CN103288945B - 一种棉花myb转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花GhGL1-5蛋白及其编码基因与应用。该蛋白GhGL1-5，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物表皮毛生长相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白和其编码基因对研究棉纤维发育调控机制，以及提高棉花产量和品质具有十分重要的意义。

Description

一种棉花MYB转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种棉花MYB类转录因子蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，其纤维作为重要的天然纤维，是纺织工业重要的原材料。棉纤维是由胚珠表皮细胞经分化、发育而形成的单细胞纤维。所有的胚珠表皮细胞都具有分化成棉纤维的潜能，但最终只有30％可形成纤维(张天真，2000)。其发育过程可分为起始、伸长、次生壁增厚和脱水成熟4个时期。这4个过程是多种基因相互作用、互成网络、共同表达调控的复杂过程(Ramsey and BerLin，1976)。棉纤维的起始、分化与伸长有相互重叠部分，对纤维的数量与长度影响较大；纤维伸长、初生壁合成和次生壁合成这两个时期部分重叠，对纤维品质的形成有密切的关系；尤其是在次生壁加厚期，该阶段纤维素的合成则对纤维的强度、马克隆值等性状影响较大(Naithanis and Rao 1981)。

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一，也是功能最多样化的家族，现已被证实其参与多种植物代谢途径。植物中第一个被鉴定分离出的MYB基因是1987年Paz-Ares等发现的与玉米色素合成有关的Clorlessl(C1)基因(Paz A J et al，1987)。

随着纺织工业的进一步发展，新的纺织技术对纤维的品质要求越来越高。因此，研究棉纤维发育及其相关基因表达调控具有重要的生物学理论意义和实际应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白，名称为GhGL1-5，来源于棉花(Gossypiumspp)。

本发明所述蛋白是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物表皮毛生长相关的由1)衍生的蛋白质。

所述蛋白中，所述表皮毛具体为种子上的表皮毛。

所述蛋白中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由280个氨基酸残基组成。

上述1)和2)中的GhGL1-5蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述1)和2)中的GhGL1-5蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.1所示的核苷酸序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。

编码所述GhGL1-5蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

本发明的又一个目的是提供所述蛋白的编码基因。

所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中SEQ ID №：1由共843个核苷酸组成，其中编码区长840bp，该编码区序列如序列表中SEQ ID №：1中第36-875位核苷酸所示，编码具有序列表中SEQ ID №：2所示氨基酸序列的蛋白，共280个氨基酸残基，即本发明所述的GhGL1-5蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物表皮毛生长中的应用。

所述应用中，所述调节植物表皮毛生长为使植物产生表皮毛或增加植物表皮毛的数量。

所述应用中，所述表皮毛具体为种子上的表皮毛。

所述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花。

本发明的还一个目的是提供本发明所述的蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育转基因植物中的应用；具体的，所述转基因植物具有如下至少一种性状：1)产生表皮毛；2)表皮毛数量增加。

所述应用中，所述表皮毛具体为种子上的表皮毛。

所述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花。

本发明再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将本发明所述的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状：1)产生表皮毛；2)表皮毛数量增加。

所述方法中，所述表皮毛具体为种子上的表皮毛。

所述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花。

本发明从棉花中克隆出GhGL1-5基因，成功构建植物过表达载体，采用农杆菌介导的花序浸染法转化模式植物拟南芥，与对照相比，转GhGL1-5基因拟南芥的种子产生了表皮毛。本发明公开的内容可为研究该基因在棉花中对纤维原始细胞分化的作用和是否促进棉纤维起始打下了基础，进而能够筛选出高衣分的棉花种质资源。此外，GhGL1-5能够在基因工程中应用，最终达到棉花遗传改良和提高棉花产量的目的。

附图说明

图1为转GhGL1-5基因拟南芥阳性株PCR鉴定结果图，其中，第1泳道为MARKERIII，第2泳道为阳性对照，第3泳道为阴性对照，第4泳道为空白对照，第5-25泳道为拟南芥阳性株。

图2为体视显微镜观察转GhGL1-5基因拟南芥的T1代种子，其中WT为野生型种子。

图3为扫描电镜观察转GhGL1-5基因拟南芥的T1代种子，其中WT为野生型种子。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料

酶及试剂盒：HS DNA Polymerase高保真酶、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、RNA反转录试剂盒均购自TaKaRa公司；KOD FX Neo酶(Code.No.KFX-201)购自TOYOBO公司；HD Cloning System试剂盒购自Clontech公司；质粒少量提取试剂盒购自OMEGA公司；DNAMarker购自TransGen公司；限制性内切酶(HindIII、BamH I、Sac I)购自NEB公司；植物总RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；荧光定量PCR SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自康为世纪。

其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素等购自宝生物工程大连有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京天根生化科技公司。

溶液的配制：本文中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。

培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。

主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(Hettich MIKRO200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、体视显微镜(SteREO Discovery.V8)、扫描电镜(Hitachi S-530)。

实施例1、棉花MYB转录因子的编码基因GhGL1-5的扩增

(1)总RNA的提取

徐州142(棉花新品种徐州142[J].农业科技资料，1976，(3).)种植于中国农业科学院棉花研究所试验地的，按一般大田管理。所取部位有根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、胚珠、不同发育时期的纤维，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。徐州142棉花总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒。

(2)RNA反转录为cDNA

采用TaKaRa的反转录试剂盒DRR037A将500ng RNA反转录为cDNA，按表1所示组份配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)；

表1

反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5s(反转录酶的失活反应)

(3)PCR扩增GhGL1-5基因

将反转录产物cDNA溶液稀释8倍作为PCR反应模板，以下述核苷酸序列为引物：

In-GhGL1-5F：5′-GACTCTAGAGGATCCACAGAGAGAGAGAGAGAGAC-3′，

In-GhGL1-5R：5′-ACCACCCGGGGATCCTCGTCGTCGTCATATCAG-3′；

根据TaKaRaHS DNA Polymerase高保真酶说明书，PCR反应体系如表2所示；

表2

PCR扩增程序为：

(4)PCR扩增产物的鉴定

将上述PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，上述PCR扩增得到具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，共911bp，其中编码区长840bp，该编码区序列如序列表中SEQ ID №：1中第36-875位核苷酸所示，编码序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸序列，共280个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID №：1的第36-875位核苷酸所示核苷酸序列的片段命名为GhGL1-5。

实施例2、GhGL1-5基因的功能验证

(一)植物过表达载体的构建

将上述测序正确的PCR扩增产物利用HD Cloning System试剂盒连接入植物表达载体pBI121中，将上述PCR扩增产物和pBI121线性化载体按照表3所示体系配置。

表3

将上述溶液混匀，50℃下反应15min，然后放在冰上，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆，测序验证序列的正确性。测序结果表明，所得质粒为在pBI121载体的BamHI酶切位点中插入了具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的外源基因片段，将该质粒命名为pBI121-35S::GhGL1-5。

(二)转GhGL1-5基因拟南芥的获得

1、重组农杆菌的获得

1)、CaCl₂法制备LBA4404感受态细胞

(a)挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于5ml含有抗生素(50mg/L硫酸链霉素、利福平)的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜；

(b)取2ml培养物于含抗生素的LB液体培养基中，28℃，170rpm培养至OD₆₀₀＝0.6左右；

(c)将菌液冰浴30min后，转入50ml离心管，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清；

(d)加入5ml预冷的70mM CaCl₂，轻轻悬浮，冰上静置20min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；

(e)加入2ml预冷的含15％甘油的70mM CaCl₂，重悬沉淀；

(f)悬浮液分装于无菌离心管中，每管200μl，液氮速冻后，-70℃保存备用。

2)、利用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：

(a)根癌农杆菌LBA4404感受态细胞100μl中加入质粒1μg(2-3μl)，混匀后冰浴30min；液氮速冻2-3min，37℃热激90s；

(b)冰浴5min，再加入800μl LB液体培养基；

(c)190rpm，28℃，培养4h后，4000rpm离心5分钟，吸去上清液至剩余400-500μl，反复吸打混匀后取200μL菌液涂在含有卡那霉素、硫酸链霉素和利福平的筛选培养基上，28℃培养大约36-48h，抗性菌落可见；

(d)挑取单菌落在1ml的含有三抗的LB培养基培养16h左右，直至浑浊；

(e)菌落PCR和酶切鉴定，筛选出阳性农杆菌株。

提取阳性重组菌的质粒送去测序，将测序正确的含有质粒pBI121-35S::GhGL1-5的重组菌命名为LBA4404/pBI121-35S::GhGL1-5。

2、采用花序浸染法转化拟南芥

(1)将-20℃保存的农杆菌菌液20μl接种到1ml LB液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜，取活化菌液200μl加入到20ml LB液体培养基28℃、180rpm振荡培养；

(2)待菌液OD值约为1.2-1.6时，3000rpm离心菌液收集菌体；

(3)转化介质配方为：5％蔗糖，0.03％silwetL-77(Steven J，1998)；

(4)用上述转化介质悬浮菌体，调OD至0.8开始浸染；

(5)将拟南芥花序置于转化介质中30-50s，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养24h后置于正常条件下培养。

3、转GhGL1-5基因拟南芥植株的鉴定

转GhGL1-5基因拟南芥植株中GhGL1-5基因的检测，具体过程如下：

(1)将收获的种子后用小种子消毒试剂盒(ZL201120381212.0，于霁雯)对种子进行消毒，然后在4℃条件下纯化3-4天后，种植于含卡那霉素的1/2MS上(琼脂浓度0.6％)，10天左右会观察到阳性、阴性植株区别，能够正常生长的可能为阳性株，移栽能够正常生长的拟南芥到培养室，生长至7-8片叶子时检测植株中是否转入基因GhGL1-5。

(2)对于转基因植株筛选所用的酶为KOD FX Neo的PCR酶，因此不用提取拟南芥的DNA，可以直接用活体叶片进行PCR。鉴定时用LBA4404/pBI121-35S::GhGL1-5重组农杆菌菌液作为阳性对照。以ddH₂O为空白对照，非转基因拟南芥DNA为阴性对照，PCR扩增时所用引物序列为：

In-GhGL1-5F：5′-GGACTCTAGAGGATCCACAGAGAGAGAGAGAGAGAC-3′，

In-GhGL1-5R：5′-GACCACCCGGGGATCCTCGTCGTCGTCATATCAG-3′；

引物序列中下划线部分表示与pBI121表达载体中的核苷酸序列重叠的15bp；

PCR的反应体系见表4。

表4

PCR的扩增程序为：

(3)分别取扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测结果见图1，共筛选出21株阳性株。上述选取的生长正常的转基因植株和阳性对照组中均可以检测到约843bp的条带，而空白对照和野生型拟南芥阴性对照组中均未检测到相应的DNA分子片段，说明GhGL1-5基因已整合到上述拟南芥基因组中。

(三)、转GhGL1-5基因拟南芥植株的表型

将转GhGL1-5基因T1代拟南芥、野生型拟南芥和转空载体拟南芥同等条件下种植栽培，收获T1代种子，分别观察转GhGL1-5基因拟南芥与野生型拟南芥的T1代种子。转空载体拟南芥与野生型拟南芥的表型一致。结果见图2，图2结果显示，转GhGL1-5基因拟南芥T1代种子产生了表皮毛，这些种皮毛在顶端有的分叉，这与拟南芥叶片表皮毛类似；有的则不分叉，同棉纤维类似；而野生型拟南芥的种子是没有表皮毛的。利用扫描电镜观察有表皮毛产生的种子，结果见图3。图2和图3结果显示，GhGL1-5基因能使拟南芥种子产生表皮毛。

分别统计两个GhGL1-5转基因株系L1和L4的T1代种子产生表皮毛概率。在L1中随机抽样，取出76粒种子体视显微镜观察发现有14粒种子有种皮毛产生；同样随机抽出38粒L4种子发现有8粒有种皮毛产生。两个株系有种皮毛的转基因种子出现的平均概率为20％左右。并且在这个过程中观察到这些转基因种子每粒上种皮毛数量在1-8根左右。

Claims (11)

1.一种蛋白，是如序列表中的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID No.1的第36-875位核苷酸所示的核苷酸序列；

2）编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因的引物对。

6.权利要求1所述的蛋白或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在促进植物表皮毛生长中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述促进植物表皮毛生长为使植物产生表皮毛或增加植物表皮毛的数量。

8.权利要求1所述的蛋白或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育转基因植物中的应用；所述转基因植物具有如下至少一种性状：1）产生表皮毛；2）表皮毛数量增加。

9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状：1）产生表皮毛；2）表皮毛数量增加。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥或棉花。