CN101914147A

CN101914147A - 植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN101914147A
Application number: CN 201010259901
Authority: CN
Inventors: 张增艳; 李钊; 辛志勇; 徐惠君; 杜丽璞; 周淼平
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2010-08-20
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2030-08-20
Also published as: CN101914147B

Abstract

本发明公开了一种植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列1衍生的蛋白质。将本发明蛋白的编码基因导入植物，可以得到抗病能力显著增强的转基因植物。本发明对于培育抗病植物，特别是抗纹枯病、赤霉病菌植物具有重要意义。

Description

植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

脂质转移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)是植物生命活动中一类重要的活性蛋白质，是可以结合脂质的富含半胱氨基酸的碱性、小分子蛋白，LTPs是一种分泌型蛋白，定位于细胞壁。脂质转移蛋白参与膜的生物合成和胞内脂肪酸库的调控以及植物防御反应，为病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PR)PR14家族的成员(Kirubakaran S.Isaac，Begum S.Mubarak，Ulaganathan K.，Sakthivel N.2008，Characterization of a new antifungal lipid transfer protein from wheat，Plant Physiology and Biochemistry 46：918-927)。研究证明，一些LTPs在体外可以抑制一些真菌病原菌的生长，并具有协同增强防御素与硫瑾等其他抗菌肽对微生物抗性的能力(Marion D.，Douliez J.P.，.Gautier M.F，.Elmorjani K，Plant lipid transfer proteins：relationships between allergenicity and structural，biological and technological properties，in：E.N.C.Mills，P.R.Shewry(Eds.)，Plant Food Allergens，Blackwell Science，Oxford，2004，pp.57-69)。不同的LTPs对病原微生物的抑制活性不同。

赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的小麦和大麦重要病害，遍及全国，一直是淮河以南及长江中下游麦区发生最严重的病害之一，在大流行年份，产量损失可达10％-40％。由于赤霉病菌分泌在穗部子粒间、子粒中的毒素，不仅对植物有害，还对人、畜有毒，因此小麦和大麦一旦发生赤霉病，收获的其子粒就不可使用。近年，小麦土传病害特别纹枯病在我国小麦生产区危害日益严重。小麦纹枯病又称小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG4，AG5融合群引起的土传真菌病害。纹枯病一般可使小麦减产10％-20％，严重地块减产50％以上。据江苏省植保站统计，1995年全省小麦因纹枯病造成的损失达3.72×10⁶吨，超过江苏省当年小麦赤霉病和白粉病引起损失之和。据全国农技推广中心报道，2004年我国有1.2亿亩遭受纹枯病的危害，2005年小麦纹枯病发生面积达1亿亩。另外，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)还可引起水稻、玉米纹枯病，造成着2种作物严重减产。近年来，赤霉病和纹枯病已对我国粮食安全构成严重威胁，成为我国粮食生产中亟待解决的重要问题。由于赤霉病和土传病害难以预测和预防，培育和利用抗病品种是防治这些病害的最经济有效的措施之一。然而，赤霉病和纹枯病抗性是由多个基因控制的数量性状，作物种属内抗源匮乏，常规育种进展缓慢。抗病有效基因的发掘与克隆，以及应用基因工程创造抗病新种质，为解决上述问题开辟了一条新途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来源于小麦属小麦(Triticum aestivum Linn.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第58至405位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在高严谨条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码抗病相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码抗病相关蛋白的DNA分子。

所述高严谨条件为在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为在pAHC25载体的多克隆位点插入所述基因得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到抗病能力高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦(如小麦品种扬麦18)、大麦、玉米或水稻。所述抗病可为抗纹枯病和/或抗赤霉病。所述纹枯病具体可为由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的纹枯病，如禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301引起的纹枯病。所述赤霉病具体可为由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的赤霉病，如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F15引起的赤霉病。

所述基因、所述重组表达载体或所述方法均可用于培育抗病植物。育种时，可以将所述基因导入小麦，筛选可表达所述基因的转基因植株，并进行接种、抗病鉴定，得到抗病小麦。

本发明克隆出小麦TaBS108基因的全长编码cDNA序列，构建了该基因的单子叶表达载体，利用基因枪将该基因载体导入小麦，并对T0、T1代转基因植株进行分子检测和对T1代分子检测阳性植株接种纹枯病致病菌进行抗病鉴定，得到了抗纹枯病(IT≤1)的T1代转基因小麦和赤霉病抗性提高的T1转基因代小麦植株。本发明对于抗病植物的育种具有重要意义。

附图说明

图1为从小麦cDNA中PCR扩增TaBS108基因(WBS108)序列的电泳图；泳道1和2为PCR扩增产物(TaBS108)；M为DNA分子量100bp标准(购自大连宝生物公司)；箭头指的条带大小为538bp。

图2为重组质粒pA25-WBS108的结构示意图。

图3为部分再生植株的PCR鉴定结果。

图4为接种禾谷丝核菌R0301后转TaBS108基因植株和扬麦18的表型。

图5为部分转TaBS108基因植株的RT-PCR检测图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。T₀代表示由基因枪得到的转基因植株，T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株。

小麦品种苏麦3号：购自江苏省农业科学院(江苏太湖地区农业科学研究所于1974年通过Funo/台湾小麦杂交育成的抗赤霉病小麦品种)。小麦品种扬麦18：购自江苏里下河地区农业科学研究所。小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301：购自江苏省农业科学院。小麦赤霉病致病菌-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F15：购自江苏省农业科学院。

单子叶植物表达载体pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子)：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Christensen and Quail，1996；Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research，5，213-218。

实施例1、TaBS108蛋白及其全长cDNA序列的发现

一、TaBS108蛋白及其全长cDNA序列的发现

1、将生长四周的小麦品种苏麦3号幼苗的叶片接种赤霉病菌；

2、48小时后，用TRIZOL的方法提取叶片的总RNA，按照大连宝生物公司提供的方法合成cDNA第1条链，并以其作为PCR扩增、克隆TaBS108的模板；

3、设计的一对PCR扩增引物(WBS108-U和WBS108-L)。

WBS108-U：5’-CCCATCTCACCATCTCCA-3’；

WBS108-L：5’-TCCTCTCGCTGTCACGCA-3’。

4、以步骤2的cDNA为模板，用步骤3的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物。

PCR反应总体积为25μL，包括2μL cDNA(50ng)，100μmol/L dNTP，0.4μmol/L每条引物，1U LA-Taq酶及2×GC PCR缓冲液(均购自大连宝生物公司)。

PCR反应程序为：95℃预变性3min；然后94℃ 35s，56℃ 30s，72℃ 45s，5个循环；再进入94℃ 35s，54℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；最后72℃，8min补平末端。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图1。结果表明，从接种赤霉病菌的苏麦3号叶片cDNA中扩增出一条约538bp的带。

5、将538bp的带回收，克隆到pMD18-T载体上，经过菌落PCR分析后，挑选5个阳性克隆进行测序分析。测序分析结果表明，该DNA片段具有序列表中序列2的全长ORF的核苷酸序列，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

二、序列分析

将序列表的序列1所示蛋白质命名为TaBS108蛋白，由115个氨基酸残基组成。将TaBS108蛋白在NCBI进行GenBank的BLASTP比较和结构域分析。结果表明，TaBS108蛋白具有nsLTP1典型结构域，是1个典型的nsLTP，TaBS108蛋白的氨基酸序列与大麦的LTP(Q42842)氨基酸序列具有91％一致性，与小麦的LTP1(ABF14725)氨基酸序列具有88％一致性。

将TaBS108蛋白的编码基因命名为TaBS108基因，其开放阅读框为自序列表中序列2的5′末端的第58位至第405位核苷酸。

实施例2、转TaBS108基因小麦植株的获得及其抗病性分析

一、重组表达载体的构建

1、提取苏麦3号幼苗叶片的RNA，反转录为cDNA；

2、以步骤1的cDNA为模板，用WBSO-SMF和WBSO-SAR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(携带SmaI和SacI位点的TaBS108基因全长ORF)。

WBSO-SMF：5’-AT CCCGGG ATGGCTCGCGGTGCAGCTA-3’(下划线标注SmaI酶识别位点)；

WBSO-SAR：5’-TT GAGC TCAACGAATCTTAGAACAGTCCA-3’(下划线标注SacI酶识别位点)。

PCR反应程序：先95℃预变性3min；然后95℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；最后72℃ 10min补平末端。

3、回收PCR扩增产物，与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，得到重组载体pTWBS108。

4、用限制性内切酶SmaI和SacI酶切重组载体pTWBS108，回收约370bp的片段。

5、用限制性内切酶SmaI和SacI酶切单子叶植物表达载体pAHC25，回收载体骨架。

6、将步骤4回收的片段和步骤5回收的载体骨架连接，得到连接产物。

7、将连接产物进行测序，测序结果表明得到了重组质粒pA25-WBS108。

重组质粒pA25-WBS108的结构示意图如图2所示：骨架载体为pAHC25，在SmaI和SacI酶切位点之间插入了序列表中序列2的5′末端的第58位至第405位核苷酸所示的TaBS108基因；TaBS108基因受Ubiquitin启动子控制；质粒还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。

二、转基因植物的获得

1、将1000块扬麦18的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pA25-WBS108轰击到愈伤组织。

2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。

3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB₁ 1mg/L，天冬门酰胺150mg/L，2，4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2 MS培养基+NAA1mg/L+KT 1mg/L+Bialaphos2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2 MS培养基+Bialaphos 2-3mg/L)，24-26℃光照培养；获得了110株再生植株。

5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L NAA)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆，在移栽到温室3周以后，有105株植株成活。

6、分子鉴定

在4叶期，每株成活的再生植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaBS108基因特异的一段序列作为上游引物(WBST-U)，载体TNOS序列特异的一段序列作为下游引物(TNOS-L)进行PCR。

WBST-U：5’-ATATCCTGCGGTCAGGTGAC-3’；

TNOS-L：5’-ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3’。

PCR扩增体系(20ul)：2×GC Buffer 10ul，WBST-U(10um)0.5-1ul，TNOS-L(10um)0.5-1ul，基因组DNA 1ul，r-Taq(5U/ul)0.2ul，dNTP(2.5mM)1.5ul，H₂O补至20ul。

PCR扩增程序：94℃ 3min；35×(94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s)；72℃ 8min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外拍照。

扩增得到458bp条带(TaBS108-TNOS基因片段)的植物为转基因植物。部分植株的PCR检测结果如图3所示。图3中，M为100bp分子量标准，泳道-为ddH₂O，泳道WT为扬麦18，泳道1、2、4、6、8、12为PCR阳性植株，泳道3、5、7、9、10、11为PCR阴性植株，泳道+为质粒pA25-WBS108(阳性对照)。获得转TaBS108基因T₀代PCR阳性植株13株，转化率为1.30％。

三、转空载体植物的获得

用载体pAHC25代替重组质粒pA25-WBS108，其它同步骤二，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。

四、转基因植物的纹枯病菌抗性鉴定

在网室田间种植如下小麦材料：转TaBS108基因T₁代植株189株(10株行，每行18-20株)，转空载体T₁代植株(1株行，20株)和野生型扬麦18(2株行，每行20株)；拔节期(约8周后)，采用蔡士宾等的牙签培养法[蔡士宾，任丽娟，颜伟，吴纪中，陈怀谷，吴小有，张仙义.2006，Germplasm development and mapping of resistance to sharp eyespot(Rhizoctonia cerealis)in wheat.中国农业科学，39(5)：928-934]接种禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301的菌丝到小麦叶鞘部，浇水保湿5-7天，隔一周喷水2-3次。

在收获时拍照并考察叶鞘和茎秆的发病情况。病情分级标准按照李斯深等方法进行(李斯深，李安飞，李宪彬等.1997，小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4)：31-33)：IT 0：无病；1级：第1、2叶鞘发病，但茎秆无病；2级：第1、2叶鞘发病，但病斑绕茎秆小于1/3；3级：第3、4叶鞘发病，或病斑绕茎秆1/3-2/3；4级：第5、6叶鞘发病，或病斑绕茎秆2/3-1周；5级：出现枯、白穗或整株枯死。

转TaBS108基因T₁代189株植株中，126株(66.7％)转TaBS108基因植株IT≤1，转空载体植株的平均IT为2.69，扬麦18的平均IT为2.68。对纹枯病抗病性鉴定结果表明，大多数转TaBS108基因植株对纹枯病抗性强于转空载体植株和扬麦18。其中一株抗纹枯病小麦植株TB3(IT为0)和扬麦18(IT为4)的照片见图4。

五、转基因植物中TaBS108基因表达量的检测(RT-PCR)

1、步骤四中进行病情评级时，取各个株系的叶片，提取RNA，反转录为cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板，然后以TaBS108基因特异引物(WBS-QF和WBS-QR)进行PCR反应分析转基因表达量；用组成性表达的18S rRNA基因(18SrRNA：F：5’-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3’，R：5’-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3’)作为内参，调整扩增模板mRNA/cDNA的起始浓度一致(即均一化)。

WBS-QF：5’-GGCGATATCCTGCGGTCA-3’；

WBS-QR：5’-GCACGCTGCTTGCTTGTCA-3’。

部分RT-PCR结果见图5。图5中，WT代表样本为野生型扬麦18的单株，TB1-TB9分别代表样本为TB1-TB9的单株，各个泳道上的IT即该单株的IT值。扩增得到151bp为TaBS108基因表达量较高的转基因阳性植株。与抗病性关系比较发现，TaBS108表达量越高的转基因阳性植株对纹枯病抗性就最强，说明TaBS108超量表达增强了转基因小麦对纹枯病的抗性。

六、转基因植物的赤霉病菌抗性鉴定

转TaBS108基因T₁代植株22株；种植于江苏生物技术研究所网室田间，于开花期注射接种禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F15分生孢子液(500孢子/10μL)到小麦中心穗部，保湿3-5天，并于接种21天统计病小穗率。采用周淼平等的方法评价病小穗(Zhou M.P.，Hayden M.J.，Zhang Z.Y.，Lu W.Z.and Ma H.X.2010.Saturation and mapping of a major Fusarium head blight resistance QTL on chromosome 3BSof Sumai 3 wheat.J Appl Genet.51：19-25)。

转空载体植株的病小穗率平均值为17.3％，野生型扬麦18的病小穗率平均值为16.6％，22株转TaBS108基因植株中，筛选到赤霉病抗性提高的转基因植株8株(见表2，病小穗率为7.5-12.7％)，表明转TaBS108基因小麦对赤霉病抗性得到提高。

表2 赤霉病抗性提高的转基因小麦植株

植株编号	赤霉病病小穗率(％)
		TB2-4	11.9
TB3-1	12.7
		TB4-5	10.2
TB5-3	7.5
		TB6-6	8.2
TB7-2	12.5
		TB8-6	8.0
TB12-1	9.0

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第58至405位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将权利要求2或3所述基因插入载体pAHC25的多克隆位点得到的重组质粒。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到抗病能力高于所述目的植物的转基因植物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗病为抗纹枯病和/或抗赤霉病；所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为小麦、大麦、玉米或水稻。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述纹枯病是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的；所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)具体为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301；所述赤霉病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的；所述禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)具体为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F15。

10.权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组表达载体或权利要求6至9中任一所述方法在培育抗病植物中的应用。