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中， 28℃，500rpm/min振荡培养，待菌液浓度达到OD＝0.6-0.8时作浸染；

(2)浸染：取未转基因的烟草叶片，切成0.5×0.5cm大小，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8-10min，期间不断振荡；

(3)共培养：取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上(叶背面向下)，25℃暗培养3天；

(4)筛选培养：经共培养3天后的烟草叶片，用500mg/L浓度的头孢霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗次5-6次，再转移入添加了100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的筛选培养基中；

(5)生根培养：待筛选培养基上的不定芽长到1-2cm左右时，切下并转入添加了100mg/LKm和500mg/L Cef生根培养基上。

(6)烟草苗转入土培：待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于已灭菌的营养土中。烟草转化苗所用培养基见表2。

表2烟草转化苗所用培养基配方

3.转基因阳性苗的的筛选

按照上述方法得到转PbrbHLH92基因烟草，从每株转基因烟草的组织中提取DNA，设计引物并进行PCR扩增鉴定阳性苗。

3.1烟草叶片DNA提取

采用试剂盒提取DNA，试剂盒为康为世纪生产的植物基因组DNA提取试剂盒。操作步骤如下所示：

(1)取植物新鲜组织约100mg或干重组织约20mg，加入液氮充分研磨；

(2)将研磨后的粉末收集到离心管中，加入700μL 65℃预热的Buffer GP1(使用前在预热的Buffer GP1中加入β-巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。注意：本试剂盒可同时纯化DNA和RNA，RNA可能会抑制下游的一些酶促反应，但对PCR反应没有影响。如果需要去除RNA，可加入4μL 100mg/ml的RNaseA溶液(客户自备，货号：CW0601)，震荡15秒，室温放置2分钟，再进行步骤(3)；

(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm(13400×g)离心5分钟；

(4)小心将上层水相转入一新离心管中，加入700μLBuffer GP2，充分混匀；

(5)将上一步所得溶液全部加入Spin Column DM中(Spin Column DM已放入Collection Tube中)，12000rpm(13400×g)离心30秒，弃废液。将Spin Column DM放回Collection Tube中。如不能一次将所有溶液转入，可分两次进行；

(6)向Spin Column DM中加入700μLBuffer GW1(使用前检查是否已加无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，弃废液。将Spin Column DM放回Collection Tube中；

(7)向Spin Column DM中加入500μLBuffer GW2(使用前检查是否已加无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，弃废液，将Spin Column DM放回Collection Tube中；

(8)重复步骤(7)；

(9)12000rpm(13400×g)离心2分钟，弃废液。将Spin Column DM置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的Buffer GW2。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的Buffer GW2去除，Buffer GW2中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)；

(10)将Spin Column DM放到一个新离心管中，加入50-200μL Buffer GE，室温放置2-5分钟，12000rpm(13400×g)离心1分钟，收集DNA溶液，做胶检测。-20℃保存DNA。

3.2阳性转基因植株检测

采用引物基因特异引物进行PCR扩增。反应程序及体系分别见表3、表4。釆用35S+基因右侧内引物进行PCR，选取的转基因株系中，有转基因株系能扩增出预期大小的片段，表明这它们为阳性转基因株系。

表3 PCR反应程序

表4 PCR反应体系

3.3转基因阳性植株的超表达分析

提取移栽成活的5株转基因阳性苗的RNA(RNA提取方法同实施例1)，通过跑胶检测其结构完整，利用Nanodrop测定其浓度后(浓度均在200～600ng/μL)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA(cDNA合成参照实施例1)，再用烟草的Ubiqutin作为内参进行扩增。Ubiqutin引物核苷酸序列为：

Ubiqutin正向引物：5’-AGCTACATGACGCCATTTCC-3’(SEQ ID No.7)；

Ubiqutin反向引物：5’-CCCTGTAAAGCAGCACCTTC-3’(SEQ ID No.8)

用Ubiqutin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，后再用PbrbHLH92特异引物作为模板扩增目的条带，PbrbHLH92引物核苷酸序列为：

PbrbHLH92正向引物：5’-TGAGGATGCTGCAATTCTTG-3’(SEQ ID No.9)；

PbrbHLH92反向引物：5’-AGCTGTGCTTCTGCTTCTCC-3’(SEQ ID No.10)。

PbrbHLH92特异引物与实施例1引物扩增后片段大小不同，实施例1中的引物对是用来在梨cDNA中扩增该基因，因此其扩增后片段较长；PbrbHLH92特异引物则是用来鉴定转化后植株的超表达系鉴定所用，因此设计引物时引用了荧光定量引物的设计方法，且扩增后片段较小，为200bp左右。

如图5所示，根据PbrbHLH92特异引物扩增出来的目的条带的亮度大小，可以判断PbrbHLH92基因在阳性转基因烟草中的表达量，选择其中亮度高的Line3，Line4和Line5，即表达量高的三个超表达株系命名OE5，OE7和OE13作为单独的转基因株系，然后分别作为收种子的母本植株。

4 PbrbHLH92转基因阳性植株抗旱功能的检测

为了鉴定PbrbHLH92转基因烟草是否和抗旱胁迫有关，将对照系和转基因系进行短时间的干旱胁迫和长期的干旱逆境处理。

同一批次收到的PbrbHLH92转基因系(OE5，OE7和OE13)烟草种子和野生型(WT) 种子灭菌处理后分别播于MS筛选培养基和常用的MS无抗培养基上，待幼苗长到2-3 片子叶时，取叶片呈现绿色的幼苗移栽于营养钵中(蛭石:营养土＝1:1)，在温室中培养其幼苗，培养温度为22℃。取每个系35天大的整盆幼苗放在室温下干旱处理15天后，观察其表型，并分别测其组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。结果如图6所示，在处理过程中，3个转基因系(OE5， OE7和OE13)的植株明显比野生型(WT)表现更抗旱。

H₂O₂含量的测定：(1)使用南京建成公司的试剂盒，操作步骤如表5所示。盖上盖，涡旋仪震荡混匀，于室温，3000-3500rpm/min，离心5min，准确吸取0.20mL各管反应液，用移液枪准确地加入到新的96孔酶标板中，使用酶标仪于波长405nm，光径1cm 处，测定各孔吸光度值。(2)组织中H2O2含量(mmol/gprot＝(测定OD值-空白OD 值)/(标准OD值-空白OD值*标准品浓度(163mmol/L)/待测样本蛋白浓度(gprot/L)；

抗超氧阴离子自由基活性的测定：(1)使用南京建成公司的试剂盒，操作步骤如表6 所示。操作完成后用涡旋仪震荡混匀，于室温下静置反应10分钟，用移液枪吸取200μL 各管反应液，将其加入到洁净的96孔酶标板中，于波长550nm处，用酶标仪测定各孔吸光度值。(2)组织中抗超氧阴离子活力单位(U/gprot)＝(对照OD值-测定OD值)/ (对照OD值-标准OD值)*标准品浓度(0.15mg/ml)*1000ml/待测样本蛋白浓度(gprot/L)

MDA含量的测定：(1)使用南京建成公司的试剂盒，操作步骤如表7所示。操作完成后，于涡旋仪震荡混匀，在95℃以上沸水浴20min，反应完成后，取出，用流水冲洗冷却至室温，准确吸取各管0.25mL反应液转移至新的96孔酶标板中，使用酶标仪在520nm 下测定各孔吸光度值(计算时要减去空板读数)。(2)MDA含量(nmol/g)＝(测定OD值 -空白OD值)/(标准OD值-空白OD值*标准品浓度(10nmol/ml)/样本浓度(g/ml)，注：样本浓度＝植物组织重(g)/所加提取液的量(ml)

表5 H₂O₂含量的测定操作步骤

表6抗O₂ ^-活力测定操作步骤

表7 MDA含量的测定操作步骤

在转基因烟草株系中，电导率较低和成活率高表明他们可能具有比WT有更强的抗ROS的能力。那么通过鉴定植株中ROS的积累量便成为必要。将材料在室温下干旱处理后，观察其表型、取样，并分别测其组织中过氧化氢含量﹑抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。

如图8(A-C)所示，将烟草干旱胁迫8天之后，测定了其组织中的过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，野生株系型的过氧化氢含量和丙二醛含量均显著地高于3 个转基因株系，且三个转基因株系组织中的抗超氧阴离子自由基含量高于对照系。这些证据表明，转基因烟草株系在受到干旱胁迫后体内所积累的活性氧残留量较对照系少，细胞损伤更小。进而表明，过表达的PbrbHLH92基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。

实施例5转录因子PbrbHLH92在提高杜梨抗旱性中的应用

1、瞬时转化转录因子PbrbHLH92的杜梨株系的制备，具体方法如下：

选取在人工气候室中生长5周左右的杜梨(Pyrus ussuriensis)用于农杆菌侵染。

(1)于LB培养基(含50mg/Lkanamycin+100mg/Lrifampicin+50mg/Lgentamycin)划线培养带有目的质粒的GV3101农杆菌，挑取农杆菌克隆于5mL LB培养基中28℃培养过夜。

(2)测定农杆菌菌液OD₆₀₀值之后，3000rpm离心10min收集菌液，弃上清。用乙酰丁香酮(acetosyringone)溶液[10mM MES(pH 5.6)+10mM MgCl 2+200uM acetosyringone]悬浮，调整至OD₆₀₀大约为1.0左右，室温静置3h。

(3)将含有目的质粒的农杆菌用于杜梨叶片的注射。

(4)用1ml注射器(去掉针头)，在梨叶片背面注射，标记好注射过的叶片。

(5)将注射过的梨植株放回人工气候室培养6～7天，即可观察瞬时转化的结果。

2、瞬时转化PbrbHLH92基因杜梨的抗旱分析

为了鉴定瞬时转化PbrbHLH92基因的杜梨是否和抗旱胁迫有关，将对照系和瞬时转化系进行干旱处理，干旱处理采用自然控干法，将实验所需材料放在26℃日光灯培养室，光照强度为20500lx，空气温度是44.0％，让其自然干旱控水，待其出现表型时拍照并取样。

将PbrbHLH92基因瞬时转化的杜梨超表达株系(TG1，TG2和TG3)及野生型植株(WT)，在室温下干旱处理16天后的表型和生理指标测定。其中：图7A是室温下干旱处理16天后的表型。图7B是室温下干旱处理16天后电导率测定。图7，C-D是室温下干旱处理16天后叶绿素测定(图7C)及叶绿素提取(图7D)。结果表明，在处理过程中，3个瞬时转化超表达株系(TG1，TG2和TG3)的植株明显比野生型(WT)表现更抗旱(图7)。

3组织中活性氧残留量测定与分析

在转基因株系中(烟草/秋子梨)，电导率较低和成活率高表明他们可能具有比WT有更强的抗ROS的能力。那么通过鉴定植株中ROS的积累量便成为必要。将材料在室温下干旱处理后，观察其表型、取样，并分别测其组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。如图8(D-F)，将杜梨干旱胁迫 16天之后，测定了其组织中的过氧化氢含量、抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，野生株系型的过氧化氢含量和丙二醛含量均显著地高于3个转基因株系，且3个转基因超表达株系组织中的抗超氧阴离子自由基含量高于对照系。这些证据表明，表明转基因系在受到干旱胁迫后体内所积累的活性氧残留量较对照系少，进而表明，过表达的PbrbHLH92 基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。

由上述实施例可知，本发明提供的转录因子PbrbHLH92，经生物学功能验证具有提高植物抗旱能力的作用，过表达所述的转录因子PbrbHLH92能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。烟草和杜梨的转基因超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升，烟草的转基因超表达株系中过氧化氢(H₂O₂)及丙二醛(MDA)的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> Pyrus betulifolia Bunge

<400> 1

atggaccgat acatcctcaa agcattggaa ggtgaatttt tatggtatga tgagagtcct 60

ccggtagtac agaatcaaag tgcttttgtg ccgtacacaa acagacccaa tagtaatcag 120

ctccctaatg gtgtgaccaa atccatgaac atgaccatga ggatgctgca attcttgagg 180

aaaagctggc aacctgcaac tgcaagaaat gaagctggag atgactccaa agaacggggt 240

tttcgccaca tgatcaacga gcgcatgagg agggagaagc agaagcacag ctacttagcc 300

ttgcattcta tgctgcccgc tggaaccagg aatgataaga ataggattgt gcaaatggca 360

acaatgaata ttcagcagct gaagagatct gaggaggagc tgagaaagaa gaacatggag 420

cttgaaacac ttctggtaga aaatgaaaag gagagagtga aacgggcaaa gattaaatta 480

aaggtggcta atcctacatc gggaattgat tctatgttgg aggttcttaa gtgcttgcaa 540

catttgggtt tgaaagccag aaatattagc tctaatttct cactcgagga gttttcagca 600

gagctggaaa ttgagtccaa gattggagcg gcagagatag aagaatatgt gcaagaaaca 660

ctctacgaag ccgagaggaa attgcgtttt ccatttccag gaagccgaga ggaatactgt 720

gcctccattg acactccttt tagatttgac tag 753

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> Pyrus betulifolia Bunge

<400> 2

Met Ala Ala Thr Ile Leu Leu Ala Leu Gly Gly Gly Pro Leu Thr Thr

1 5 10 15

Ala Gly Ser Pro Pro Val Val Gly Ala Gly Ser Ala Pro Val Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Thr Leu Ser

35 40 45

Met Ala Met Thr Met Ala Met Leu Gly Pro Leu Ala Leu Ser Thr Gly

50 55 60

Pro Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ser Leu Gly Ala Gly

65 70 75 80

Pro Ala His Met Ile Ala Gly Ala Met Ala Ala Gly Leu Gly Leu His

85 90 95

Ser Thr Leu Ala Leu His Ser Met Leu Pro Ala Gly Thr Ala Ala Ala

100 105 110

Leu Ala Ala Ile Val Gly Met Ala Thr Met Ala Ile Gly Gly Leu Leu

115 120 125

Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Leu Leu Ala Met Gly Leu Gly Thr Leu

130 135 140

Leu Val Gly Ala Gly Leu Gly Ala Val Leu Ala Ala Leu Ile Leu Leu

145 150 155 160

Leu Val Ala Ala Pro Thr Ser Gly Ile Ala Ser Met Leu Gly Val Leu

165 170 175

Leu Cys Leu Gly His Leu Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ile Ser Ser Ala

180 185 190

Pro Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ala Gly Leu Gly Ile Gly Ser Leu Ile

195 200 205

Gly Ala Ala Gly Ile Gly Gly Thr Val Gly Gly Thr Leu Thr Gly Ala

210 215 220

Gly Ala Leu Leu Ala Pro Pro Pro Pro Gly Ser Ala Gly Gly Thr Cys

225 230 235 240

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccacatga tcaacgagcg catgagg 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caatggaggc acagtattcc tctcggct 28

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccatggcca catgatcaac gagcgcatga gg 32

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caggtgacca tggaggcaca gtattcctct cggct 35

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agctacatga cgccatttcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccctgtaaag cagcaccttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgaggatgct gcaattcttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctgtgctt ctgcttctcc 20

Claims

1.抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92、抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92的引物对或含有抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92的重组表达载体在提高植物抗非生物逆境能力中的应用；

所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述重组表达载体以表达载体为基础，在表达载体的多克隆位点插入所述抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92构建得到；

所述表达载体选自pMV、pB1101、pB121、pB221、pCAMB1A1300、pCAMB1A1301、pCAMB1A1302、pCAMB1A1303、pCAMB1A1304、pCAMB1A1305、pCAMB1A2300、pCAMB1A2301、pCAMB1A3300、pCAMB1A3301、pCAMB1A1380、pCAMB1A1390、LBA4404、EHA103、EHA105或GV3101；

所述抗非生物逆境能力为提高脱落酸敏感性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括烟草或梨。