CN103288943A - bHLH13蛋白及其编码基因和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种bHLH13蛋白及其编码基因与应用。该蛋白bHLH13，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生长发育和抗病抗虫性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白和其编码基因可用来培育生育期短或抗病抗虫性增强的植物，为转基因植物的培育奠定了基础。

Description

bHLH13蛋白及其编码基因和其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与植物生长发育和抗病抗虫性相关蛋白及其编码基因和其应用。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科。拟南芥是现代国际和国内进行植物生物学研究的模式植物。对拟南芥基因功能的深入研究将有助于作物性状的遗传改良。

植物开花时间是一个重要的表型。在农业生产中，蔬菜等抽薹开花时间早晚对农业生产有重要影响。植物对病虫害的抗性强弱直接影响植物的生存。在农业生产中，作物对病虫害的抗性，直接关系着作物的产量。培育抗病虫的作物，可以减少农药的使用，提高产量，降低对人类健康的负面影响。

发明内容

本发明提供了一种植物bHLH13蛋白及其编码基因和其应用，所述bHLH13蛋白来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

本发明的一个目的是提供一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生长发育和抗病抗虫性相关的由1)衍生的蛋白质。

所述2)中，所述植物生长发育具体指植物抽薹开花。

所述2)中，所述植物抗病性具体指植物抗假单胞菌或灰霉菌的抗性。

所述2)中，所述植物抗虫性指植物抗食草性昆虫的抗性；具体为植物抗甜菜夜蛾幼虫的抗性。

所述2)中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由590个氨基酸残基组成。

上述1)和2)中的bHLH13蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述1)和2)中的bHLH13蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.1所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。

编码所述bHLH13蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

当所述核酸分子是DNA时，其序列是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1第1-1770位的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1773个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-1770位核苷酸，编码序列表中SEQ ID №：2所示的蛋白质，即本发明所述的bHLH13蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体为将具有序列表中SEQ ID №：1所示核酸序列的核酸片段插入pCambia1300载体的SalI和SpeI酶切位点之间得到的。

扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)-4)至少一种中的应用：

1)调节植物生育期；

2)调节植物抽薹开花时间；

3)调节植物抗病性；

4)调节植物抗虫性。

所述应用中，所述调节植物生育期为使植物的生育期提前；

所述应用中，所述调节植物开花为促进植物抽薹开花；

所述应用中，所述调节植物抗病性为增强植物抗病性；

所述应用中，所述调节植物抗虫性为增强植物抗虫性。

所述应用中，所述植物抗病性具体指植物抗假单胞菌或灰霉菌的抗性。

所述应用中，所述植物抗虫性指植物抗食草性昆虫的抗性；具体为植物抗甜菜夜蛾幼虫的抗性。

所述应用中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。

本发明的还一个目的是提供本发明所述的蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育转基因植物中的应用；具体的，所述转基因植物具有如下至少一种性状：1)生育期提前；2)抽薹开花时间提前；3)植物抗病性增强；4)植物抗虫性增强。

所述应用中，所述植物抗病性增强具体指植物抗假单胞菌或灰霉菌的抗性增强。

所述应用中，所述植物抗虫性增强指植物抗食草性昆虫的抗性增强；具体为植物抗甜菜夜蛾幼虫的抗性增强。

所述应用中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。

本发明又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将本发明所述的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状：1)生育期提前；2)抽薹开花时间提前；3)植物抗病性增强；4)植物抗虫性减弱；5)植物抗病性减弱。

所述方法中，所述植物抗病性增强具体指植物抗假单胞菌的抗性增强。

所述方法中，所述植物抗病性减弱具体指植物抗灰霉菌的抗性减弱。

所述方法中，所述植物抗虫性减弱指植物抗食草性昆虫的抗性减弱；具体为植物抗甜菜夜蛾幼虫的抗性减弱。

所述方法中，所述编码基因可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法导入植物。

本发明再一个目的是提供一种培养抗病性或抗虫性增强了的植物的方法，具体是下调出发植物中所述编码基因的表达，或将出发植物中所述编码基因的功能丧失。

所述方法中，所述植物抗病性增强具体指植物抗灰霉菌的抗性增强。

所述方法中，所述植物抗虫性增强指植物抗食草性昆虫的抗性增强；具体为植物抗甜菜夜蛾幼虫的抗性增强。

所述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟

本发明提供的bHLH13蛋白及其编码基因有助于促进人们对植物抗性的研究。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景，可以将该基因在植物中过表达，用来缩短植物发育期；或在植物中缺失表达该基因，用于制备抗病虫害植物，从而增加产量。

附图说明

图1为重组质粒pCambia1300-35S-bHLH13的结构示意图。

图2为转基因拟南芥中bHLH13基因转录水平的鉴定结果图。

图3为转bHLH13基因拟南芥的表型鉴定结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中所用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-0生态型：Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，种子号：CS6673。

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，简称农杆菌菌株GV3101。

实施例1、bHLH13基因的获得

提取拟南芥Columbia-0生态型花的RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物如下：

F1：acgcGTCGACatgaatattggtcgcctagtgtgg

R1：cggACTAGTctatctacctgatgatgttcttgac

得到的PCR产物送去测序。测序结果表明，上述PCR扩增得到的核酸片段包含酶切位点和具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的核酸片段；SEQ ID №：1所示核苷酸序列共1773bp，其中编码区长1770bp，该编码区序列如序列表中SEQ ID №：1中第1-1770位核苷酸所示，编码序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸序列，共590个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的核酸片段命名为bHLH13。

也可通过人工合成来制备具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的核酸片段。

实施例2、bHLH13基因的功能验证

(一)重组表达载体(pCambia1300-35S-bHLH13)的构建

1、用限制性内切酶SalI和SpeI双酶切实施例1得到的PCR扩增产物，得到酶切产物。

2、用限制性内切酶SalI和SpeI双酶切pCambia1300载体，回收约14kb的载体骨架。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒；测序验证序列的正确性；测序结果表明所得质粒为在pCambia1300载体的SalI和SpeI酶切位点之间插入具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的核酸片段，将该质粒命名为pCambia1300-35S-bHLH13；重组质粒pCambia1300-35S-bHLH13的结构示意图见图1。

(二)转基因植株的获得

1、转bHLH13基因拟南芥的制备

1)将重组质粒pCambia1300-35S-bHLH13电击转化农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌GV3101/pCambia1300-35S-bHLH13)。

2)28℃过夜培养步骤1的重组农杆菌并调整其浓度为OD₆₀₀＝0.8的菌液。

3)通过花浸泡法(花浸在步骤2的菌液中30秒)将重组质粒pCambia1300-35S-bHLH13导入拟南芥Columbia-0(即Col-0)，收获的种子即为T1代拟南芥的种子。

4)将T1代拟南芥的种子播种于含潮霉素(20mg/L)的MS培养基上进行筛选，得到25株具有潮霉素抗性的T1代拟南芥(编号依次为1-25)。

2、转bHLH13基因拟南芥的鉴定

1)转基因拟南芥中bHLH13基因的检测

待T1代拟南芥长至4-6片叶子时将其移栽到蛭石上生长45天(24℃；16小时/光照+8小时/黑暗)，分别提取25株T1代拟南芥叶子的DNA，用agaagacgttccaaccacgtc(与载体上的序列匹配)和ctatctacctgatgatgttcttgac组成引物对进行PCR鉴定，能扩增出1900bp的PCR扩增产物的即为转基因植株。共得到25株阳性T1代转bHLH13拟南芥。

2)转基因拟南芥中bHLH13基因转录水平的检测

25个株转基因株系的表型相似，下文以超表达bHLH13基因的转基因株系13OE1为例阐述转录水平的检测过程。

分别提取13OE1和Col-0野生型的幼苗RNA，并反转录为cDNA，用引物cgagttcaagggcttcagag和ccactgcatctgcccatt通过实时定量PCR分析bHLH13的表达水平。

qRT-PCR检测结果见图2。图2结果显示，13OE1中bHLH13的表达水平是野生型(Col-0)拟南芥的19倍左右。qRT-PCR检测结果进一步证明了bHLH13基因已整合到转基因T1代拟南芥的基因组中并且成功转录为mRNA。

(三)转bHLH13基因拟南芥的表型

25个株转基因株系的表型相似，下文以超表达bHLH13基因的转基因株系13OE1为例阐述转bHLH13基因拟南芥的表型。

1、转基因植株开花早于野生型植株

分别将13OE1、Col-0和转空载体对照植株种植在16小时光照(20-25℃)/8小时黑暗(19-22℃)的植物房中，统计从萌发到花序伸出的时间，即抽薹开花时间。转空载体对照植株的表型与Col-0一致。统计结果见图3。图3A结果显示，13OE1比野生型Col-0早开花约1.8天。该研究表明bHLH13促进拟南芥抽薹开花。

2、转基因植株灰霉菌的抗性弱于野生型植株

用浓度为10⁵/ml的灰霉菌孢子(JAV1 Controls Jasmonate-Regulated PlantDefense.Hu P，Zhou W，Cheng Z，Fan M，Wang L，Xie D.Mol Cell.201323：504-15)悬浮液处理在植物房生长4周的Col-0、13OE1和转空载体对照植株各30株以上。转空载体对照植株的表型与Col-0一致。结果见图3。图3B结果显示在处理6天后，13OE1较野生型Col-0表现出更严重的病症。该实验表明bHLH13基因降低拟南芥对灰霉菌的抗性。

3、转基因植株对假单胞菌Pst DC3000的抗性强于野生型植株用浓度为10⁸cfu/ml的假单胞菌Pseudomonas syringae pv.Tomato DC3000(PstDC3000)(The Arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae interaction.KatagiriF，Thilmony R，He SY.Arabidopsis Book.2002；1：e0039.)悬浮液处理在植物房生长4周的Col-0、13OE1和转空载体对照植株各30株以上。转空载体对照植株的表型与Col-0一致。结果见图3。图3C结果显示在处理5天后，13OE1较野生型Col-0表现出明显的抗性。该实验表明bHLH13基因增强拟南芥植株对假单胞菌Pst DC3000的抗性。

4、所述转基因植株对甜菜夜蛾夜蛾幼虫的抗性弱于野生型植株

对10条3龄的甜菜夜蛾幼虫(河南济源白云实业有限公司)称重，计算平均重量为8mg。之后将幼虫放入培养皿中，并在培养皿中加入50片以上4周的野生型Col-0、13OE1和转空载体对照植株的叶片。两天后，对10条幼虫称重，并计算平均重量。最终计算出幼虫的增重。转空载体对照植株的表型与Col-0一致。结果见图3。图3D和E结果显示，13OE1的叶片对甜菜夜蛾幼虫的抗性弱于野生型。甜菜夜蛾喂养13OE1后较喂养Col-0野生型后增重多。该研究表明bHLH13降低拟南芥对甜菜夜蛾的抗性。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生长发育和抗病抗虫性相关的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1第1-1770位的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。

6.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)-4)至少一种中的应用：

1)调节植物生育期；

2)调节植物抽薹开花时间；

3)调节植物抗病性；

4)调节植物抗虫性。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述调节植物生育期为使植物的生育期提前；

所述调节植物开花为促进植物抽薹开花；

所述调节植物抗病性为增强植物抗病性；

所述调节植物抗虫性为增强植物抗虫性。

8.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育转基因植物中的应用；具体的，所述转基因植物具有如下至少一种性状：1)生育期提前；2)抽薹开花时间提前；3)植物抗病性增强；4)植物抗虫性增强。

9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2-3任一所述的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状：1)生育期提前；2)抽薹开花时间提前；3)植物抗病性增强；4)植物抗虫性减弱；5)植物抗病性减弱。

10.一种培养抗病性或抗虫性增强了的植物的方法，具体是下调出发植物中权利要求2-3任一所述的编码基因的表达，或将出发植物中权利要求2-3任一所述的编码基因的功能丧失。

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