CN109694880B

CN109694880B - 一种基于rna干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法

Info

Publication number: CN109694880B
Application number: CN201910143245.2A
Authority: CN
Inventors: 王志娟; 宋姗姗; 许世敏; 李霞
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN109694880A

Abstract

本发明公开了一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法，首先利用SEQ ID NO：1所示的基因片段构建RNAi载体，然后利用所得RNAi载体构建转基因植物，得到与正常植物相比具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。利用本发明构建的RNAi载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高非生物胁迫下大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

Description

一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种利用RNAi技术培育高结瘤/固氮植物的方法。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，也是高需氮的作物。大豆通过根瘤可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供必需的氮素营养。由根瘤介导的共生固氮过程不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源、减少环境化学污染。目前，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。

根瘤的发生是基因顺序表达的结果，也是内外环境共同作用的结果。环境逆境，包括干旱、盐及冷等非生物胁迫几乎影响豆科根系结瘤和固氮的每一个过程。盐胁迫不仅影响根瘤菌在根上的聚集、根毛细胞发育及根毛细胞的弯曲变形，还影响根瘤原基形成、发育以及提前衰老(Zahran and Sprent 1986)；更重要的是盐胁迫影响固氮根瘤豆血红蛋白含量和细胞膜通透性变化，致使根瘤中氧量增加，导致根瘤菌固氮酶活力下降高达60-90％(Yousef and Sprent1983)。干旱不仅减少豆科植物的侧根及根毛的数目，并且会形成畸形的根毛，影响根瘤菌对豆科植物的侵染以及豆科植物的结瘤(关桂兰等1986)。

ABA是调节植物生长发育和逆境胁迫响应的重要激素，在豆科植物-根瘤菌共生中也发挥重要的作用。外加ABA能显著抑制大豆根瘤数目，并能影响根毛的卷曲变形，说明ABA能负调节根瘤发生。经典的ABA转导模型认为，ABA信号核心组分包括PYR1/PYL受体，PP2C磷酸酶和SnRK2激酶。在没有ABA时，PP2C和SnRK2结合并且抑制SnRK2激酶活性，ABA信号处在关闭状态；在ABA存在时，ABA和PYR1/PYL受体及PP2C形成受体复合物，从而释放出SnRK2，SnRK2磷酸化并激活下游bZIP类的转录因子ABI5，ABI5能够启动ABA响应基因表达，从而对胁迫做出响应。在这个过程中，ABI5是ABA重要作用因子，已经研究证明ABI5在种子休眠、萌发和转录及干旱响应中发挥重要作用，但目前尚未见到有关ABI5在大豆根及根系结瘤和共生固氮中作用的报道。

本发明的相关技术参考文献包括：

1.Bano A,Harper JE.Plant growth regulators and phloem exudatesmodulate root nodulation of Soybean.Funct Plant Biol,2002,29(11):1299-1307；

2.Becana M,Apariciotejo P,

Aguirreolea,J,SánchezdíazM.N2fixation(C2H2-reducing activity)and leghaemoglobin content duringnitrate-and water-stress-induced senescence of Medicago sativa rootnodules.Jexp Bot,1986,37(178):597-605；

3.BenkováE,Michniewicz M,Sauer M,Teichmann T,SeifertováD,Jürgens G,Friml J.Local,efflux-dependent auxin gradients as a common module for plantorgan formation.Cell,2003,115(5):591-602；

4.Berstein L,Ogata G.Effects of salinity on nodulation,nitrogenfixation,and growth of Soybeans and Alfalfa.Agron J,1966,58(2):201-203；

5Biswas B,Chan PK,Gresshoff PM.A novel ABA insensitive mutant ofLotus japonicus with a wilty phenotype displays unaltered nodulationregulation.Mol Plant,2009,2(3):487-499；

6.Bolle C.The role of GRAS proteins in plant signal transduction anddevelopment.Planta,2004,218(5):683-692；

7.Broekaert WF,Delaure SL,De Bolle MF,Cammue BP.The role of ethylenein host-pathogen interactions.Annu Rev Phytopathol,2006,44(1):393-416；

8.Cai Z,Liu J,Wang H,Yang C,Chen Y,Li Y,Pan S,Dong R,Tang G,BarajasLopez JDD,Fujii H,Wang X.GSK3-like kinases positively modulateabscisic acid signaling through phosphorylating subgroup III SnRK2s inArabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(26):9651-9656；

9.Chapman EJ,Estelle M.Mechanism of auxin-regulated gene expressionin plants.Annu rev genet,2009,43(1):265-285；

10.Charpentier M,Sun J,Martins TV,Radhakrishnan GV,Findlay K,Soumpourou E,Thouin J,Very A,Sanders D,Morris RJ,Oldroyd GED.Nuclear-localized cyclic nucleotide-gated channels mediate symbiotic calciumoscillations.Science,2016,352(6289):1102。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法，在植物中下调/沉默表达Glyma.02G131700基因的表达，培育出具高结瘤/固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，首先利用SEQ ID NO：1所示的基因片段构建RNAi载体，然后利用此RNAi载体构建转化体，再利用所得转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述RNAi载体采用PTCK303作为骨架载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述转化体采用农杆菌K599。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。

本发明还包括培育高结瘤转基因植物所使用的RNAi载体，其包含PTCK303骨架载体和SEQ ID NO：1所示的基因片段。

本发明还包括RNAi载体所产生的dsRNA和siRNA。

本发明还包括RNAi载体所产生的RNA诱导沉默复合体RISC。

本发明还包括扩增SEQ ID NO：1所示基因片段的引物对，其核苷酸序列分别如SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明还包括利用上述方法构建的具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：参见下文的试验例，利用本发明构建的RNAi载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高非生物胁迫下大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

附图说明

图1为大豆中GmABI5L基因响应短期ABA、干旱和盐处理的表达模式分析，为了检测GmABI5L对ABA、干旱和盐的响应，首先将大豆在B5培养基中萌发，5天后，用0μM ABA或50μMABA处理6个小时，之后对大豆根系进行取样，取样部位为从根茎交界处以下2cm到根尖，提取RNA，检测GmABI5L的表达量。结果显示GmABI5L在ABA的诱导下表达量有不同程度的增加，表明GmABI5L的表达受ABA的诱导。

图2为大豆中GmABI5L基因响应长期根瘤菌侵染的表达模式分析，在根叶茎瘤四种组织中检测，GmABI5L在根瘤中表达量较高，说明它可能在根瘤的形成中发挥一定的功能。

图3为下调表达GmABI5L后对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，下调表达GmABI5L的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著增多(图3A和3B)，图3C为对转基因根系中GmABI5L的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmABI5L的表达是显著下调的。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。

在本发明中，将大豆的Glyma.02G131700基因命名为GmABI5L。本发明构建的下调表达载体能够特异的抑制大豆中的GmABI5L基因表达。此基因定位在大豆2号染色体上，实时荧光定量PCR检测结果表明，GmABI5L基因在大豆根中的表达受到ABA、干旱和盐的诱导；通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析显示，下调表达GmABI5L可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加，表明GmABI5L基因在大豆根瘤发育中具有重要的作用。

实施例1、GmABI5L基因响应ABA、干旱和盐处理的表达模式分析。

1)材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82(简称W82)；材料按照以下流程进行：大豆种子用70％的酒精灭菌30sec，在B5培养基中萌发，16h光/8h暗，光强7000LUX，温度26℃，相对湿度为70％。5天后，用下列方法处理：ABA处理，用0μM ABA或50μM ABA处理6个小时；干旱处理：200mM甘露醇处理6小时；盐处理：用100mM NaCl处理6小时。倒出蛭石，取样部位为从根茎交界处以下2cm到根尖。

2)mRNA的分离：采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2g加入1mL离心管中然后加入1mL TRI pure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5min；②加200μL氯仿，振荡混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min，离心15min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；④弃上清，用75％的乙醇(DEPC处理过的无菌水配制)洗，4℃，12000r/min，离心10min，重复两次，室温风干10min左右，加20μl左右DEPC处理过的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀。

3)反转录为cDNA：将提取的mRNA用反转录试剂盒，反转录为cDNA。

4)实时荧光定量PCR分析：采用Vazyme公司的SuperReal PreMix Plus(SYBRGreen)试剂盒，具体实验方法如下：在10μl体系中加入上步所得cDNA模板0.3μl、正反向引物各0.2μl、2x SuperReal PreMix Plus 5μl、ddH₂O 4.3μl；扩增程序为：95℃，15min；95℃，10sec；60℃，34sec，40cycles；95℃，15sec，60℃，1min，95℃，15sec；其中：

正向引物为：TGGGAAGACA CCAGCAAATA A(SEQ ID NO：4)；

反向引物为：TGGTGCTCTG AAACTCATCA A(SEQ ID NO：5)。

5)结果：如图1所示，ABA、干旱或者盐处理后，GmABI5L基因的表达受到显著诱导，该结果说明GmABI5L基因是受ABA及干旱和盐诱导。

实施例2、GmABI5L基因响应根瘤菌侵染的表达模式分析。

1)材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82(简称W82)；材料按照以下流程进行：大豆种子用70％的洒精灭菌30sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16h光/8h暗，光强7000LUX，温度26℃，相对湿度为70％。大豆萌发后9天，做接种根瘤菌处理，每株接种慢生型根瘤菌USDA110菌液(OD₆₀₀＝0.08)30mL，分别在接菌后0、14、21及28天取大豆的根。

3)反转录为cDNA：将提取的mRNA用TaKaRa反转录试剂盒，反转录为cDNA。

正向引物为：TGGGAAGACA CCAGCAAATA A(SEQ ID NO：4)；

反向引物为：TGGTGCTCTG AAACTCATCA A(SEQ ID NO：5)。

5)结果：如图2所示，在根瘤菌侵染的大豆根中，GmABI5L基因的表达后期受到明显诱导，该结果说明GmABI5L基因参与了大豆根系结瘤固氮过程。

实施例3、利用RNAi载体下调表达GmABI5L基因，培育具有高结瘤固氮能力的转基因大豆。

1)构建重组表达载体。

(1)GmABI5L基因片段的克隆：

根据GmABI5L的编码序列(SEQ ID NO：1)设计引物对用于RNAi载体构建，根据载体pTCK303上的多克隆位点，引物末端分别引入KpnI、SpeI、BamHI、SacI酶切识别位点；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增引物序列为：

正向引物：GGGGTACCAC TAGTTGGGAA GACACCAGCA AATAA(SEQ ID NO:2)；

反向引物：CGGGATCCGA GCTCCTCTCA CAACACCAGC TCTCAC(SEQ ID NO:3)；

扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，68℃2min，30个循环；72℃70sec；

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化473bp左右的条带；

回收的DNA片段与Blant3-T载体(Takara公司)连接，10μl体系中加入T vector 1μl，回收片段4μl，混匀混合液，16℃连接过夜，热击法转入E.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。

(2)重组表达载体的构建：

a.提取含有正确测序的GmABI5L 473bp基因序列的T载体质粒，用Spe I和Sac I酶切获得核苷酸序列；

b.用Spe I和Sac I酶切PTCK303质粒，获得线状的PTCK303核苷酸序列；

c.将GmABI5L核苷酸序列片段先连接到PTCK303载体中；

d.将步骤c的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，提取质粒用BamH I和Sac I酶切切下800bp左右片段则说明第一段连接成功；

e.将步骤d成功连入第一段目的片段的质粒作为载体以及含有测序正确的GmABI5L 473bp基因序列的T载体质粒用BamHI和KpnI做双酶切，将GmABI5L核苷酸序列片段连接到载体上；

f.将步骤c的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，提取质粒用BamH I和Sac I酶切切下1.5k bp左右片段则说明第二段连接成功。

2)农杆菌K599介导的毛状根转化。

(1)农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：

a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；

b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃(5min)融化后，加入800μl LB(无抗性)液体培养基，28℃低速振荡(150r/min)4-5h；

c.4000r/min，30sec,去上清，加100μl LB液体培养基，悬浮菌体后涂板含50mg/ml卡那霉素)；

d.置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；

(2)农杆菌K599介导的毛状根转化：

以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10h后，在B₅培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8g琼脂粉(sigma)，1×GAMBORG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，货号：G398)，pH调至5.7)上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min(OD₆₀₀＝0.6)后，将外植体转至1/2MS培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉(sigma)，0.5×MURA SHIGE&SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，货号：G519)，pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110(OD₆₀₀＝0.08)30mL/株，培养28天后统计根瘤数量。

3)Wilimas82大豆根组织中总RNA的提取。

研钵经超声处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1‰DEPC水处理过夜后121℃高温湿热灭菌30min，枪头，离心管65℃烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA：

(1)取100mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5mL离心管，室温放置5min；

(2)加入200μl氯仿，震荡混匀，静置5min，4℃，12000r/min，离心10min；

(3)取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；

(4)弃上清，用1mL 75％的乙醇(DEPC处理过的无菌水配制)洗涤，4℃，12000r/min，离心10min，重复两次，室温风干10min左右，加20μl左右DEPC处理过的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；

4)反转录PCR。

(1)在用DEPC处理过的的200μl PCR管中顺序加入5μL RNA和3μL oligo(dt)18；4μL dNTPs，65℃温育5min后迅速置于冰上冷却；

(3)按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer(invitrogen公司出品)4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；

(4)将上述反应液混匀，37℃反应30min；

(5)反应结束后，70℃处理10min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA第一条链可用作PCR反应模板。

5)实时荧光定量PCR分析：采用Vazyme公司的SuperReal PreMix Plus(SYBRGreen)试剂盒，具体实验方法如下：在10μl体系中加入上步所得cDNA模板0.3μl、正反向引物各0.2μl、2x SuperReal PreMix Plus 5μl、ddH₂O 4.3μl；扩增程序为：95℃，15min；95℃，10sec；60℃，34sec，40cycles；95℃，15sec，60℃，1min，95℃，15sec；其中：

正向引物为：TGGGAAGACA CCAGCAAATA A(SEQ ID NO：4)；

反向引物为：TGGTGCTCTG AAACTCATCA A(SEQ ID NO：5)。

6)结果观察。

结果如图3所示，表明在完全相同的实验环境下，下调表达GmABI5L的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著增多(图3A和3B)，图3C为对转基因根系中GmABI5L的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmABI5L的表达是显著下调的。

综上实施例可见，利用本发明构建的RNAi载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高非生物胁迫下大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 473

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(Glycine max)

<400> 1

tgggaagaca ccagcaaata ataatgttac tagcactact ctgctgagac agccctcaac 60

aatatactca ttgacatttg atgagtttca gagcaccatg ggtgggattg ggaaggattt 120

cgggtccatg aacatggatg aactcttgaa gaacatatgg acagctgaag agactcaagc 180

catggtgttt tcagccgttg ccgccgcagg aggagtagaa ggccataaca acaacagcaa 240

caacaaccct attaattgta gtggtttgca aagacaaggc tctttgacat tgccaaggac 300

tcttagtcag aaaacagttg aggaggtttg gagggacttg atcaaagaaa gtggtggtga 360

ggccaacgat ggtggaagtg gtggcaatgg tggctcatca aatcctcaaa tgcaagcaac 420

attgggagaa atgacattgg aggagttttt ggtgagagct ggtgttgtga gag 473

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ggggtaccac tagttgggaa gacaccagca aataa 35

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cgggatccga gctcctctca caacaccagc tctcac 36

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tgggaagaca ccagcaaata a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tggtgctctg aaactcatca a 21

Claims

1.一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法，其特征在于：在植物中下调/沉默表达Glyma.02G131700基因，培育出与正常植物相比具有高结瘤/固氮能力的转基因植物；所述植物为大豆。

2.根据权利要求1所述的一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法，其特征在于：首先利用SEQ ID NO：1所示的基因片段构建RNAi载体，然后利用此RNAi载体构建转化体，再利用所得转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

3.根据权利要求2所述的一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法，其特征在于：所述RNAi载体采用PTCK303作为骨架载体。

4.根据权利要求2所述的一种基于RNA干扰技术培育高结瘤转基因植物的方法，其特征在于：所述转化体采用农杆菌K599。