CN108841841B - 一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用。本发明克隆了番茄转录因子SlbZIP6，并以野生型番茄与超表达SlbZIP6番茄为对象，在高温胁迫下，对番茄的抗逆性表型、脯氨酸含量、丙二醛含量、相对电导率情况以及参与耐热调控的分子机制等进行研究，结果证实SlbZIP6参与了番茄的耐热性调控机制，且超表达SlbZIP6番茄耐热性比野生型更差。检测该基因表达水平，用于番茄耐热育种筛选。本发明可为培育番茄抗热新品种提供分子基础，为通过基因工程手段提高番茄的抗热性开辟一条新途径，同时也为其它农作物的抗高温分子育种和品种改良提供基因资源。

Description

一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的 应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用。

背景技术

高温胁迫是近几年植物遭受的最主要的胁迫因素之一，每年在全球范围内频繁发生，严重的制约了农作物的产量和品质。因此，培育耐高温品种是现代作物育种亟待解决的问题之一。目前，已有很多研究报道了高温对蔬菜作物的不良影响，但是现在高温对番茄影响的报道大多是针对番茄经济性状指标等方面，而有关高温胁迫对番茄的影响及其分子机制的报道还比较少，其分子机制还不清楚有待深入研究。

转录因子是一类通过识别并结合在目标基因上游的启动子区域来调控靶基因的转录表达的蛋白，常常参与植物的生长发育、抗盐、抗干旱、抗病等调控途径。碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)转录因子是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类转录因子，普遍存在于植物、动物及微生物中。已经有研究证实，植物生长、衰老、损伤、花发育、种子成熟等生理生化过程都有bZIP类转录因子的参与，它与植物抵御多种逆境胁迫密切相关，在植物生命活动中起着重要的作用。

最近，Liu等研究发现，过量表达水稻OsbZIP71能够增强水稻的耐盐性和抗旱性(C.Liu et al.2014)。Xu研究表明，和野生型相比，转GmbZIP110基因植株有更强的耐盐能力(Z.Xu et al.2016)。但有关番茄相关基因的研究特别是有关高温胁迫的基因鲜有报道。

因此本发明克隆了番茄转录因子SlbZIP6，并研究了番茄SlbZIP6在高温胁迫下的作用及作用机制。本发明在培育抗热性番茄新品种方面具有实践指导意义，为培育番茄抗热新品种提供分子基础，为通过基因工程手段提高番茄的抗热性开辟一条新途径，同时也为其它农作物的抗高温分子育种和品种改良提供基因资源。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种番茄转录因子基因SlbZIP6，其参与非生物胁迫反应，参与番茄的耐热性调控。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种番茄转录因子基因SlbZIP6，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选的方案，基因SlbZIP6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

通过前期的基因芯片筛选及生物信息学分析，发现了一个番茄bZIP转录因子SlbZIP6参与非生物胁迫反应。本研究在AC⁺⁺番茄中克隆得到SlbZIP6基因，长度为1365bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。生物信息学表明SlbZIP6转录因子编码454个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子量48.61kD。SlbZIP6蛋白不具信号肽序列，不具有跨膜结构域，定位于细胞核中。

本发明的目的之二在于提供一种目的一基因的克隆方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

目的一的基因的克隆方法包括以下步骤：

1)番茄叶片cDNA的提取；

2)以步骤1)提取的cDNA为模板，根据目的一的SlbZIP6基因序列设计引物，进行PCR扩增；

3)回收PCR产物，并测序。

作为优选的方案，上述引物的序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的之三在于提供一种目的一的SlbZIP6基因在番茄抗高温胁迫中的应用，其对于培育抗热性番茄新品种方面具有实践指导意义。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

目的一的番茄转录因子基因SlbZIP6在番茄抗高温育种中的应用，具体为，筛选低表达SlbZIP6的番茄植株，获得更耐高温的番茄的种子。

本发明首先获得超表达SlbZIP6基因的番茄植株和抑制表达SlbZIP6基因的转基因番茄植株。对超表达SlbZIP6基因的番茄植株和野生型AC⁺⁺番茄植株进行42℃高温处理3天。结果野生型AC⁺⁺和转基因株系之间的表型有明显的表型差异，野生型AC⁺⁺在经过高温处理3d后，只有其下部的叶片开始萎蔫失水，植株顶部的叶片生长较正常，叶片依然挺立；然而，超表达SlbZIP6基因的株系，在高温处理3d后，整个植株叶片都萎蔫失水，植株呈现倒伏的状态不再挺立。从个体水平上说明超表达SlbZIP6增加了番茄植株对高温的敏感性。

对SlbZIP6基因参与番茄耐热验证以及参与机制研究主要在电导率、MDA、渗透调节和分子机制等几个方面，验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性，具体结果为：过量表达SlbZIP6增加了高温胁迫下转基因番茄植株的相对电导率和丙二醛的积累以及减少了脯氨酸的积累，以上三种都将导致在高温胁迫下番茄植株受到更大伤害，从细胞水平上验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性。也探索了SlbZIP6调控番茄高温耐受能力的分子机制，从分子水平上验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性。

综上，本发明为通过番茄育种提高番茄的抗热性开辟一条新途径。

本发明的目的之四在于提供一种抗高温番茄的种子，其通过筛选低表达目的一的SlbZIP6基因的番茄植株获得。以达到增加番茄植株对高温的抵抗能力，减轻高温可能对植株造成的伤害的目的。

本发明的目的之五在于提供一种包含目的一的基因的重组载体。

本发明的SlbZIP6基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种抑制转录启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。含有本发明所述SlbZIP6基因的重组载体均属于本发明的保护范围。

本发明的目的之六在于提供一种包含目的一所述SlbZIP6基因的重组菌。

作为优选的方案，上述重组菌为大肠杆菌或农杆菌。

本发明的目的之七在于提供一种包含目的一所述SlbZIP6基因的转基因细胞系。

含有本发明所述SlbZIP6基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌等基因工程产品均属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于：本发明克隆了番茄转录因子SlbZIP6，并研究了番茄SlbZIP6在高温胁迫下的作用及作用机制。本发明在培育抗热性番茄新品种方面具有实践指导意义，为培育番茄抗热新品种提供分子基础，为通过基因工程手段提高番茄的抗热性开辟一条新途径，同时也为其它农作物的抗高温分子育种和品种改良提供基因资源。

附图说明

图1为SlbZIP6基因的克隆检测。

图2为超表达载体大肠杆菌单克隆PCR检测。其中，M:BM2000+DNA Marker；泳道1-7：PCR扩增产物；—：阴性对照。

图3为pHANNIBAL-SlbZIP6大肠杆菌单克隆PCR检测。其中，M:BM2000+DNA Marker；泳道1-10的引物为P7248-F和P7324R。

图4为RNAi载体大肠杆菌单克隆PCR检测。其中，M:BM2000+DNA Marker；泳道1-7的引物为P7416-F和M13F-R，扩增片段大小约为2000bp；泳道8-14的引物为247B-F和P7417-R，扩增片段大小约为1500bp。

图5为番茄转化的过程图。其中，A：共培养；B：愈伤组织；C：生根苗；D：移栽苗。

图6为超表达植株和野生番茄经高温处理后的表型。

图7为高温胁迫下转基因植株相对电导率的变化。

图8为高温胁迫下转基因植株MDA含量变化。

图9为高温胁迫下转基因植株Pro(脯氨酸)含量变化。

图10为SlbZIP6影响抗高温基因的表达分析。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1番茄SlbZIP6基因的克隆

1、PCR扩增

①番茄叶片cDNA为模板。

②使用引物P800-F+/P801-R+，分别为设计的带有限制性酶切位点BamHI酶切位点片段的引物P800-F和SacI酶切位点片段的引物P801-R，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，利用高保真酶PrimeSTAR Max DNA聚合酶通过PCR扩增得到PCR产物。

③PCR反应体系1：

④PCR程序：

2、目的基因电泳检测和胶回收

①1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

②紫外灯下快速切取含目的片段的胶块至1.5ml的离心管1：1(凝胶克数：BindingBuffer的体积ul)加入Binding Buffer。

③60℃温胶熔解，中间颠倒数次至溶胶完全熔解。待溶液冷却至室温后转移至离心柱。

④10000rpm常温离心1min,弃废液。

⑤加入700ul的DNA Washing Buffer,10000rpm常温离心1min,弃废液。

⑥重复上步一次，进一步清洗DNA。

⑦10000rpm常温离心3min

⑧将离心柱开盖后37℃烘箱放置5min以清除残留的乙醇。

⑨将离心柱放入1.5ml离心管，小心加入60℃预热的洗脱液Elution Buffer。

⑩常温下放置2min后10000rpm常温离心2min以洗脱DNA。收集到的DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检测其浓度。

由凝胶电泳检测得到约1365bp大小的片段，如图1所示。

实施例2超表达SlbZIP6基因的番茄植株和抑制表达SlbZIP6基因的番茄植株

1、超表达SlbZIP6基因的表达载体构建

(1)目的基因连接克隆载体

使用引物P800-F+/P801-R+，克隆带有限制性酶切位点的SlbZIP6超表达片段。PCR反应过程与实施例1相同。

采用pEASY-Blunt Cloning Kit(北京全式金生物技术有限公司)进行连接反应,pEASY-Blunt载体为线性化的平末端克隆载体。偶联到载体上DNA拓扑异构酶I可进行高效连接，只需加入获得的目的片段。

①连接体系：

②反应时间：25℃，20min

(2)连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞

①-80℃冰箱取出DH5α感受态大肠杆菌于冰上融解。在感受态处于半融状态时将冰上预冷的连接产物全部加入，小心吸打混匀后冰浴30min。

②迅速42℃热激30S后立即冰浴2min。

③加入500ul LB(不含抗生素)液体培养基，37℃，250rpm震荡培养1h。4000rpm离心5min取出后4000rpm离心5min。

④用移液枪洗去500ul上清液，约留下100ul吸打混匀。将菌液均匀涂布于：LB+8ulIPTG(500mM)+40ulX-gal(20mg/ml)固体培养基上，在恒温培养箱中37℃暗培养12h。

(3)PCR鉴定阳性克隆及测序验证

①挑取白色单克隆至10ul无菌水，混匀。用通用引物M13F和M13R鉴定阳性克隆，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

②PCR体系：

③PCR程序’

④取PCR产品5ul电泳检测。

⑤验证正确的阳性克隆将剩余的保存的8ul菌液接种于10ml:LB+Kan(50mg/L)液体培养基中37℃，250rpm震荡培养过夜。

⑥收集两管600ul菌液加入300ml甘油(60％)，液氮速冻后，-80℃保存菌种。

⑦另外收集剩下约8ml菌液的干菌体两管，一管保存于-20℃用于质粒提取，另一管送到华大基因公司测序。

(4)质粒的提取

测序正确后，将携带阳性重组质粒大肠杆菌的干菌体提取质粒。将产品-20℃保存。

(5)目的基因与PVCT2024载体的连接

①分别用BamHI酶切连入SlbZIP6基因的PEASY-Blunt质粒载体和PVCT2024超表达载体，分别胶回收目的片段后接着用SacI酶切。

BamHI酶切体系：

酶切时间：37℃，8h。

②胶回收纯化以上目的片段

③SacI酶切体系：

酶切时间：37℃，过夜酶切。

④连接SlbZIP6基因的酶切产物和载体PVCT2024酶切产物

将纯化的SlbZIP6酶切片段和PVCT2024-C1载体酶切产物用T4连接酶连接。

连接体系：

连接时间：16℃过夜连接。

⑤连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞

a-80℃冰箱取出DH5α感受态大肠杆菌于冰上融解。在感受态处于半融状态时将冰上预冷的连接产物全部加入，小心吸打混匀后冰浴30min。

b迅速42℃热激60S后立即冰浴5min。

c加入500ul LB(不含抗生素)液体培养基，37℃，250rpm震荡培养1h。

d 4000rpm离心5min取出后4000rpm离心5min。

e用移液枪洗去500ul上清液，约留下100ul吸打混匀。将菌液均匀涂布于：LB+Kan(50mg/L)固体培养基上，在恒温培养箱中37℃暗培养12h。

(6)大肠杆菌阳性克隆的PCR检测及测序

PCR检测引物用P800-F/P801-R。检测结果见图2，除了泳道3没有与目的片段大小一致的PCR产物，其余泳道均有大小约1365bp的PCR产物，因此我们成功获得了正确的重组PVCT2024-SlbZIP6载体。

2、RNAi抑制表达载体的构建

(1)目的基因片段的克隆

方法同实施例1，以设计的带有限制性酶切位点EcoRI酶切位点片段的引物P7380-F和KpnI酶切位点片段的引物P7381-R，引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，克隆带有限制性酶切位点的SlbZIP6片段SlbZIP6-m；同时设计的带有限制性酶切位点XbaI酶切位点片段的引物P7382-F和BamHI酶切位点片段的引物P7383-R，引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，克隆带有限制性酶切位点的SlbZIP6片段SlbZIP6-n。

①PCR反应体系1：

②PCR反应体系2：

③PCR程序：

(2)目的基因与载体pHANNIBAL的酶切与连接

①用EcoRI酶切SlbZIP6-m和载体pHANNIBAL，分别胶回收目的片段后接着用KpnI酶切。

EcoRI酶切体系：

酶切时间：37℃，8h。

KpnI酶切体系：

酶切时间：37℃，过夜酶切。

胶回收纯化以上目的片段。

②连接片段SlbZIP6-m酶切产物和载体pHANNIBAL酶切产物

将纯化的SlbZIP6-m酶切片段和pHANNIBAL载体酶切产物用T4连接酶连接。

连接体系：

连接时间：16℃过夜连接。

③连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞

a-80℃冰箱取出DH5α感受态大肠杆菌于冰上融解。在感受态处于半融状态时将冰上预冷的连接产物全部加入，小心吸打混匀后冰浴30min。

b迅速42℃热激60S后立即冰浴5min。

c加入500ul LB(不含抗生素)液体培养基，37℃，250rpm震荡培养1h。

d 4000rpm离心5min取出后4000rpm离心5min。

e用移液枪洗去500ul上清液，约留下100ul吸打混匀。将菌液均匀涂布于：LB+Kan(50mg/L)固体培养基上，在恒温培养箱中37℃暗培养12h。

④PCR检测大肠杆菌阳性单克隆

方法同上。

⑤提取质粒pHANNIBAL-SlbZIP6-m

⑥用XbaI酶切SlbZIP6-n和质粒pHANNIBAL-SlbZIP6-m，分别胶回收目的片段后接着用BamHI酶切。

XbaI酶切体系：

酶切时间：37℃，8h。

BamHI酶切体系：

酶切时间：37℃，过夜酶切。

胶回收纯化以上目的片段。

⑦连接片段SlbZIP6-n酶切产物和质粒pHANNIBAL-SlbZIP6-m酶切产物

连接体系：

连接时间：16℃过夜连接。

⑧连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞

(3)大肠杆菌阳性克隆的PCR检测及测序

PCR检测引物用P7428-F/P7417-R，引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；P7416-F/P7324-R，引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

pHANNIBAL-SlbZIP6大肠杆菌单克隆PCR检测结果见图3。根据检测结果，得到10个阳性单克隆，除了泳道1和泳道6没有与目的片段大小一致的PCR产物，其余泳道均有大小约1599bp的PCR产物，将含有SlbZIP6基因的片段的pHANNIBAL-SlbZIP6质粒送至华大基因公司测序，测序结果与预期相同，我们成功的构建了pHANNIBAL-SlbZIP6载体。

(4)目的片段与载体PVCT2020的酶切与连接

将含有片段SlbZIP6-m和SlbZIP6-n的载体pHANNIBAL和载体PVCT2020分别用SacI酶切，胶回收片段后用SpeI酶切。

SacI酶切体系：

酶切时间：37℃，8h。

SpeI酶切体系：

酶切时间：37℃，过夜酶切。

胶回收纯化以上目的片段。

连接目的片段酶切产物和载体PVCT2020酶切产物

连接体系：

连接时间：16℃过夜连接。

连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。

(5)大肠杆菌阳性克隆的PCR检测及测序

PCR检测引物用247B-F/P7417-R，P7416-F/M13R。其中247B-F引物序列如SEQ IDNO.15所示。

结果见图4。具体如下，泳道1-7是以P7416-F/M13R为引物的PCR扩增产物，除了泳道2和5以外，其余泳道都有与目的片段大小一致的PCR产物,目的片段大小约为2000bp；泳道8-14是以247B-F/P7417-R为引物的扩增产物，泳道8、10、12和14有与目的片段大小一致的PCR产物，泳道9、11和13均没有大小约1500bp的PCR产物，因此我们成功获得了正确的重组pVCT2020-SlbZIP6载体。

3、农杆菌介导的遗传转化

(1)农杆菌表达载体的转化

将测序正确的大肠杆菌单克隆所对应的LB菌液提取质粒，之后利用冻融法将质粒转化农杆菌LBA4404，并保存菌种。

冻融法质粒转化农杆菌：

①冰上融化农杆菌LBA4404感受态细胞；

②轻轻加入3uL带有目的片段的质粒DNA；

③迅速放进液氮中速冻3min；

④37℃恒温水浴锅内水浴5min；

⑤加入1mLYEB液体培养基，28℃恒温摇床中震荡培养4h；

⑥4000rpm，离心5min，弃部分上清液，剩余菌液吸打混匀，涂布于YEB+Kan(50mg/L)+Str(500mg/L)+Rif(50mg/L)固体培养基上，倒置在28℃恒温培养箱内暗培养2d。

挑取单克隆菌斑到10uL 无菌水中，吸打混匀，取2uL 作为PCR检测反应的模板，剩余8uL保存与4℃冰箱内。超表达载体的检测使用P800-F/P801-R引物，RNAi抑制表达载体的检测使用引物247B-F/P7417-R,M13F/P7416-R进行检测分析。PCR配制体系：

PCR体系：

PCR程序

PCR产物进行电泳检测，并对检测正确的PCR产物所对应的阳性单克隆加入至YEB+Kan(50mg/L)+Str(500mg/L)+Rif(50mg/L)液体培养基中摇菌，并保存菌种。

(2)农杆菌介导的番茄遗传转化

①培养番茄无菌苗：选择籽粒饱满的番茄种子，在超净工作台上用75％的乙醇消毒30s，再用20％次氯酸钠消毒15分钟，最后用无菌水洗涤5～7次。将消毒后的种子，转入1/2MS培养基中。28℃暗培养2～3天之后移入温室培养(26℃16h光照/18℃8h黑暗)。

②番茄外植体的获得及预培养：种子发芽后，待子叶展平时，剪取子叶，在液体培养基(MS+0.2mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+200mg/L KH2PO4)中浸泡切割分段，置于固体培养基(MS+1mg/L IAA+1.75mg/L ZT)上，避光预培养24h-36h，温度26±2℃。

③农杆菌的培养：挑取含载体质粒的农杆菌单菌落，接种于YEB液体培养基(含50mg/L kan、50mg/L Rif、100mg/L Str，简称三抗)中，28℃、225rpm摇床上避光振荡培养至OD600值约为0.6～0.8。取1mL菌液，接种到50ml三抗YEB液体培养基中重新活化避光振荡培养14～16h。

④侵染：把活化的菌液倒入50ml无菌离心管中，4000rpm室温离心10min弃上清后用YEB液体培养基重悬，再4000rpm室温离心10min弃上清后用MS液体培养基(+200mg/LKH2PO4)重悬菌体。在超净工作台上，将预培养后的外植体浸泡于上述MS重悬的农杆菌菌液中10～15min后，取出放于无菌滤纸上吸取外植体上多余菌液。

⑤共培养：将农杆菌侵染过的外植体放回至培养基(MS+1.75mg/L ZT+1.0mg/LIAA)中进行28℃避光培养2d左右。

⑥分化培养：把共培养的外植体转移到分化培养基(MS+1.75mg/L ZT+1.0mg/LIAA+100mg/L Kan+300mg/L Cb)进行26℃16h光照/18℃8h黑暗的分化培养。3周左右换一次培养基，直至形成愈伤组织。

⑦继代生根培养：愈伤组织逐渐分化出抗性芽，将抗性芽剪下转入生根培养基D(MS+100mg/L Kan+300mg/L Cb)，待番茄苗长至5cm高时，将番茄苗剪成1～2段，插入生根培养基，形成株系。

⑧炼苗及移植：幼苗生根后，渐渐揭开封口膜，在培养室内炼苗3～5天，移栽入育苗室。

番茄转化过程图见图5。

实施例3番茄SlbZIP6基因在高温胁迫下的作用及作用机制

1、实验方法

(1)高温处理

试验于西南大学生物科技大楼温室中进行，用五叶一心的番茄植株AC++进行高温处理。

将番茄种子播置于花盆中，等到发芽一个星期左右，挑选长势一致的番茄幼苗移栽到单独的盆中，PCR检测后，阳性植株用于高温处理。转基因T2代株系和野生型对照AC⁺⁺，在番茄五叶一心时，进行高温处理。

(2)表达分析

采样后利用Trizol法提取样品总RNA，经反转录后，利用qRT-PCR进行基因的表达分析。

根据Primer Premier 5.0软件设计引物，在SlbZIP6开放读码框内设计基因引物P7069-F/P7070-R，引物序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示。

以番茄CAC作为内参基因校正，其引物序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。

反应在Bio-Rad CFX96TM荧光定量PCR仪上进行扩增，检测基因的相对表达量。荧光定量PCR反应体系为10μL：SYBR Green(Bio-Rad)5μL，正向反向引物各0.5μL，cDNA模板2μL，超纯水2μL。PCR反应程序为95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火30s，65℃延伸5s，39个循环。每个试验设置3次重复。

(3)植物生理指标的测定

①叶片相对电导率的测定

参照张志良主编《植物生理学实验指导》，取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性,少含茎节),用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分,将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉),快速称取鲜样3份,每份0.1g,分别置于10ml去离子水的刻度试管中,盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h.用电导仪测定浸提液电导(R1),然后沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀,再次测定浸提液电导(R2).相对电导率＝R1/R2×100％。(张志良，1990)。

②叶片中丙二醛(MDA)含量的测定

参照白宝璋(1995)主编的《植物生理生化技术》。称取干旱处理后的叶片0.2g，每个处理重复3次。加入10％TCA匀浆3ml，在4000r/min离心10min。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入3ml 0.5％TBA溶液，混匀后于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心4000r/min离心10min。取上清液测定532nm、600nm和450nm下的吸光度，根据公式计算丙二醛含量。

计算公式：MDA浓度(umol·L-1)＝6.452(A532-A600)-0.559A450

MDA含量(umol·g-1)＝(MDA浓度×提取液体积)/叶片鲜重

③叶片中脯氨酸含量的测定

游离脯氨酸的测定采用酸性茚三酮法(参照张志良主编《植物生理学实验指导》)测定。取0.2g剪碎的叶片置于离心管当中，加入5ml 3％(w/v)浓度的磺基水杨酸，沸水浴10分钟，待冷却至室温(25℃)后4000r/min离心10min，然后取2ml上清液注入15ml离心管中，加入2ml冰醋酸及2ml 2.5﹪酸性茚三酮，在沸水浴30min。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光值，然后根据公式计算。

计算公式：脯氨酸(ug/g)＝(脯氨酸质量×提取液总体积/测定液体积)/样品重

2、实验结果

(1)高温处理

42℃高温处理3天后，番茄表型见图6。野生型AC⁺⁺和转基因株系之间的表型有明显的差异，野生型AC⁺⁺在经过42℃高温处理3d后，只有其下部的叶片开始萎蔫失水，植株顶部的叶片生长较正常，叶片依然挺立；然而，超表达SlbZIP6基因的株系，在高温处理3d后，整个植株叶片都萎蔫失水，植株呈现倒伏的状态不再挺立，说明超表达SlbZIP6增加了番茄对高温的敏感性。

(2)生理指标

①电导率

在高温胁迫下，野生型番茄植株和超表达SlbZIP6基因植株的相对电导率有所增加，但是与野生型番茄相比，超量表达SlbZIP6基因植株积累了更多的相对电导率(见图7)。

②MDA

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的产物，MDA积累得越多，膜透性增加的程度越大。植物受到逆境胁迫后，丙二醛的积累会对膜和细胞造成进一步伤害，因此，用丙二醛的含量作为膜脂过氧化作用的指标，以表示植物对逆境胁迫抗性反应的强弱和膜脂过氧化的程度。本发明实施例结果表明，在高温胁迫下，野生型番茄植株和超表达SlbZIP6基因植株的丙二醛的积累量有所增加，但是与野生型番茄相比，超量表达SlbZIP6基因植株积累了更多的丙二醛(图8)。

③渗透调节

游离脯氨酸作为渗透调节物质，可以降低细胞在遭受干旱和高温等环境胁迫时的渗透势，减少细胞内水分的流失，维持细胞正常形态；同时也具有清除ROS和降低生物膜氧化水平的功能。经过高温胁迫后，超表达SlbZIP6番茄植株比野生型AC⁺⁺番茄积累了更少的脯氨酸(图9)。

(3)分子机制——高温相关基因

为了进一步研究SlbZIP6番茄耐热性的分子调控机理，本发明对热激转录因子HsfA2、HsfB1，热激蛋白Hsp90、Hsp100以及高温响应基因SlSIZ1和SlJA2进行了表达分析。分别检测了这些基因在超表达SlbZIP6基因番茄和野生型C⁺⁺中表达量的差异，结果见图10。

检测HsfA2和HsfB1在野生型AC⁺⁺番茄植株和超表达SlbZIP6基因植株中的表达情况，HsfA2和HsfB1基因的转录水平都下调表达(图10A/B)。

SlSIZ1和SlJA2是高温响应基因，它们在参与调控了番茄耐热的分子机制并在其中有着重要的作用。和野生型AC⁺⁺番茄对比，超表达SlbZIP6番茄植株在高温胁迫下，SlSIZ1和SlJA2的表达量都升高，说明SlbZIP6可能可以通过调控SlSIZ1，SlJA2的转录水平来调节植株的耐热性(图10E/F)。

Hsp90和Hsp100是重要的热激蛋白，在高温胁迫下，在所有番茄中，Hsp90和Hsp100的转录水平都受到了高温胁迫的诱导，但Hsp90和Hsp100的转录水平在超表达SlbZIP6番茄中明显的低于野生型番茄(图10C/D)。

通过上述结果表明，过量表达SlbZIP6增加了高温胁迫下转基因番茄植株的相对电导率和丙二醛的积累以及减少了脯氨酸的积累，以上三种都将导致在高温胁迫下番茄植株受到更大伤害，从细胞水平上验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性。也探索了SlbZIP6调控番茄高温耐受能力的分子机制，从分子水平上验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性。

本发明已证实调控SlbZIP6基因的表达能够调节植物对高温的抗性。因此，所述的高温胁迫相关的SlbZIP6基因在植物抗高温领域具有广阔的应用前景，为农作物尤其是番茄抗高温育种提供基因与技术的支持，其经济效益潜力巨大。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 西南大学

<120>一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用

<160> 19

<170> PatentIn version 2.1

<210> 1

<211> 454

<212> PRT

<213> 番茄[Solanum lycopersicum] SlbZIP6基因的氨基酸序列

<400> 1

Met Asp Arg Val Phe Ser Val Asp Asp Asp Ile Gly Asp His Phe

5 10 15

Trp Ser Thr Pro Pro Thr Ala Glu Leu Gly Val Asp Ser Pro Thr

20 25 30

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ser Tyr Ser Lys Met Met Asn

35 40 45

Arg Ser Ser Ser Glu Trp Ala Phe Gln Arg Phe Leu Leu Glu Ala

50 55 60

Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Thr Ser Ser Pro Pro Gln Pro Pro

65 70 75

Thr Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Gln Asn Asp Val Val

80 85 90

Glu Ile Lys Asp Glu Asn Leu Ser Thr Pro Asn Leu Asn Ser Gly

95 100 105

Thr Ala Leu Asn Ser Lys Pro Ala Ala Thr Leu Phe Gly Ser Ala

110 115 120

Thr Pro Gln Asn Ile His Val Asp Ala Glu Glu Tyr Gln Ala Phe

125 130 135

Leu Lys Ser Arg Leu Asp Leu Ala Cys Ala Ala Val Ala Leu Thr

140 145 150

Arg Ala Lys Asn Leu Lys Pro Gln Asp Ala Ser Ser Ile Ala Pro

155 160 165

Asp Lys Gly Pro Glu Thr Ala Ser Ala Ser Gln Ser Val Ser His

170 175 180

Ile Thr Ser Lys Gly Ser Gly Gln Glu Val Arg Lys Val Gln Asp

185 190 195

Lys Asp Ser Gly Gly Pro Val Gly Ile Pro Ser Leu Pro Ala Val

200 205 210

Gln Lys Lys Pro Gly Val Gln Val Lys Ser Thr Thr Ser Gly Ser

215 220 225

Ser Arg Glu Leu Ser Asp Asp Asp Glu Ala Glu Gly Glu Ala Glu

230 235 240

Thr Thr Gln Gly Thr Asp Pro Ala Asp Thr Lys Arg Val Arg Arg

245 250 255

Met Leu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Arg Arg Lys

260 265 270

Gln Ala His Leu Thr Glu Leu Glu Thr Gln Val Ser Gln Leu Arg

275 280 285

Val Glu Asn Ser Ser Leu Leu Lys Arg Leu Thr Asp Ile Ser Gln

290 295 300

Lys Tyr Asn Glu Ser Ala Val Asp Asn Arg Val Leu Lys Ala Asp

305 310 315

Val Glu Thr Leu Arg Ala Lys Val Lys Met Ala Glu Glu Thr Val

320 325 330

Lys Arg Val Thr Gly Leu Asn Pro Leu Phe Gln Ala Met Ser Glu

335 340 345

Met Ser Ser Met Ala Met Pro Ser Phe Ser Gly Ser Pro Ser Asp

350 355 360

Thr Ser Thr Asp Thr Ala Val Pro Val Pro Asp Asp Ser Gln His

365 370 375

His Tyr Tyr Gln Gln Pro Pro Asn Asn His Met Pro Thr His Asp

380 385 390

Pro Arg Ile Gln Asn Gly Met Val Asp Val Pro Thr Ile Gly Thr

395 400 405

Val Gln Gln Asn Pro Ala Ala Ala Ala Val Gly Gly Asn Lys Met

410 415 420

Gly Arg Thr Ala Ser Met Gln Arg Val Ala Ser Leu Glu His Leu

425 430 435

Gln Lys Arg Ile Arg Gly Glu Val Ser Ser Cys Gly Thr Gln Gly

440 445 450

Arg Gly Glu Gln

454

<210> 2

<211> 1365

<212> DNA

<213>番茄[Solanum lycopersicum] SlbZIP6基因的核苷酸序列

<400> 2

atggataggg tattttcagt ggacgatgac attggcgacc atttttggtc gacgccgccg 60

acggcggagt tgggcgttga ttcacccacc tctgccgccg ccgccgccgc catctcctac 120

tcgaagatga tgaatcgcag ctcttccgaa tgggctttcc agcgtttcct actagaagcc 180

gccggcgccg ccggtacgac cacttcatct cctcctcagc cacctacaat ggcgtcatcg 240

tcgtcatctt cacaccaaaa cgatgttgtc gagatcaagg atgagaatct ttctactcct 300

aatctcaatt ccggcacggc gttaaattcg aagccggcag cgacgttgtt tggctctgcg 360

actccgcaga atattcacgt tgatgctgaa gagtatcaag cttttctcaa aagtcgcctc 420

gatttggctt gtgctgcagt cgcattgact cgggcgaaga atctaaagcc tcaagatgcg 480

agttccattg cacctgataa aggaccagag actgctagtg catcacaatc agtatctcac 540

atcacctcta aaggatctgg tcaggaagtg agaaaagttc aagataagga ttctggtgga 600

ccagttggaa taccctcttt gcccgcagtg cagaagaaac ctggggtgca ggtgaaatca 660

acaactagtg gttcatccag agagctatcc gatgatgatg aagctgaagg agaagcagaa 720

acgactcaag gaacagatcc agctgataca aaacgcgtaa ggagaatgct ttcaaataga 780

gaatcagcca gacgttcaag gagaagaaag caagcccatc ttacagaact tgagacacag 840

gtatctcaac tgagagtaga aaactcctcc ctactgaaac gtctgactga cataagccag 900

aaatacaatg aatcagctgt tgataatcgt gtcctaaaag cagatgttga gacattgaga 960

gcaaaggtga agatggcaga agaaacagtt aaaagagtta cagggctaaa tcctttattc 1020

caagctatgt ctgagatgtc ctcaatggca atgccatcct tctctggcag tccttcggac 1080

acatcaacag acactgctgt gcctgtgcca gatgattctc aacatcatta ctaccaacaa 1140

ccgccaaata atcatatgcc aacccatgat cctagaattc aaaatggtat ggttgatgtt 1200

cctacaatag gaactgtaca gcagaatcct gcagctgcag cagttggtgg gaataagatg 1260

ggtagaacag cttcaatgca gcgcgtagcc agcttggagc atctgcagaa gcgcatacgt 1320

ggagaagtga gttcctgtgg aacccaaggt cggggagagc aataa 1365

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P800-F+

<400> 3

cgggatcctt ctctttcttt tcttcctatt tatt 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P800-R+

<400> 4

cgagctcatc tctacttgtt cttcgcatct cat 33

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> M13F

<400> 5

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> M13R

<400> 6

caggaaacag ctatgac 17

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7380-F+

<400> 7

ccggaattcc ctctttcttt tcttcctatt tattg 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7380-R+

<400> 8

ggggtacccc atttcacctg caccccaggt ttctt 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7382-F+

<400> 9

gctctagagc ctctttcttt tcttcctatt tattg 35

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7382-R+

<400> 10

cgcggatccg cgatttcacc tgcaccccag gtttctt 37

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7248-F

<400> 11

ccatcattgc gataaaggaa a 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7248-R

<400> 12

ggtaacatga tagatcatgt cattgt 26

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7416-F

<400> 13

gctagtatat catcttacat gttcgat 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> P7416-R

<400> 14

catgcgatca taggcgtctc gcatatc 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> 247B -F

<400> 15

tgtgagaatt agttagggtt tggga 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223>正向引物P7069

<400> 16

caacatcatt actaccaaca accgcc 26

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223>反向引物P7070

<400> 17

ttctacccat cttattccca ccaact 26

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> CAC正向引物

<400> 18

atggcagacg gagaggatat tca 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> CAC反向引物

<400> 19

gcctttgcaa tccacatctg ctg 23

Claims (2)

1.一种番茄转录因子基因SlbZIP6在番茄抗高温育种中的应用，所述番茄转录因子基因SlbZIP6编码的氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示，其特征在于，筛选低表达SlbZIP6的番茄植株，获得更耐高温的番茄的种子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因SlbZIP6的核苷酸序列如SEQ IDNO .2所示。

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