CN109554374B - 二球悬铃木PaMYB82基因在调控植物表皮毛中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及二球悬铃木PaMYB82基因在调控植物表皮毛中的应用。所述的PaMYB82基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。生物学功能验证表明PaMYB82基因片段能够调控植物的表皮毛发育，将该基因超量表达转化植物，能够使转基因植物的表皮毛减少。

Description

二球悬铃木PaMYB82基因在调控植物表皮毛中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及二球悬铃木基因片段的分离克隆、功能验证及应用。所述的基因与植物表皮毛发育调控有关。将PaMYB82基因的完整翻译区(CDS区)连到带有花椰菜花叶病毒启动子的超量表达载体，转化模式植物拟南芥，转基因拟南芥表现出表皮缺失或毛减少的性状。

背景技术

植物表皮毛是由表皮细胞向外延伸发育而来的，根据不同的标准可以分为单细胞或者多细胞表皮毛；腺毛或者非腺毛；分支或者不分支表皮毛。作为表皮毛附着在植物的表面对植物有机械保护的作用，一些腺毛可以分泌化学物质，有利于植物对生物、非生物胁迫的防御以及信号传递。对于植物的表皮毛有些不会脱落，但是有些表皮毛会在植物的不同发育时期脱落。

二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)是一球悬铃木和三球悬铃木杂交而得到的，具有优于一球和三球的杂种优势。悬铃木因其树干高大、树形优美，冠大荫浓，抗逆性强等特征被广泛的应用于城市绿化，并享有“行道树之王”的美誉。但是悬铃木的一些缺点使其应用受到了一定的限制，例如其飞毛问题。悬铃木的飞毛问题主要表现在果毛的飘落和叶毛的飘落。对于果毛飘落问题可以通过控制其开花结果来解决，但是叶毛飘落的问题则需要从表皮毛发育方面来控制。本发明通过基因工程方法来调控悬铃木表皮毛发育相关基因PaMYB82的表达，从而培育出不飞毛悬铃木，从根本上解决二球悬铃木的飞毛问题。

发明内容

本发明的目的在于客服现有技术存在的缺陷，分离二球悬铃木基因PaMYB82，并将其应用于植物表皮毛调控应用上，生物学功能验证表明所述的PaMYB82基因与植物表皮毛发育性状调控相关。

本发明提供了在二球悬铃木中表达的PaMYB82的基因的核苷酸序列和该基因编码的蛋白质序列及其功能验证，具体包括：PaMYB82基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体的构建，以及利用该基因转化拟南芥，进行分子鉴定和表型观察。

本发明的提技术方案如下所述：

首先从二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)中克隆得到PaMYB82基因片段。该基因片段的开放阅读框为672bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0：1所示。

本发明还提供了二球悬铃木PaMYB82基因编码的蛋白质序列，其蛋白质序列序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了用于克隆获得二球悬铃木样品中PaMYB82基因的引物对。该引物对根据PaMYB82基因的核苷酸序列设计，以悬铃木不同部位混合样品作为模板进行PCR扩增，获得753bp的片段。扩增上述基因的引物对的DNA序列如下所示：

P1正向引物(F):5'CCTTATTACGGCCTTTTTCTGTCAT 3'，

P2反向引物(R):5'GAGACACAAAATGCTGAATCTCAGG 3'；

本发明还提供了如下所示的用于检测二球悬铃木PaMYB82基因在转基因拟南芥中表达的引物序列。引物根据PaMYB82基因核酸序列设计，以转基因拟南芥样品cDNA为模板进行RT-PCR扩增，来检测外源基因PaMYB82是否在拟南芥中表达，片段长度为123bp。引物对的DNA序列如下所示：

P3正向引物(F):5'CAAAAGAGACGACTCCAGGTCAAAG 3'，

P4反向引物(R):5'ATTGGCTCATCATTGCCTTCATCTG 3'；

本发明使用农杆菌介导法将克隆得到的PaMY82编码序列导入到植物细胞或组织。使用本发明的基因片段构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸序列的前面可加上任意一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工和改造，如加入具有抗性的抗生素标记基因(例如附加适宜浓度的卡那霉素或潮霉素等)，以提高转基因植物的筛选效率。

附图说明

图1：本发明涉及的中间载体

18-T及重组质粒图谱。附图标记说明：图1A为原始中间载体

18-T；图1B为重组质粒

18-PaMYB82的图谱。

图2：本发明涉及的超量植物表达载体pCAMBIA2300s图谱及重组质粒pCAMBIA2300s-PaMYB82图谱。附图标记说明：图2A为原始载体图，即，超量植物表达载体pCAMBIA2300s图谱；图2B为本发明构建的重组质粒pCAMBIA2300s-PaMYB82图谱。

图3：PaMYB82转基因拟南芥的表型图。附图标记说明：图3A为拟南芥叶片表型；图3B为拟南芥茎表型；图3C为拟南芥侧枝表型。其中上述图中：a为即野生型植株，即，未转基因(WT)植株,b,c,d为3个转基因株系。

图4：PaMYB82基因在转基因植株中的表达量情况。附图标记说明：#1，#3，#12为3个转基因株系；WT为野生型植株，即，未转基因植株。

图5：PaMYB82转基因拟南芥表皮毛相关基因表达量分析。附图标记说明：图5A为AtGL2和AtTTG2的表达量分析；图5B为部分R3MYB的表达量分析。上述图中：WT为野生型植株，即，未转基因植株；35S：：PaMYB82-1,35S：：PaMYB82-3,35S：：PaMYB82-12为3个转基因株系。

具体实施方式

序列表SEQ ID N0：1是本发明分离克隆的PaMYB82基因片段的核苷酸序列。序列全长为672bp，其中1-672bp是PaMYB82基因片段对应的氨基酸序列。编码223个氨基酸残基。

序列表SEQ ID NO：2是PaMYB82基因片段编码的蛋白质序列。

实施例1：PaMYB82基因的分离克隆

本发明的前期对二球悬铃木不同部位的混样进行了转录组测序，并根据转录组中PaMYB82的序列设计引物P1(正向引物)+P2(反向引物)，以二球悬铃木不同部位的混样cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到的片段如下所示：

CCTTATTACGGCCTTTTTCTGTCATAGAAACCTAGAGAGGAGAGAAAGATGGAGAGAGAAGGAACCAAGCAAGAGCTTAAGCTGAAGAAAGGTCCATGGAAACCAGAAGAAGACTTGCTTCTTAAAAAATATGTAGAGACTTGTGGAGAGGGGAAATGGGGAACTGTATCCAAGAGAGCAGGCTTGATGAGGGGAGGGAAGAGCTGCAGGCTTAGATGGAAGAACTATCTGAGACCCGACATCAAGCGTGGGGGGATGTCAGAGGAGGAAGAAGACCTTATAATCCGAATGCATAAGCTCCTTGGAAACCGCTGGTCATTGATTGCAGGTCGGCTCCCGGGCCGAACCGACAACGAAGTAAAGAATTACTGGAACACCCATCTTATGAAAAGGTACCCACAATACAAAAGAGACGACTCCAGGTCAAAGAGGAGGAAACTGTCTCATTCAGACAATTCAACAAACACCTGTGGCCCAAGTTCTACCAATACCATCAAAGGATCAGATGAAGGCAATGATGAGCCAATTGCTGCTCTCAATAACATGAACAGTTTCAATTACGATCCAGAATCCCCACAGTTTCCTAGCGAGGGGGAATTCTACGAGGAACCTGTACTGCCTCTTCTAGACTCAATTGTTTTGCTGGAGTCATTTAAATGCGGCGCCGAGAACTCTTCTCCATTTTACTTCCCCGAGGAAATGTACCCATTACTACTATAATAGGCTTGCCTGAGATTCAGCATTTTGTGTCTC(下划线的碱基分别是起始密码子和终止密码子)，

扩增产物中的49-720bp的序列就是本发明编码的蛋白质序列。

本实施例的具体操作步骤：

1、采用常用的CTAB法(参照：王关林，方宏筠主编，《植物基因工程》，科学出版社，2005年7月)从二球悬铃木叶片中提取总RNA，具体步骤如下：

1)取适量CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(配方：2％(W/V)CTAB；NaCl1.4mol/L,；EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L；Tris·Cl 100mmol/L；2％(W/V)聚乙烯吡咯烷酮K30(pvp)和2％的β-巯基乙醇，在水浴锅中65℃预热。

2)将二球悬铃木不同部位样品用液氮研磨成粉末，加入4ml预热的CTAB提取液，混匀，65℃水浴5min。

3)加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24：1)混合液，颠倒混匀，静置5min，4℃下10000rpm/min离心10min。

4)取上清3ml，重复步骤3)。

5)取上清，加入1/3上清体积的LiCl，-20℃沉淀10-12小时，10000rpm/min，4℃离心10min，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用。

6)以从二球悬铃木中提取的总RNA为模板，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)

将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：42℃2min,37℃15min，85℃5s(参照该公司的反转录试剂盒说明书)。

7)用特异引物P1(正向引物)+P2(反向引物)将PaMYB82基因从二球悬铃木中扩增出来。反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，Tm(59℃、59℃、58℃、63℃)30sec,72℃30s,37个循环；72℃延伸10min。

8)将扩增获得的PCR产物连入

18-T载体(

18-T载体结构见图1A，载体购自宝生物工程大连有限公司)，筛选得到阳性克隆并测序，获得所需的基因全长。该克隆被命名为

18-PaMYB82质粒(图1B)。

实施例2：PaMYB82基因超量表达载体的构建及转化拟南芥

为了能更好地阐明这些基因的功能，申请人将其在拟南芥中进行超量表达，根据转基因植株的表型来进行功能验证。具体操作步骤为：首先将实施例1中得到的阳性克隆

18-PaMYB82质粒用KpnⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收目的片段。同时，用同样的酶切位点将超量表达载体pCAMBIA2300s进行双酶切(超量表达载体pCAMBIA2300s为华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。双酶切之后，将包含PaMYB82基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(图2A,一种超量表达载体)载体用T4连接酶(购自宝生物工程大连有限公司)进行连接，转化大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆并进行酶切检测，得到转化载体，将其命名为pCAMBIA2300s-PaMYB82质粒(图2B)，将其电转到GV3101的农杆菌菌株中。

通过花序蘸染法侵染拟南芥，经过筛选具有卡那霉素抗性的转化苗，即为转基因植株。

本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的抗生素缩写表示如下：Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef(Cefotaxime，头孢霉素)。

本发明中所用到的表面活性剂缩写表示如下：吐温-77(silwet-77)。

(2)拟南芥侵染的步骤

1)农杆菌的培养

将含有目的载体的农杆菌GV3101在含有对应抗性(Km)选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L NaCl+Kan100mg/L+琼脂1.5g/L)上28℃培养2-3天，并挑取阳性单克隆接种于对应抗性(Km)选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L NaCl+Kan100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6-0.8。

2)拟南芥花序蘸染法

将摇好的菌液在5000rpm离心5min,并用5％的蔗糖溶液(附加20ul/100ml的拟南芥转化表面活性剂)重悬，将拟南芥花序在重悬液中浸泡30s左右，遮光保湿12-24h。

3)拟南芥转基因阳性苗的筛选

将收获的拟南芥转基因阳性苗种子用95％酒精消毒1-2min，接着在0.1％Hgcl消毒28-10min，最后用无菌水冲洗2-3次后平铺于MS培养基+50mg/LKm+50mg/LCef的培养基上进行筛选；筛将选出的阳性植株作PCR检测，在田间观察表型。

实施例3：PaMYB82转基因植株表型观测与RT-PCR检测

移栽后的拟南芥(转基因植株和未转基因植株)在16h光照/8h黑暗的长日照条件下进行培养，进行表型观察。结果发现，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的叶片，茎及侧枝的表皮毛显著减少(图3A,图3B和图3C)。

为了验证转基因拟南芥表皮毛的改变与转入的PaMYBB82基因有关，本发明采用了常用的RT-PCR方法对部分转基因拟南芥植株中PaMYB82基因的表达量进行了检测(结果见图4)。具体步骤如下：采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因拟南芥的3个株系中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为42℃2min,37℃15min，85℃5s(参照该公司生产的反转录试剂盒的说明书)。先用看家基因AtACT2(基因登录号：NM_112764)的引物对，正向引物：5-CCAGAAGGATGCATATGTTGGTG和反向引物：5-GAGGAGCCTCGGTAAGAAGA，对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，进行PCR检测。反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec,72℃30sec,26个循环；72℃延伸10min。试验结果如图4所示，看家基因AtACT2在野生型拟南芥和转基因拟南芥中均能扩增出来，并且亮度一致。然后，根据PaMYB82基因的序列，设计物P3(正向引物)，P4(反向引物)进行RT-PCR检测。反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec；60℃30sec,；72℃30s,；26个循环；72℃延伸10min。实试验结果表明，不同转基因株系的拟南芥内均检测到目的基因的表达(结果如图4所示)。

同时通过qRT-PCR方法检测了不同株系转基因拟南芥中表皮毛相关基因的表达量，结果如图5所示。结果AtGL2和AtTTG2的表达量明显上调(图5A))；同时，部分R3MYB的表达量也显著上调(图5B)。说明PaMYB82基因在转基因拟南芥中是通过调控这些基因的表达来调控表皮毛的。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 二球悬铃木PaMYB82基因在调控植物表皮毛中的应用

<141> 2018-01-06

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 672

<212> DNA

<213> 二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(672)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(672)

<400> 1

atg gag aga gaa gga acc aag caa gag ctt aag ctg aag aaa ggt cca 48

Met Glu Arg Glu Gly Thr Lys Gln Glu Leu Lys Leu Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

tgg aaa cca gaa gaa gac ttg ctt ctt aaa aaa tat gta gag act tgt 96

Trp Lys Pro Glu Glu Asp Leu Leu Leu Lys Lys Tyr Val Glu Thr Cys

20 25 30

gga gag ggg aaa tgg gga act gta tcc aag aga gca ggc ttg atg agg 144

Gly Glu Gly Lys Trp Gly Thr Val Ser Lys Arg Ala Gly Leu Met Arg

35 40 45

gga ggg aag agc tgc agg ctt aga tgg aag aac tat ctg aga ccc gac 192

Gly Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Lys Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

atc aag cgt ggg ggg atg tca gag gag gaa gaa gac ctt ata atc cga 240

Ile Lys Arg Gly Gly Met Ser Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile Arg

65 70 75 80

atg cat aag ctc ctt gga aac cgc tgg tca ttg att gca ggt cgg ctc 288

Met His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

ccg ggc cga acc gac aac gaa gta aag aat tac tgg aac acc cat ctt 336

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu

100 105 110

atg aaa agg tac cca caa tac aaa aga gac gac tcc agg tca aag agg 384

Met Lys Arg Tyr Pro Gln Tyr Lys Arg Asp Asp Ser Arg Ser Lys Arg

115 120 125

agg aaa ctg tct cat tca gac aat tca aca aac acc tgt ggc cca agt 432

Arg Lys Leu Ser His Ser Asp Asn Ser Thr Asn Thr Cys Gly Pro Ser

130 135 140

tct acc aat acc atc aaa gga tca gat gaa ggc aat gat gag cca att 480

Ser Thr Asn Thr Ile Lys Gly Ser Asp Glu Gly Asn Asp Glu Pro Ile

145 150 155 160

gct gct ctc aat aac atg aac agt ttc aat tac gat cca gaa tcc cca 528

Ala Ala Leu Asn Asn Met Asn Ser Phe Asn Tyr Asp Pro Glu Ser Pro

165 170 175

cag ttt cct agc gag ggg gaa ttc tac gag gaa cct gta ctg cct ctt 576

Gln Phe Pro Ser Glu Gly Glu Phe Tyr Glu Glu Pro Val Leu Pro Leu

180 185 190

cta gac tca att gtt ttg ctg gag tca ttt aaa tgc ggc gcc gag aac 624

Leu Asp Ser Ile Val Leu Leu Glu Ser Phe Lys Cys Gly Ala Glu Asn

195 200 205

tct tct cca ttt tac ttc ccc gag gaa atg tac cca tta cta cta taa 672

Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Pro Glu Glu Met Tyr Pro Leu Leu Leu

210 215 220

<210> 2

<211> 223

<212> PRT

<213> 二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)

<400> 2

Met Glu Arg Glu Gly Thr Lys Gln Glu Leu Lys Leu Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

Trp Lys Pro Glu Glu Asp Leu Leu Leu Lys Lys Tyr Val Glu Thr Cys

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Trp Gly Thr Val Ser Lys Arg Ala Gly Leu Met Arg

35 40 45

Gly Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Lys Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Gly Met Ser Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile Arg

65 70 75 80

Met His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu

100 105 110

Met Lys Arg Tyr Pro Gln Tyr Lys Arg Asp Asp Ser Arg Ser Lys Arg

115 120 125

Arg Lys Leu Ser His Ser Asp Asn Ser Thr Asn Thr Cys Gly Pro Ser

130 135 140

Ser Thr Asn Thr Ile Lys Gly Ser Asp Glu Gly Asn Asp Glu Pro Ile

145 150 155 160

Ala Ala Leu Asn Asn Met Asn Ser Phe Asn Tyr Asp Pro Glu Ser Pro

165 170 175

Gln Phe Pro Ser Glu Gly Glu Phe Tyr Glu Glu Pro Val Leu Pro Leu

180 185 190

Leu Asp Ser Ile Val Leu Leu Glu Ser Phe Lys Cys Gly Ala Glu Asn

195 200 205

Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Pro Glu Glu Met Tyr Pro Leu Leu Leu

210 215 220

Claims (1)

1.分离自二球悬铃木的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示的基因片段PaMYB82在调控拟南芥表皮毛中的应用，其特征在于将所述的PaMYB82基因片段构建超量表达载体转化拟南芥并观察表皮毛的表型。

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