CN113430180B

CN113430180B - 甘薯黄酮醇合成酶IbFLS1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN113430180B
Application number: CN202110796137.2A
Authority: CN
Inventors: 后猛; 李强; 唐维; 李臣; 张允刚; 王欣; 闫会; 宋炜涵; 马代夫
Original assignee: Jiangsu Xuhuai District Xuzhou Agricultural Research Institute (jiangsu Xuzhou Sweet Potato Research Center)
Current assignee: Jiangsu Xuhuai District Xuzhou Agricultural Research Institute (jiangsu Xuzhou Sweet Potato Research Center)
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2041-07-14
Also published as: CN113430180A

Abstract

本发明公开了一种甘薯黄酮醇合成酶IbFLS1及其编码基因与应用。所述的IbFLS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码基因如SEQ ID NO：1所示。本发明的IbFLS1蛋白及其编码基因可调控植物黄酮醇的合成，将编码IbFLS1蛋白的DNA分子导入目的植物，能够得到黄酮醇积累量增加的转基因植物。本发明提供的IbFLS1蛋白及其编码基因在提高植物黄酮醇含量方面具有重要的理论意义与应用价值，为转基因植物的培育奠定了基础。

Description

甘薯黄酮醇合成酶IbFLS1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种甘薯黄酮醇合成酶IbFLS1及其编码基因与应用。

背景技术

类黄酮作为一类重要的多酚类次生代谢物，其广泛存在于各类植物当中，虽然其具体物质有所区别，但都有C6-C3-C6结构。目前类黄酮主要分为黄酮、花青素、黄酮醇、原花青素等，其中黄酮醇的种类主要有杨梅素、槲皮素、山萘酚等。黄酮醇与花青素共享前期的合成途径，其合成通路上的节点酶—黄酮醇合成酶(FLS)与花青素合成途径的二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)竞争同一底物—二氢黄酮醇，因此，FLS是类黄酮合成分支路口极为重要的节点基因之一，不仅影响着黄酮醇的合成，也影响着花青素的积累。通过遗传转化等分子生物学技术，开展植物黄酮醇合成相关功能基因的挖掘工作，对培育优良品质作物新品种具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘薯黄酮醇合成酶IbFLS1及其编码基因与应用。

本发明的IbFLS1蛋白，来源于甘薯(Ipomoea batatas)，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

本发明的IbFLS1蛋白的编码基因，为编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

具体的，本发明的IbFLS1蛋白的编码基因，可以是如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有所述IbFLS1蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组病毒，所述的转基因细胞系为非植物细胞系。

具体的，本发明提供的重组载体为将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pCAMBIA1301S的Kpn I和BamH I两个位点之间得到的重组载体pCAMBIA1301S:IbFLS1。

本发明还提供所述的IbFLS1蛋白或其编码基因或含有所述IbFLS1蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组病毒在培育黄酮醇积累量增加的转基因植物中的应用。

具体的，本发明提供的培育黄酮醇积累量增加的转基因植物中的应用，具体方法为将所述IbFLS1蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物。

更具体的，所述的IbFLS1蛋白的编码基因通过含有所述IbFLS1蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组病毒导入目的植物。

在本发明的具体实施例中，所述的IbFLS1蛋白的编码基因通过将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pCAMBIA1301S的Kpn I和BamH I两个位点之间得到的重组载体pCAMBIA1301S:IbFLS1导入拟南芥中，获得IbFLS1转基因拟南芥。

本发明的IbFLS1蛋白及其编码基因，将该基因导入拟南芥中，得到了转IbFLS1拟南芥植株，结果证明IbFLS1能够增加拟南芥叶片中黄酮醇的含量，说明IbFLS1蛋白及其编码基因在植物黄酮醇合成中起着重要的作用。本发明提供的IbFLS1蛋白及其编码基因在提高植物黄酮醇含量方面具有重要的理论意义与应用价值。

附图说明

图1为转IbFLS1拟南芥植株的PCR检测结果图。

图2为转IbFLS1拟南芥植株叶片槲皮素含量变化图。

图3为转IbFLS1拟南芥植株叶片山萘酚含量变化图。

图4为转IbFLS1拟南芥植株叶片杨梅素含量变化图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1甘薯黄酮醇合成酶IbFLS1及其编码基因的获得

实验材料：将甘薯品种徐紫薯8号在江苏徐淮地区徐州农业科学研究所试验田栽插，待生长约30天后取1-2片新鲜叶片，液氮速冻，-80℃保存。

1、叶片总RNA提取与纯化

RNA提取所用溶液、器皿等均经过DEPC水的特殊处理，其操作严格按照《分子克隆实验指南(第二版)》(2005-3-1，J.萨姆布鲁克等，科学出版社)有关RNA操作的要求进行，严防RNase污染。

采用上海捷瑞生物工程有限公司生产的Trizol试剂进行总RNA的提取，具体步骤如下：

1)取甘薯品种徐紫薯8号叶片约0.3g；

2)用液氮研磨，将磨好的样品转入1.5ml离心管，并且以每0.1g样品对应1mlTrizol的比例加Trizol试剂，涡旋振荡30s，室温放置5min左右；

3)加入氯仿200.0μl，涡旋振荡30sec，室温静置5min，4℃，12000×g离心10min；

4)取上清约500.0μl至离心柱中，加入200.0μl的无水乙醇，并充分混匀，室温静置2min(可能会有絮状沉淀产生)，常温条件下，8 000rpm离心1min；

5)小心取出柱子，倒掉滤液，并将柱子放回收集柱中，加入600.0μl buffer RWA，8000rpm，室温离心30sec，倒掉滤液；

6)重复7的步骤，倒掉滤液，将柱子放回收集管，12 000rpm离心1min；

7)小心取出柱子，放入新的RNase-Free的1.5ml离心管中，在柱膜中央加入50.0μl的DEPC-H2O，60℃下放置2min；

8)12000×g离心1min，得白色片状RNA沉淀；

取6μl用于电泳检测，取4μl用于浓度测定，剩余的于-80℃保存备用。用紫外分光光度计检测RNA的质量(OD₂₆₀)和纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)；并用1.2％变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

2、cDNA第一链的合成

将提取的总RNA，通过First-Strand cDNASynthesis Kit试剂盒(TOYOBO)分别反转录成First-strand cDNA，具体步骤如下：

1)取总RNA1μg于PCR管中，然后加入5μl的Oligo(dT)20(10μM)，用RNase-Free H₂O补足至12μl；

2)在水浴锅中65℃反应5min后，立即置于冰上；

3)轻微离心，然后加入以下试剂：4μl 5×RT Buffer，2μl dNTP mix(10mM)，1μlRNase Inhibitor(10U/μl)，1μl ReverTra Ace，加RNase-Free H₂O定容至总体积为20μl；

4)混匀后轻微离心，在PCR仪中42℃温浴20min，90℃反应5min终止First-strandcDNAsynthesis；

5)取4μl至0.2ml离心管中，并稀释10倍用于后续实验或放置-20℃保存。

3、IbFLS1蛋白的cDNA编码序列克隆

根据甘薯转录组测序的结果，通过同源序列比对找到IbFLS1蛋白的cDNA序列，并设计正向引物1和反向引物2进行IbFLS1蛋白cDNA编码序列克隆。引物序列如下：

引物1：5’–ATGGAGGTGGAGAGAGTGCA–3’(SEQ ID NO：3)

引物2：5’–TTACTGAGGAAGCTTGTTCAGCT–3’(SEQ ID NO：4)

以步骤2中准备好的cDNA为模板，用正向引物1和反向引物2进行PCR反应。

PCR反应体系如下：25μl PrimeSTAR Max Premix(2x)聚合酶(购自大连TAKARA公司)，100ng cDNA，正、反向引物各0.45μM，ddH₂O补充至终体积50μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存，反应是在PTC-225 PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，获得1014bp长度的扩增片段。

经过测序，该PCR产物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸，该序列所示的基因的编码区为序列表中SEQ ID NO：1自5’端第1-1014位核苷酸；序列表中SEQ ID NO：1由1014个碱基组成；该基因编码的蛋白命名为IbFLS1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2；序列表中SEQ ID NO：2由337个氨基酸残基组成。

实施例2IbFLS1蛋白在调控植物黄酮醇积累过程中的应用

一、转IbFLS1拟南芥的获得

1、植物表达载体的构建

根据甘薯Ib FLS1蛋白cDNA的编码序列和构建载体用的是同源重组技术，以人工合成的SEQ ID NO：1所示的DNA分子为模板(或以徐紫薯8号块根cDNA为模板)，用正向引物3：5’–GAGAGGACAGggtaccATGGAGGTGGAGAGAGTGC–3’(SEQ ID NO：5)和反向引物4：5’–CGACTCTAGAggatccTTACTGAGGAAGCTTGTTCAG–3’(SEQ ID NO：6)扩增出包含完整编码序列的PCR产物，回收纯化后，与Kpn I和BamH I酶切后的线性化pCAMBIA1301S进行同源重组连接，即可得到重组载体pCAMBIA1301S:IbFLS1。PCR反应体系如下：2μl线性化载体，8μl PCR产物，10μl 2×同源重组酶(NEB公司)，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：50℃20min，反应是在PTC-225 PCR仪上完成。

将上述重组载体pCAMBIA1301S:IbFLS1转化大肠杆菌感受态细胞Trans-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD501)，37℃培养16h，对重组载体pCAMBIA1301S:IbFLS1进行PCR扩增鉴定并进行测序验证。测序结果表明，重组载体pCAMBIA1301S:IbFLS1为将序列表中SEQ ID NO：1自5’端第1位–第1014位核苷酸插入pCAMBIA1301S的Kpn I和BamH I两个位点之间得到的载体。

2、植物表达载体转化农杆菌

1)从-80℃低温冰箱中取出100μl的EHA105感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)，置于冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pCAMBIA1301S:IbFLS1，混匀；

2)液氮冷冻5min，37℃温育5min；

3)加入1000μl的LB液体培养基，28℃培养4h；

4)取200μl菌液于含有抗生素(100μg/ml利福平(Rif)、50μg/ml卡那霉素(Kan))的LB固体培养基上涂布均匀，于28℃暗培养2天；

5)挑取单菌落并进行PCR鉴定(鉴定引物为引物1和引物2，得到1014bp片段的为阳性)；

6)将阳性单菌落接种含有100μg/ml Rif和50μg/ml Kan的LB液体培养基中，28℃培养至OD值达到1.0，即得到了可用于后续转化工作的农杆菌液。

3、转IbFLS1拟南芥的获得

1)转化

用农杆菌介导的方法将IbFLS1 cDNA的编码序列导入到拟南芥野生型材料中，具体方法如下：

①将步骤2中准备好的农杆菌液离心后，加入1倍体积含有5％蔗糖、0.02％silwetL-77表面活性剂的悬浮溶液；

②将农杆菌悬浮液倒入50ml离心管中，将拟南芥横放使花序浸入离心管悬浮液中浸染10s，轻微晃动离心管；

③用塑料膜包裹植株，并让浸染后的植株保持黑暗条件下高湿度24h；

④次日去掉包裹的塑料，将浸染后的拟南芥放回温室，正常生长1个月后，得到T₀代转IbFLS1拟南芥。

2)分子鉴定

使用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，天根生化科技)，提取上述生长3周后T₀代转IbFLS1拟南芥、野生型拟南芥(WT)的叶片基因组DNA，利用PCR技术检测各个植株中IbFLS1基因的表达，具体反应体系为：2×Taq mix 10μl，100ng DNA，正、反向引物(SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6)各0.5μl，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，复性温度55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。

从电泳检测扩增结果见图1可以看出，得到条带约1000bp的株系#1、#2、#6、#7、#8和#11为阳性T₀代转IbFLS1拟南芥，表明IbFLS1基因已经整合到拟南芥基因组中，并证明这些检测植株为阳性转基因植株。鉴定为阳性转基因T₀代植株，收获得到T1代转基因种子。将T1代转基因拟南芥株系的种子消毒后，种植于含有3％蔗糖和40μg/ml卡那霉素(Kan)的1/2MS培养基上，根据孟德尔遗传定律，筛选到抗性植株：不抗植株符合3：1分离比例的株系#7。收获株系#7的T2代种子，种植后得到纯合植株T3代。

二、转IbFLS1拟南芥的黄酮醇含量鉴定

选取生长3周后株系#7的T3代转基因拟南芥叶片，在研钵中加入液氮迅速研磨，然后转移至离心管内，加入10ml提取液(甲醇+丙酮+戊醇，比例2:2:0.5)，加入玻璃小球，超声波提取20min(100W)，放入微波炉内，中火(200W)加热提取5min，过滤后取滤液，使用ABSCIEX 4600进行LCMS分析，每个检测样品重复3次。。

色谱条件：色谱柱：HALO-C18(4.6*100mm，2.7μm)流动相A：0.5％甲酸水溶液，流动相B：0.5％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，洗脱程序，流速0.5ml/min。

质谱条件：多重反应选择离子监测(MRM)监测，电喷雾离子源(EIS)，工作参数：气帘气：150kpa，碰撞气：150kPa，离子源温度：600℃，离子源电压：-4500V，驻留时间：100.0ms，定量分析的离子对：杨梅素：317.1→179.0m/z；山萘酚：287.0→121.1m/z，槲皮素：151.0→273.1m/z。

山萘酚标准品方程y＝257442x-16761.2444，R²＝0.9997，

槲皮素标准品方程y＝410287x-10152.3367，R²＝0.9984，

杨梅素标准品方程y＝716220x-40014.6274，R²＝0.9949。

结果如图2、图3和图4所示，可以看出转IbFLS1拟南芥叶片中槲皮素、山萘酚和杨梅素等黄酮醇主要成分含量比野生型植株显著提高。

上述实验结果表明，IbFLS1蛋白及其编码基因可以促进植物黄酮醇的积累。

序列表

<110> 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心)

<120> 甘薯黄酮醇合成酶IbFLS1及其编码基因与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 1

atggaggtgg agagagtgca agcggtggcg aattctctat caaagatgac ggcggacact 60

attccggcgg agtacatccg gtcggagaag gagcagccgg cggcgacgac gctccgcggc 120

gtggttcttg aagttccggt gatcgacatg agcgatccgg aggaggagaa ggtggtgaag 180

atgatagcgg aggcgagcag agagtggggg atttttcagg tggtgaacca tggggtgcct 240

aatgaggtga tccgggagtt gcagagggtg gggaaggagt ttttcgagct ccctcaggcg 300

gagaaggagg cggtggctaa agatcccggc ggggggagca ttgaggggta tgggactagt 360

ttgcaaaaga atgtggatgg gaagaggggt tgggttgatc atttgtttca tagggtttgg 420

cctccttctg ctgttaacta caaattttgg cctaaaaacc ctccttctta tagggaagca 480

aatgaggagt acgctaagat actaaatgaa gtggggaata gactatttag gagcttatcc 540

gtcggtcttg gcctcgaggc tcatgagttg aaggaagcgg caggaggtga agatataatt 600

cacttgctaa aaatcaacta ttacccgcca tgtcctcgac cggatttggc cttgggagtg 660

gtggcccaca ccgacatgtc ggcaatcacc attcttgtac ccaatgaggt tcaagggctc 720

caagttttca atgatgacca ttggtatgat gttaagtata ttccaaatgc cctcatcatc 780

cacattggtg accaacttga gattttgagc aatgggaagt ataaaagtgt gtaccacagg 840

acaacagtgg acaaggaaaa gacaagaata tcctggcctg tcttcttgga gccaccacct 900

gaatttgaag ttgggcccat tcctaagctt attgatgaga ataatccacc aaaatataag 960

accaaaaagt acaaggatta tgcttattgc aagctgaaca agcttcctca gtaa 1014

<210> 2

<211> 337

<212> PRT

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 2

Met Glu Val Glu Arg Val Gln Ala Val Ala Asn Ser Leu Ser Lys Met

1 5 10 15

Thr Ala Asp Thr Ile Pro Ala Glu Tyr Ile Arg Ser Glu Lys Glu Gln

20 25 30

Pro Ala Ala Thr Thr Leu Arg Gly Val Val Leu Glu Val Pro Val Ile

35 40 45

Asp Met Ser Asp Pro Glu Glu Glu Lys Val Val Lys Met Ile Ala Glu

50 55 60

Ala Ser Arg Glu Trp Gly Ile Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Pro

65 70 75 80

Asn Glu Val Ile Arg Glu Leu Gln Arg Val Gly Lys Glu Phe Phe Glu

85 90 95

Leu Pro Gln Ala Glu Lys Glu Ala Val Ala Lys Asp Pro Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Ile Glu Gly Tyr Gly Thr Ser Leu Gln Lys Asn Val Asp Gly Lys

115 120 125

Arg Gly Trp Val Asp His Leu Phe His Arg Val Trp Pro Pro Ser Ala

130 135 140

Val Asn Tyr Lys Phe Trp Pro Lys Asn Pro Pro Ser Tyr Arg Glu Ala

145 150 155 160

Asn Glu Glu Tyr Ala Lys Ile Leu Asn Glu Val Gly Asn Arg Leu Phe

165 170 175

Arg Ser Leu Ser Val Gly Leu Gly Leu Glu Ala His Glu Leu Lys Glu

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Glu Asp Ile Ile His Leu Leu Lys Ile Asn Tyr Tyr

195 200 205

Pro Pro Cys Pro Arg Pro Asp Leu Ala Leu Gly Val Val Ala His Thr

210 215 220

Asp Met Ser Ala Ile Thr Ile Leu Val Pro Asn Glu Val Gln Gly Leu

225 230 235 240

Gln Val Phe Asn Asp Asp His Trp Tyr Asp Val Lys Tyr Ile Pro Asn

245 250 255

Ala Leu Ile Ile His Ile Gly Asp Gln Leu Glu Ile Leu Ser Asn Gly

260 265 270

Lys Tyr Lys Ser Val Tyr His Arg Thr Thr Val Asp Lys Glu Lys Thr

275 280 285

Arg Ile Ser Trp Pro Val Phe Leu Glu Pro Pro Pro Glu Phe Glu Val

290 295 300

Gly Pro Ile Pro Lys Leu Ile Asp Glu Asn Asn Pro Pro Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Thr Lys Lys Tyr Lys Asp Tyr Ala Tyr Cys Lys Leu Asn Lys Leu Pro

325 330 335

Gln

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaggtgg agagagtgca 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttactgagga agcttgttca gct 23

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagaggacag ggtaccatgg aggtggagag agtgc 35

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgactctaga ggatccttac tgaggaagct tgttcag 37

Claims

1. 含有IbFLS1蛋白的编码基因的重组载体在培育黄酮醇积累量增加的转基因植物中的应用，其特征在于，所述的重组载体通过以下步骤构建：将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pCAMBIA1301S的Kpn I和BamH I两个位点之间得到的重组载体pCAMBIA1301S:IbFLS1；所述的IbFLS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的转基因植物为转基因拟南芥，所述的黄酮醇为槲皮素、山萘酚和杨梅素。