CN110592086B

CN110592086B - 一种植物维管束组织特异性表达的启动子及其应用

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Publication number: CN110592086B
Application number: CN201910879592.1A
Authority: CN
Inventors: 刘滔; 王芳旭; 沈春修; 卢其能; 曾晓春
Original assignee: Yichun University
Current assignee: Yichun University
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2039-09-18
Also published as: CN110592086A

Abstract

本发明涉及植物基因工程和植物遗传育种技术领域，特别涉及一种植物维管束基因组织特异性表达启动子及其应用。本发明将OsOPT7基因的启动子序列应用于转基因水稻，成功地诱导了功能基因在水稻维管束中特异性表达。利用这一启动子的这种功能，可以提供一种在转基因水稻维管束中特异表达外源基因的方法，为现代遗传育种技术的发展提供新的动力。

Description

一种植物维管束组织特异性表达的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和植物遗传育种技术领域，特别涉及一种植物维管束组织特异性表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在维管束中表达。

背景技术

植物是人类赖以生存和发展的物质基础，植物生产是第一性的生产，植物品种是植物生产的物质基础，改良植物品种的过程称为植物育种。植物基因工程和植物遗传育种相结合是现代农业的发展方向。获得具有优质、高产、高抗病抗逆性和其它特殊性状的植物品系是农业发展的目标和推动力，将转基因技术应用于植物遗传育种是现代植物育种技术发展的新动力，转基因技术就是将人工分离和修饰过的外源基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物性状的目的。

在该技术中的关键环节是要将外源基因置于合适的启动子之后才能引导该基因在目的生物体基因组中表达。启动子是指位于功能基因上游的一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸(DNA)序列。启动子可以被RNA聚合酶识别，并起始转录，启动子在决定基因表达的时空模式中起着主要的作用。目前常用的转基因启动子主要是泛素(ubiquitin)启动子和烟草花叶病毒35S启动子等组成型表达启动子，对于水稻转基因，该类启动子可以有效地诱导外源基因在水稻中表达，但是该类启动子诱导外源基因的表达没有器官和组织的特异性，在水稻的各个器官和组织该启动子都会诱导外源基因表达，这就限制了该启动子的应用价值，我们进行转基因育种时通常需要将我们导入的外源基因在水稻特定的发育阶段和器官表达，这是该类启动子所无法实现的。

维管束是植物重要的功能组织，是输送养分、水分、影响抗逆能力的重要组织，如果能获得调控基因在维管束中特异表达的启动子，将该启动子应用于转基因水稻，可以诱导功能基因在水稻维管束中特异的表达。在一些植物如水稻中，维管束还与籽粒灌浆物质的运转，籽粒充实度有关。

现有技术中，有关维管束特异表达启动子的相关研究甚少，因此分离克隆到这样的启动子，提供一种在转基因水稻维管束中特异表达外源基因的方法，对于现代遗传育种技术也具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中，植物转基因技术中的启动子诱导外源基因的表达没有器官和组织的特异性的缺点，提供一种能够特异诱导外源基因在植物(尤其是水稻)维管束表达的启动子、获得含有该启动子的表达盒、重组表达载体、宿主菌、转化子以及该启动子的应用。

为此，本发明第一方面提供了一种植物维管束特异性表达启动子，其为：

1)SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；

2)与SEQ ID No:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个以上的核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列，优选地，所述与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少90％的同源性，更优选95％。

本发明所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

在发明的一些实施方式中，植物维管束特异性表达启动子为OsOPT7启动子。

本发明的发明人从水稻日本晴基因组中分离了水稻维管束特异表达基因OsOPT7，并获得其启动子序列。水稻OsOPT7基因属于植物寡肽运输基因家族，该基因在维管束中特异性表达。

本发明第二方面提供一种包含所述的植物维管束特异性表达启动子的表达盒。

在本发明的一些实施方式中，所述表达盒使连接在其内的目的基因在植物维管束中特异性表达。

本发明第三方面提供一种包含所述的植物维管束特异性表达启动子的重组表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体使连接在其内的目的基因在植物维管束中特异性表达。

在本发明的另一些实施方式中，在所述重组表达载体中，所述植物维管束特异性表达启动子连接于植物表达载体pCAMBIA1301的待表达的基因序列的上游，在重组表达载体中，所述OsOPT7启动子可驱动待表达的基因的表达，所述植物表达载体pCAMBIA1301是能够在水稻中表达的载体。

在本发明的一些实施方式中，所述植物表达载体可以是农杆菌双元表达载体或者通过其它方式转入受体植物基因组的植物表达载体，在该启动子后面添加需要在水稻维管束中特异表达的外源基因的编码核苷酸序列，诱导该基因在水稻维管束中特异表达。也可以通过在编码序列的下游导入各种表达标签来表达纯化蛋白。另外根据具体的实验材料和方法还可以在载体上添加不同的抗性基因来应对不同的筛选方式。

本发明第四方面提供一种宿主菌，其包含所述的植物维管束特异性表达启动子和/或所述的植物维管束特异性表达启动子的表达盒和/或所述的植物维管束特异性表达启动子的重组表达载体。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述宿主菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacines)。

本发明第五方面提供一种转化子，其包含所述的植物维管束特异性表达启动子和/或所述的植物维管束特异性表达启动子的表达盒和/或所述的植物维管束特异性表达启动子的重组表达载体和/或所述的宿主菌。

本发明第六方面提供所述的植物维管束特异性表达启动子在水稻育种中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用包括：

1)将所述植物维管束特异性表达启动子连接于载体的外源功能基因的基因序列上游，构建重组表达载体；

2)将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中，将转化后的水稻细胞、组织或器官培育成植株获得转基因植株；

3)从转基因植株中筛选出具有外源功能基因的功能的植株。

本发明第七方面提供所述的植物维管束特异性表达启动子在水稻性状的改良中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用的操作步骤：

1)将用于改良水稻性状的目的基因连接到所述的重组表达载体中，将其转化到水稻细胞、组织或器官中；

2)将转化后的水稻细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因在特定的组织部位表达的转基因植物，其中，所述特定的组织部位为水稻的维管束。

在本发明的另一些实施方式中，所述水稻性状的改良可以为水稻氮素的利用率的改良。例如在维管束特异表达高效氮素运输基因，可以提高水稻对氮素的运输效率，从而增加水稻产量，但本发明并不限定于此种应用。

在本发明的一些实施方式中，所述目的基因可为来源于水稻或非来源于水稻的基因。

本领域技术人员应该理解，如果外源目的基因不是水稻来源的，为了使其在水稻中充分表达，可以按照水稻密码子应用偏好进行密码子优化，在不改变外源功能基因所编码的氨基酸序列的前提下，优化其核苷酸序列使其能够在水稻中充分表达。关于密码子优化的技术是本领域技术人员所熟知的。另外，关于将表达盒或重组载体转染到水稻植株中的方法也是本领域的常规方法，例如，可以利用农杆菌介导的转染技术等。

本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因组中分离了水稻维管束特异表达基因OsOPT7的启动子序列，水稻OsOPT7基因属于植物寡肽运输基因家族，该基因在维管束中特异性表达。将分离得到的启动子应用于转基因水稻，成功地诱导了功能基因在水稻维管束中特异性表达。本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的目的基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动目的基因在维管束中的特异性表达，从而提高外源目的基因在植物维管束中的表达量，增加转基因的效果。利用这一启动子的这种功能，可以提供一种在转基因水稻维管束中特异表达外源基因的方法，为现代遗传育种技术的发展提供新的动力。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1示出本发明中水稻OsOPT7基因启动子诱导GUS基因表达的农杆菌转化载体pCAMBIA1301-OsOPT7Promoter(启动子)示意图，即OsOPT7Promoter::GUS构建示意图；

图2示出本发明中T0代转基因水稻PCR鉴定结果，泳道1为以OsOPT7Promoter::GUS为模板的阳性对照；泳道2、3、5、6、7、8、9为转基因阳性植株；泳道4为转基因阴性植株；泳道10为阴性植株对照；

图3示出本发明中转基因水稻OsOPT7Promoter::GUS及野生型不同器官和组织的GUS染色结果，其中，a:OsOPT7Promoter::GUS转基因植株的叶片；b:OsOPT7Promoter::GUS转基因植株的叶鞘；c:OsOPT7Promoter::GUS转基因植株的叶片和叶鞘的连接处；d:野生型植株的叶片；e:野生型植株的叶鞘；f:野生型植株的叶片和叶鞘的连接处；g:OsOPT7Promoter::GUS转基因植株的根；h:OsOPT7Promoter::GUS转基因植株的茎；i:OsOPT7Promoter::GUS转基因植株的颖花；j:野生型植株的根；k:野生型植株的茎；l:野生型植株的颖花，白色箭头所指的深色区域即为GUS染色区。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。

在本发明的一些具体的实施方式中，获得水稻OsOPT7基因的启动子诱导GUS基因在水稻维管束中特异表达的转基因植株的过程如下：将水稻维管束特异表达基因OsOPT7的启动子序列连接到植物双元表达载体pCAMBIA1301上，获得重组表达载体(如附图1)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。

对获得的转基因水稻进行组织化学检测，发现转基因植株整体上的GUS基因表达水平相对较低，仅在维管束处显蓝色，从而证明OsOPT7的启动子序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的GUS基因在水稻维管束中特异性表达。

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

下述实施例中的实验方法，如果没有特殊说明，均为常规实验方法。实验所用到的试剂盒实验仪器，如无特殊说明，均可在生物仪器和试剂公司购买到。

需要指出的是，本发明实施例中选用的pCAMBIA1301载体由华南植物园张明永研究员惠赠。并且，该表达载体本身连有GUS基因。为证实OsOPT7启动子的表达模式，将OsOPT7启动子插入GUS基因上游，从而启动GUS基因的表达。构建好的表达载体OsOPT7Promoter::GUS见附图1。

实施例1

含有酶切位点的OsOPT7启动子的获取

步骤1：引物的设计

根据选用的载体及OsOPT7启动子序列的特点，设计引物的酶切位点，具体设计的引物为：正向引物1(5′端带PstⅠ酶切位点)，反向引物2(5′端带NcoⅠ酶切位点)，引物序列如下：

正向引物1：5′-TCTGCAGTAGCTCATTATCTAGAACAGAGT-3′，如SEQ ID No:2所示；

反向引物2：5′-ACCATGGCTCCCTAGCCTCGATCTC-3′，如SEQ ID No:3所示。

步骤2：OsOPT7启动子的获取

以水稻品种日本晴总DNA为模板，利用正向引物1、反向引物2扩增OsOPT7启动子，按常规PCR体系进行操作，采用如下扩增程序：

94℃预变性2min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min。回收PCR产物，获得带有酶切位点的水稻寡肽运输基因OsOPT7基因的启动子片段，将其与pMDtm19-T载体(购自takala公司)连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，经筛选获得转化子pMDtm19-T-OsOPT7 Promoter，挑取单克隆进行测序验证，验证正确的克隆即为所要获得的转化子。

实验例2

OsOPT7Promoter::GUS转基因植株的获取

步骤1：重组表达载体OsOPT7Promoter::GUS的构建和农杆菌的转化

将实施例1所得pMDtm19-T-OsOPT7 Promoter用PstⅠ和NcoⅠ酶切，回收片段，将其与pCAMBIA1301的PstⅠ和NcoⅠ酶切载体部分用连接酶进行连接，OsOPT7启动子插入到pCAMBIA1301的GUS基因上游，得到启动子OsOPT7Promoter与GUS基因融合的植物表达载体OsOPT7Promoter::GUS农杆菌重组表达载体(附图1)。

步骤2：农杆菌转化

2.1农杆菌EHA105感受态细胞的制备

1)挑取农杆菌EHA105单菌落于含Rif(利福平)20mg/ml(购自inalco公司)的2mlYEP培养基(1L YEP培养基成分：酵母提取物1g(购自oxoid公司)，蛋白胨10g(购自oxoid公司)，蔗糖5g(购自北京化工厂公司)，MgSO₄.7H₂O 1.027g(购自北京化工厂公司)，调整PH为7.0)中28℃过夜活化；

2)取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5(4h)；

3)5k rpm离心5分钟；

4)在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞；

5)5k rpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl₂，即制得农杆菌感受态细胞。

2.2含有重组表达载体的农杆菌制备

1)加1ug DNA(OsOPT7Promoter::GUS农杆菌重组表达载体)于200ul农杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟；

2)液氮中冷冻1分钟；

3)37℃水浴融化农杆菌细胞；

4)加1ml YEP培养基，28℃摇床220rpm培养2-4h；

5)5000rpm离心1分钟，悬浮农杆菌细胞在100ul YEP培养基中；

6)取出菌液于含有相应抗生素的YEP平板上涂板，且YEP平板中含有Rif(rifampicin，利福平)25ug/ml和Kana(kanamycin，卡那霉素)50ug/ml，28℃培养2-3天，所长菌落即为含有OsOPT7Promoter::GUS重组表达载体的农杆菌。

2.3水稻转化受体的准备

取水稻成熟种子，脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：在超净台中先用70％的乙醇对种子进行表面预消毒30s-l min，倒去乙醇，用无菌水冲洗2-3次。加入5.0％次氯酸钠溶液，振荡消毒50min，倒去次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3-4次，最后一遍浸泡30min。

诱导与继代培养：将种子放在灭菌滤纸上吸干，把种子置入诱导培养基中，轻轻按一下，操作完毕用封口膜封好培养皿，25℃暗培养一个月，在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织，置入继代培养基中，在25℃继代培养6-8d。

2.4含有OsOPT7Promoter::GUS重组表达载体的农杆菌的培养

将含有OsOPT7Promoter::GUS重组表达载体的农杆菌EHA105在含有100mg/L Kana和50mg/L Str(streptomycin，链霉素)的YEP平板上划线，28℃黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的液体YEP中培养12-24h，然后以1∶50(v/v)的比例于同样的液体YEP(50ml)中进行扩大培养4-5小时，5000rpm离心5min收集菌液，用液体AAM培养基(20ml)重新悬浮，置于28度摇床轻微振荡培养30min-3h，该农杆菌悬浮液即可用于转化水稻愈伤。

2.5水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入50ml无菌三角瓶中，加入准备好的农杆菌悬浮液，置于28℃摇床轻微振荡培养20min。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，25℃黑暗培养2-3天。

2.6抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素和500mg/L的头孢霉素(cef，购自sigma公司)的筛选培养基上，26℃暗培养15天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选15天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。

2.7抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织先转至含有50mg/L潮霉素和250mg/L头孢霉素的预分化培养基上暗培养7-15天，然后转至分化培养基上15h/d光照条件下培养，一般经过6-10天就会有绿点出现。20-30天后进一步分化出小苗。

2.8生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm，根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。

组织培养与转化过程中用到的培养基如下：

表1.MS基本培养基

共培养培养基：MS基本培养基+GLn(146mg/L)+水解干络素(200mg/L)+2mg/L 2,4-D+蔗糖(30g/L)+0.7％琼脂+200mM AS(乙酰丁香酮)

愈伤诱导、继代培养基：MS基本培养基+GLn(146mg/L)+水解干络素(200mg/L)+2mg/L 2,4-D+蔗糖(30g/L)+0.7％琼脂+200mM AS

筛选培养基：MS基本培养基+GLn(146mg/L)+水解干络素(200mg/L)+2mg/L2,4-D+蔗糖(30g/L)+0.7％琼脂+200mM AS+3-5mg/L Bialaphos+150mg/L Timentin(特美汀)

预分化培养基：MS基本培养基+0.5mg/L IAA+0.5mg/L6-BA+蔗糖(25g/L)+0.7％琼脂+150g/L Timentin

分化培养基：MS基本培养基+0.5mg/L IAA+1.0mg/L 6-BA+蔗糖(25g/L)+0.7％琼脂+150g/L Timentin

壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.5mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA+蔗糖(20g/L)+0.7％琼脂+1mg/L多效唑

生根培养基：1/2MS基本培养基+0.2mg/L IAA+蔗糖(20g/L)+0.7％琼脂

2.9转基因植株的PCR检测转基因植株的DNA提取(CTAB小量提取法)

1)剪取适量再生植株叶片装于1.5ml离心管中，加入液氮碾磨成粉末状；

2)加入600ul 65℃预热的裂解缓冲液{1.3％CTAB(Hexadecyl TrimethylAmmonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵，购自Amresco公司)，133mmol/L Tris-HClpH8.0(Tris购自Amresco公司，HCl购自北京化工厂)，13mmol/L EDTA(购自Amresco公司)，0.93mol/L NaCl(购自北京化工厂)，0.66％PVP 3600(购自Amresco公司)，0.18mol/Lβ-巯基乙醇(购自北京鼎国生物技术有限责任公司)}，65℃水浴40min，期间翻转混匀2-3次；

3)加入800ul氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)混合液，翻转25次以上，室温静置5min，12,000rpm离心15min(25℃)，将上清转入1.5ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，12,000rpm，离心10min(RT)，弃上清，于沉淀中加入1ml 75％的乙醇洗涤，12,000rpm离心1min。倒掉上清液，通风干燥20min；

4)加100ul TE缓冲液(含Rnase A 20ug/ml)溶解DNA(4℃，30min以上)，置于-20℃保存。

转基因植株的PCR检测

PCR反应体系如表2所示，引物3(CMSF)和引物4(CMSR)为潮霉素基因(OsOPT7Promoter::GUS重组表达载体含有潮霉素抗性基因)特异的一对引物：

CMSF：5'-GATCGTTATGTTTATCGGCACT-3'，，如SEQ ID No:4所示；

CMSR：5'-TTGGCGACCTCGTATTGG-3'，如SEQ ID No:5所示。

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，Tm值复性45sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

表2.用于鉴定转基因植株的PCR反应体系(20ul)

结果如附图2所示，泳道1为以OsOPT7Promoter::GUS为模板的阳性对照；泳道2、3、5、6、7、8、9为转基因阳性植株；泳道4为转基因阴性植株；泳道10为阴性植株对照。

实施例3

转基因水稻的GUS染色

分离阳性转基因水稻的根、茎、叶等组织和器官置于1.5ml离心管内，加入适量的GUS染色液，37℃温育16-24小时(具体时间以染色充分为准)，用70％乙醇脱色及保存。结果如附图3所示，转基因植株的根、茎、叶、颖花和叶鞘等不同器官的维管束组织中检测到GUS基因表达，在其它的组织和器官中未见到GUS基因表达。

实施例3中GUS染色结果进一步表明，OsOPT7的启动子驱动与之连接的目的基因选择性的在维管束组织中表达，说明本发明提供了一种在转基因水稻维管束中特异表达外源基因的方法，为现代遗传育种技术的发展提供新的动力。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.植物维管束特异性表达启动子在水稻育种中的应用，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述应用为使与所述启动子连接的目的基因在水稻维管束中特异性表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

2)将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中，将转化后的水稻细胞、组织或器官培育成植株，获得转基因植株；

3)从转基因植株中筛选出具有外源功能基因的功能的植株。

3.植物维管束特异性表达启动子在水稻性状的改良中的应用，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述应用为使与所述启动子连接的目的基因在水稻维管束中特异性表达。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的操作步骤：

1)将用于改良水稻性状的目的基因，连接到包含所述启动子的重组表达载体中，将其转化到水稻细胞、组织或器官中；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改良水稻性状的目的基因为高效氮素运输基因。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述目的基因来源于水稻。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，对非水稻来源的目的基因按照水稻密码子应用偏好进行密码子优化。