CN115925848A - 一种石斛ERF类转录因子基因DoERF5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石斛ERF类转录因子基因DoERF5及其应用。转录因子DoERF5或其编码基因DoERF5在调控植物种子在石斛类原球茎增殖中的应用，所述的转录因子DoERF5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到的属于石斛ERF转录因子DoERF5的编码基因ERF转录因子基因DoERF5，ERF转录因子DoERF5作为正调控因子参与了调控石斛类原球茎的增殖，通过转基因及功能鉴定证实超量表达ERF转录因子DoERF5，转基因石斛的增殖能力显著提高。因此，ERF转录因子DoERF5或其编码基因在兰科植物微体繁殖、遗传转化和细胞工程等领域具有重要的理论意义及应用价值。

Description

一种石斛ERF类转录因子基因DoERF5及其应用

技术领域：

本发明属于植物领域，具体涉及石斛ERF转录因子或其编码基因及其在调控兰科植物类原球茎发育中的应用。

背景技术：

兰科是植物第二大科，具有重要商业价值、药用价值和观赏价值，其种子不含胚乳，结构非常简单。在萌发时，胚发育成球形结节状体，称为原球茎，并在顶端形成芽顶端分生组织。类原球茎是形态跟原球茎相似，由原球茎或其它外植体在离体培养条件下诱导得到，在植物发育生物学、植株高效再生、遗传转化、次生代谢物质生产、细胞工程等研究领域均有广泛的应用前景。PLB的细胞学特征和细胞壁标记物与合子胚发育相似，被认为是兰科的体胚(Lee et al.,2013)。但是，研究表明一些与体胚形成的标记基因如SERK2、BBM2、CLV2、WOX并未在兜兰的PLBs阶段呈现高表达(Guo et al.,2021)。研究发现蝴蝶兰的原球茎、PLB与合子胚发育的分子机制存在差异，PLB再生并不按照胚胎发生的程序(Fang etal.,2016)。这说明兰科植物的PLB发育机有区别于植物体胚发生。

发明内容：

本发明的目的是提供转录因子DoERF5或其编码基因及其在调控兰科植物类原球茎增殖中的应用。

本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到铁皮石斛ERF转录因子DoERF5的编码基因ERF转录因子基因DoERF5，ERF转录因子DoERF5作为正调控因子参与了石斛类原球茎发育，通过转基因及功能鉴定证实超量表达ERF转录因子DoERF5，促进转基因石斛的类原球茎形成。

本发明的第一个目的是提供转录因子DoERF5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码转录因子DoERF5的编码基因DoERF5。

所述的编码基因DoERF5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供了转录因子DoERF5或其编码基因DoERF5在调控石斛类原球茎增殖中的应用，所述的转录因子DoERF5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选，是在石斛中超表达转录因子DoERF5的编码基因提高转基因类原球茎增殖的应用。

所述的转录因子DoERF5的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的石斛是铁皮石斛。

本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到的属于铁皮石斛ERF转录因子DoERF5的编码基因ERF转录因子基因DoERF5，ERF转录因子DoERF5作为正调控因子参与了石斛类原球茎增殖，通过转基因及功能鉴定证实超量表达ERF转录因子DoERF5，转基因类原球茎的增殖能力提高。因此，ERF转录因子DoERF5或其编码基因在兰科植物的微体快繁、遗传转化和细胞工程等领域均有重要的理论指导意义及应用价值。

附图说明：

图1是DoERF5全长，其中1为DL2000 DNA Marker，2为目的片段。

图2是DoERF5在不同发育阶段的表达模式分析，其中1是类原球茎；2是从类原球茎诱导的芽。

图3是DoERF5亚细胞定位分析。

图4是DoERF5转录激活分析。

图5是荧光定量PCR分析表明DoERF5基因在超表达石斛株系中的表达水平；其中WT为野生型石斛，DoERF5-OX表示为筛选到的DoERF5超表达转基因石斛。

图6是野生型和DoERF5超表达石斛类原球茎在不含植物生长调节剂培养基上的增殖情况；其中WT为野生石斛，DoERF5-OX表示为筛选到的DoERF5超表达转基因石斛。

图7是pSAT6-EYFP-N1载体的载体图谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是本发明的限制。

实施例1

下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例中所用石斛保存在中国科学院华南植物园组织培养室内。选取类原球茎为材料提取RNA。逆转录酶M-MLV购自Promega公司，其货号为：M1701；DNase I(RNase Free)购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号为D2215；普通PCR反应buffer为2×TSINGKE Master Mix(blue)购自擎科生物公司，其货号为TSE004-5ML；构建超表达载体采用高保真酶进行扩增，所用的高保真酶为KOD，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；pMD18-T载体和限制性内切酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)；MS和LB培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

以SDS法提取铁皮石斛类原球茎RNA，提取得到的RNA用DNase I进行去基因组DNA处理，具体操作按照使用说明书进行。得到的纯化后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；然后在超微量核酸蛋白测定仪NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度，检测合格的RNA置于-80℃冰箱备用。采用Promega公司逆转录酶M-MLV进行逆转录得到cDNA。在铁皮石斛全基因组CDS拼接文件中查找得到DoERF5的CDS核苷酸序列，根据序列信息设计正向引物(5′-ATGGCGAGCCAAGACATCTC-3′)和反向引物(5′-TTAAATAACCATCAGCTGCGG-3′)，以cDNA为模板，进行常规PCR扩增，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，40个循环；72℃5min。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段(图1)，连接于连接pMD18-T载体，连接反应：PCR产物4.5μL，pMD18-T载体0.5μL，Solution I 5μL，共10μL体积，16℃连接过夜。所有连接产物，转到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中(TaKaRa，D9057A)，冰上30min，42℃热击45sec，冰上放置5min后加800mL LB液体培养基，复苏45min，涂于含100mg/L Amp的LB平板上，37℃培养至长出菌落(约16h)。挑取单菌落于含100mg/L Amp的LB液体培养基中扩增培养，进行PCR扩增，具体操作与CDS扩增方法一致，检测到的阳性重组子送交华大基因进行测序。扩增的目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第1位到822位碱基，长822bp，将此开放阅读框命名为铁皮石斛ERF转录因子基因DoERF5，其编码273个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为铁皮石斛ERF转录因子DoERF5。

实施例2：DoERF5在不同发育阶段的表达模式分析

收集生长在1/2MS培养基中(25±1℃,40μmol m^-2s^-1,12-h光照/12-h黑暗,60％相对湿度的培养室)中铁皮石斛原球茎和从类原球茎诱导的芽。用滤纸吸取多余的液体和除去培养基，用铝箔纸包裹，液氮速冻5min后，采用SDS改良版进行RNA提取，并用DNase I进行去基因组DNA处理。得到的纯化后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；然后在超微量核酸蛋白测定仪NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度，检测合格的RNA置于-80℃冰箱备用。采用Promega公司逆转录酶M-MLV进行逆转录得到cDNA。以铁皮石斛actin基因(NCBI登录号：JX294908)作为内参，其荧光定量PCR引物为ActinF(5′-TCCCAAGGCAAACAGAGAAA-3′)和ActinR(5′-GGCCACTAGCATATAGGGAAAG-3′)。DoERF5的荧光定量PCR引物为：5′-CGCAAACGATGATCCGATTC-3′和5′-CAGAACCGTCTATCCACTCTAC-3′。荧光定量PCR采用美国BIO-RAD公司iTaq Universl SYBR Green supermix反应试剂，PCR反应板和膜均采用美国BIO-RAD公司的产品。反应体系及反应程序按照说明书的操作步骤进行。每个样品设3-4个技术重复，每个反应管反应体系如下：

反应在ABI 7500Real-time PCR仪上进行，反应程序为95℃预变性2min；95℃变性15sec,60℃退火及延伸1min，反应40个循环。所得数据使用ABI 7500Real-time PCRsystem软件进行处理，利用2^-ΔΔCT方法(Livak and Schmittgen 2001)计算相对表达量。DoERF5在石斛类原球茎中强烈表达(图2)。

实施例3：DoERF5的亚细胞定位分析

1、pSAT6-EYFP-N1-DoERF5载体构建

以铁皮石斛类原球茎逆转录合成的cDNA为模板，根据pSAT6-EYFP-N1载体(可以从http://www.biovector.net/product/428881.html购买，载体图谱如图7所示)上的序列，设计两个接头引物，上游引物接头：5′-AGCTCAAGCTTCGAATTC-3′，下游引物接头：5′-CCGTCGACTGCAGAATTC-3′。下划线表示EcoRⅠ酶切位点。在DoERF5的起始密码子和终止密码子附近设计引物(不包含终止密码子)，根据ERF转录因子基因DoERF5全长设计引物，保证基因的三联体密码子不移码。以铁皮石斛类原球茎的cDNA为模板，高保真扩增获得ERF转录因子基因DoERF5全长，扩增引物为ERF5-YFPF(5′-AGCTCAAGCTTCGAATTCATGGCGAGCCAAGACATCTC-3′)和ERF5-YFPR(5′-CCGTCGACTGCAGAATTCAATAACCATCAGCTGCGGAA-3′)。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段。pSAT6-EYFP-N1质粒载体经EcoRⅠ单酶切后获得含有粘性末端的线性质粒载体，具体操作按说明书进行。回收线性质粒载体，-20℃保存备用。采用擎科生物有限责任公司的soso同源重组试剂盒进行构建，50℃反应15min后立即放在冰上，将连上目的片段的载体转化DH5α，涂在含有100mg/L Amp的LB固体培养板上，37℃倒置培养16h。待长出菌落，挑取但菌落在含有100mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养16h，后进行菌液PCR验证阳性重组子。阳性克隆送至华大基因测序，测序正确的菌液，接种到含有100mg/L Amp的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养16h，提取质粒并保存在-20℃冰箱备用。拟南芥叶片原生质体的制备和PEG法转化原生质体均参考表观遗传研究组保存的方法。在共聚焦荧光显微镜上观察荧光并拍照。结果表明，YFP荧光与核定位质粒NSL-mCherry的荧光相重叠，说明DoERF5是一个核定位蛋白(图3)。

实施例4：DoERF5的转录激活活性分析

1、pGBKT7-DoERF5载体构建

以铁皮石斛类原球茎逆转录合成的cDNA为模板，根据pGBKT7载体上的序列，设计两个接头引物，上游引物接头：5′-CATGGAGGCCGAATTC-3′，下游引物接头：5′-GGATCCCCGGGAATTC-3′。下划线表示EcoRⅠ酶切位点。在DoERF5的起始密码子和终止密码子附近设计引物(不包含终止密码子)，根据ERF转录因子基因DoERF5全长设计引物，保证基因的三联体密码子不移码。DoERF5蛋白的自激活活性，我们分析了DoERF5全长、N端(DoERF5-N)，和C端(DoERF5-C，包含AP2绑定结构域)。以铁皮石斛类原球茎的cDNA为模板，高保真扩增获得ERF转录因子基因DoERF5全长，扩增引物为ERF5BDF(5′-CATGGAGGCCGAATTCATGGCGAGCCAAGACATCTC-3′)和ERF5BDR(5′-GGATCCCCGGGAATTCAATAACCATCAGCTGCGGAA-3′)；DoERF5-N扩增引物为ERF5BDF(5′-CATGGAGGCCGAATTCATGGCGAGCCAAGACATCTC-3′)和ERF5-NR(5′-GGATCCCCGGGAATTCTACCTCCAACCGGTCGCCGCC-3′)；DoERF5-C的引物为DoERF5-NF(5′-CATGGAGGCCGAATTCAGGCCTCAAGCTCAGTGTCCC-3′)和ERF5BDR(5′-GGATCCCCGGGAATTCAATAACCATCAGCTGCGGAA-3′)。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段。pGBKT7质粒载体经EcoRⅠ单酶切后获得含有粘性末端的线性质粒载体，具体操作按说明书进行。回收线性质粒载体，-20℃保存备用。采用擎科生物有效责任公司的soso试剂盒进行构建，50℃反应15min后立即放在冰上，将连上目的片段的载体转化DH5α，涂在含有50mg/L Kan的LB固体培养板上，37℃倒置培养12h。待长出菌落，挑取但菌落在含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，后进行菌液PCR验证阳性重组子。阳性克隆送至华大基因测序，测序正确的菌液，接种到含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，提取质粒并保存在-20℃冰箱备用。

2、转化酵母AH109及转录激活活性分析

经测序证明构建成功的重组质粒，转化酵母AH109(YC1010，上海唯地生物技术有限公司)。转化方法如下：取100μL冰上融化的AH109感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴，重复一次)10μL，PEG/LiAc 500μL并吸打几次混匀，30度水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。5000rpm离心40s弃上清，ddH₂O 400μL重悬，离心30s弃上清。ddH₂O 50μL重悬，涂布在Trp缺陷型板上，29℃培养48-96h。待菌落长出，进行菌落PCR，扩增体系和程序与构载体时扩增目的片段相同。验证为阳性菌株后，在Trp和His缺陷型板(含X-Gal)上划线，等培养72h，观察菌落的颜色和大小。含有pGBKT7-DoERF5C质粒的酵母AH109在SD/-T/-H的板上不能正常生长，也不能变蓝(图4)。相反，含有pGBKT7-DoERF5或pGBKT7-DoERF5-N质粒的酵母AH109在SD/-T/-H的板上可以正常生长，在含X-α-gal的平台上显蓝色(图4)，说明DoERF5转录因子具有自激活活性，其N端具有自激活活性。

实施例5：DoERF5超表达转基因石斛的获得与鉴定

1、ERF转录因子基因DoERF5超表达载体的构建

根据pOx载体(华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光院士团队提供，具体构建方法参见硕士论文李超，水稻SDG711和SDG723的克隆与功能分析)上的序列，设计两个接头引物，上游引物接头：5′-TACCGGCGCGCCAAGCTT-3′，下游引物接头：5′-ACGCGTACTAGTAAGCTT-3′。在DoERF5的起始密码子和终止密码子附近设计引物(不包含终止密码子)，根据ERF转录因子基因DoERF5全长设计引物，以铁皮石斛类原球茎的cDNA为模板，高保真扩增获得ERF转录因子基因DoERF5全长，扩增引物为ERF5OxF(5′-GGATCCACGCGTAAGCTTATGGCGAGCCAAGACATCTC-3′)和ERF5OxR(5′-CTGCAGGCATGCAAGCTTAATAACCATCAGCTGCGGAA-3′)。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段。pOx质粒载体经Hand IIⅠ单酶切后获得含有粘性末端的线性质粒载体，具体操作按说明书进行。回收线性质粒载体，-20℃保存备用。采用擎科生物有限责任公司的soso同源重组试剂盒进行构建，50℃反应15min后立即放在冰上，将连上目的片段的载体转化DH5α，涂在含有50mg/L Kan的LB固体培养板上，37℃倒置培养16h。待长出菌落，挑取单菌落在含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，后进行菌液PCR验证阳性重组子。阳性克隆送至华大基因测序，测序正确的菌液，接种到含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，提取质粒并保存在-20℃冰箱备用。pOx载体是含有一个烟草泛素的Ubi启动子(Ubipromoter)，将ERF转录因子基因DoERF5(如SEQ ID NO.1的第1位到822位碱基所示)接在此启动子后面，构建成ERF转录因子基因DoERF5的植物表达载体，将此重组表达载体命名为pOx-DoERF5。

2、重组质粒pOx-DoERF5转化到农杆菌EHA105

采用冻融法将重组质粒转入农杆菌EHA105。取1μl(浓度为1μg/μl)重组表达载体pOx-DoERF5与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min，液氮速冻1min，迅速转到37℃孵化5min。加800μl无抗生素的LB培养基，于28℃，100rpm转速中培养3h。将培养物涂到含50mg/L Kan LB固体平板上，28℃倒置培养，直至菌落长出(约48h)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定引物为ERF5OxF(5′-GGATCCACGCGTAAGCTTATGGCGAGCCAAGACATCTC-3′)和ERF5OxR(5′-CTGCAGGCATGCAAGCTTAATAACCATCAGCTGCGGAA-3′)。能扩增得到目的条带的菌落为阳性克隆，在含50mg/L Kan LB液体培养基上培养至OD₆₀₀为1左右，加入适量的无菌甘油(终浓度为25～30％)，液氮速冻2min，-80℃保存备用。由此获得含有重组质粒pOx-DoERF5的农杆菌。

3、农杆菌介导的石斛类原球茎的遗传转化

从-80℃冰箱中取出保存的菌种，在含50mg/L Kan LB固体平板上划线进行活化含有重组质粒pOx-DoERF5的农杆菌，挑取单菌落于100ml LB液体培养基中(含50mg/L Kan)，28℃、180rpm振荡培养过夜(约16h)，至OD₆₀₀＝0.8-1.0。室温5000rpm离心10min收集菌液。用100ml渗透培养基(1/2MS+0.5g/L MES+5％蔗糖，pH 5.7)重悬农杆菌。石斛类原球茎切成2mm直径的材料并进行预培养2天。将预培养后的石斛类原球茎浸泡在农杆菌重悬液中30min，黑暗共培养2天后，在光照条件下培养。然后在含30mg/mL的潮霉素B的培养基中筛选抗性转化子。

4、转基因植株的鉴定

经过6次(每次2个月)的筛选，得到潮霉素抗性的转基因类原球茎。提取野生型类原球茎和潮霉素抗性的转基因类原球茎的总RNA并逆转录成cDNA，以ddH₂O₂调至相同浓度，并以石斛Actin作为内参，其引物为ActinF(5′-TCCCAAGGCAAACAGAGAAA-3′)和Acti nR(5′-GGCCACTAGCATATAGGGAAAG-3′)。DoERF5的荧光定量PCR引物为DoERF5F(5′-CGCAAACGATGATCCGATTC-3′)和DoERF5R(5′-CAGAACCGTCTATCCACTCTAC-3′)，如图5所示，所有转基因株系中的DoERF5表达量均可显著高于野生型，说明DoERF5已经实现在转基因类原球茎中超量表达。

实施例6：超表达DoERF5对转基因类原球茎增殖的影响

将转基因株系和野生型类原球茎切成4mm直径大小类原球茎外植体，并在无菌环境下进行称重，获得接入时的重量，接种到1/2MS+20g/L蔗糖+6g/L+琼脂粉的固体培养基(pH值5.4)中，在25±2℃，12-h光照/12-h黑暗条件下培养。培养40天后，对培养后的类原球茎进行拍照和称重。类原球茎增殖率＝(培养后类原球茎鲜重-培养前的类原球茎鲜重)÷培养前的类原球茎鲜重。DoERF5超表达株系在不含植物生长调节剂培养基培养的增值率均显著高于野生型，野生型类原球茎容易分化出芽，且增殖低(图6)。

SEQ ID NO.1

ATGGCGAGCCAAGACATCTCCAACCTCGTTATCATCCGCGAACACCTCTTCGGCGACGC

TGCCGACATCCTAACCGGCCTGGAGTCTCCCGCGCAGACGACATCACTGACGGAAGCG

GAAATCACCCCAATTCCCGGCGATCTTAGCATCTCCGACTACCTGGAAGACCCCGATACT

GTTCCGCGCGGCACCGGGTTCAGATTCCAGGAACCCGCGCAAACGATGATCCGATTCGG

CGGCGACCGGTTGGAGGTAGGCCTCAAGCTCAGTGTCCCTCACACCGCTGCTCCGAAG

GTAGAGTGGATAGACGGCTCTGTCGATGATAACCGGGCGCCGGAGATGCTCGACGGTAA

CCGGTACCGTGGCGTCAGACAGAGGCCATGGGGGAAGTTCGCGGCGGAGATCCGCGAT

CCTAAACGCCGGGGATCTAGGGTTTGGCTCGGAACATTTGATACCGCGGTGGAGGCCGC

GCGGGCGTACGACCGCGCCGCATTCAAGATGCGCGGAAGCAAGGCCATTCTCAACTTTC

CGAATGAGGTTGGTAGCTCGGCGGATTGGGTTCATCCGCCTCCATCCGCGGCGGCACTA

CCAATGCAGCCGGAGAAGAGGGGGAGAGAGATTGAGAAAGAAGAACAGAGGGTAGTG

AAGAAGGAGAGATTGGAGGAATCTGAGTGGAATATTCTGGCTGAAGAACCGTTAACCC

CGTCAATCTGGTCTGCGGTTTGGGACGGGACGGATGCGAAGGGATTCTTCAGCTTGCCG

CCGCTCTCTCCACTGTCTCCCCACCCGCAACTGGGATTTCCGCAGCTGATGGTTATTTAASEQ IDNO.2

MASQDISNLVIIREHLFGDAADILTGLESPAQTTSLTEAEITPIPGDLSISDYLEDPDTVPRGTG

FRFQEPAQTMIRFGGDRLEVGLKLSVPHTAAPKVEWIDGSVDDNRAPEMLDGNRYRGVRQ

RPWGKFAAEIRDPKRRGSRVWLGTFDTAVEAARAYDRAAFKMRGSKAILNFPNEVGSSAD

WVHPPPSAAALPMQPEKRGREIEKEEQRVVKKERLEESEWNILAEEPLTPSIWSAVWDGTDAKGFFSLPPLSPLSPHPQLGFPQLMVI。

Claims (7)

1.转录因子DoERF5，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的转录因子DoERF5的编码基因DoERF5。

3.根据权利要求2所述的编码基因DoERF5，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述的转录因子DoERF5或其编码基因DoERF5在调控石斛类原球茎增殖中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是在石斛中超表达转录因子DoERF5的编码基因提高转基因类原球茎增殖的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的转录因子DoERF5的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求4、5或6所述的应用，其特征在于，所述的石斛是铁皮石斛。

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