CN102796748B - 一个小麦非特异性脂转移蛋白基因及其所编码的蛋白质和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个小麦非特异性脂转移蛋白基因及其所编码的蛋白质和应用，属于基因工程领域。TaLTP-B的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自普通小麦（Triticum asetivum L.）品种望水白，在抗赤霉病小麦品种望水白中受赤霉菌诱导表达增强，且表达水平远高于感赤霉病小麦品种Alondra’s中的表达水平。将TaLTP-B基因转化感赤霉病小麦品种扬麦158，对转基因T0代植株进行赤霉病抗性鉴定，结果表明TaLTP-B基因的过量表达可以提高扬麦158对赤霉病的抗性。TaLTP-B基因可在培育抗赤霉病和白粉病小麦品种中应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，公开了一个小麦非特异性脂转移蛋白基因及其所编码的蛋白质和应用。
背景技术
小麦赤霉病（FHB）是一种真菌性病害，它能对小麦、大麦以及玉米等禾谷类作物产生病害而直接造成作物减产和品质下降；另一方面，收获的粮食由于被病原菌产生的deoxynivalenol（DON）和其他一些单端孢霉烯类毒素所污染，人和动物食用后，均会危害健康。目前随着全球气候的变暖，该病在全世界各个小麦种植区迅速蔓延，在我国小麦主产区也日趋严重，控制小麦赤霉病的发生发展对于小麦安全生产意义重大。
小麦白粉病是小麦的第二大病害，尽管已经发现了多个抗白粉病基因位点，但由于小麦白粉病菌的专性寄生特性，小种专化抗性的抗病基因很容易丧失抗性，需要不断发掘新的抗病基因资源，特别是具有广谱抗性的基因资源。
选育抗赤霉病小麦品种是控制赤霉病最经济和有效的途径。明确其抗病机制，克隆抗病相关基因，对于防治小麦病害、开展抗病育种改良具有重要理论指导意义。小麦抗病分子机制是目前小麦赤霉病研究的热点课题。赤霉病病原菌与寄主小麦之间的互作关系十分复杂。赤霉病菌具有腐生兼寄生的特性，既能在死体植物上生活，也能从活体寄生植物上汲取营养；小麦对赤霉病抗性是非小种专化的，同时也是多基因控制的数量遗传性状。分析病原菌-寄主互作过程中的基因表达情况，有助于发掘抗病基因和发现抗病通路，并进一步阐明抗病的分子机制。通过构建受赤霉病菌诱导表达的cDNA文库、SSH文库，利用双向电泳结合质谱技术、芯片技术等，筛选出了可能与赤霉病抗性相关的基因或蛋白，包括各种病程相关蛋白、细胞色素P450、葡萄糖基转移酶、ABC转运蛋白等，也发现了茉莉酸途径、乙烯途径等信号通路与赤霉病抗性关。
小麦地方品种望水白是到目前为止普遍公认的赤霉病抗性强而且稳定的小麦品种，在其染色体臂3BS上定位了一个抗FHB的主效QTL。利用快中子辐射，获得了一个望水白感赤霉病突变体NAUH117。本研究利用基因芯片技术，比较分析望水白及NAUH117受赤霉菌诱导的基因表达谱，结合基因芯片杂交结果和电子定位信息，在望水白中克隆了一个非特异性脂转移蛋白基因（TaLTP-B），该基因定位于3BS抗FHB主效QTL区域，且位于突变体NAUH117的缺失区段；利用基因枪技术将其转化感赤霉病病小麦品种扬麦158中，以期提高赤霉病抗性和白粉病抗性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B及其应用。
本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。
本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B，来自普通小麦（Triticum asetivum L.）品种望水白，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
该非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B编码的蛋白质TaLTP-B，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
含有所述的非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B的表达载体。
含有所述的非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B的表达载体优选以pBI220为出发载体，将所述的TaLTP-B基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位点间所得。
所述的非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B在培育抗赤霉病和白粉病小麦品种中的应用。
所述的非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B的表达载体在培育抗赤霉病和白粉病小麦品种中的应用。
有益效果：
本发明从小麦中克隆得到了一个非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B及其所编码的蛋白质TaLTP-B。TaLTP-B可用于基因工程育种，将其插入表达载体pBI220，得到该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感赤霉病和白粉病小麦品种对赤霉病和白粉病的抗性。
附图说明
图1利用普通小麦中国春第三部分同源群缺体-四体和部分3B短臂缺失系材料对TaLTP-B基因进行染色体区段定位，将TaLTP-B定位到3BS的0.78-0.87区段
1，Marker；2，望水白(Wangshuibai)；3，H117；4，中国春(Chinese Spring)；5，中国春缺体-四体N3A/T3B；6，中国春缺体-四体N3B/T3D；7，中国春缺体-四体N3D/T3A；8，中国春缺失系3BS-1；9，中国春缺失系3BS-9；10，中国春缺失系3BS-8；11，中国春缺失系3BS-3；12，水(ddH2O).
图2TaLTP-B在望水白、NAUH117和感赤霉病小麦品种Alondra’s受赤霉菌和DON诱导后的穗组织中的实时荧光定量RT-PCR分析
X轴：0h、12h、24h、48h、72h、96h分别表示小麦穗组织受赤霉菌诱导的不同时间段；Y轴：TaLTP-B基因在不同样品中受赤霉菌诱导前后的表达倍数。
图3TaLTP-B过量表达载体构建
图4TaLTP-B基因转化扬麦158的T0代阳性转基因植株PCR分子鉴定结果
泳道1为Marker，泳道2为未转化扬麦158对照，泳道3为包含目的基因的质粒，泳道4为水空白对照，泳道5为阳性转化植株T0-3，泳道6为Marker，泳道7-16依次为阳性转化植株T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-55、T0-58、T0-61、T0-65、T0-67、T0-68。
图5TaLTP-B基因转化扬麦158的T0代阳性植株Q-RT-PCR分析结果
X轴：T0-3、T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-55、T0-58、T0-61、T0-65、T0-67、T0-68为阳性转化植株，T0-26为阴性转化植株，扬麦158为转基因受体小麦；Y轴：TaLTP-B基因在转基因植株中相对于扬麦158的表达倍数。
具体实施方式
实施例1望水白受赤霉菌诱导的穗组织中一个非特异性脂转移蛋白基因克隆
望水白（公知公用材料，裴自友，贾高峰等.普通小麦籽粒DON含量的配合力分析,作物学报,2007,33(5):731-737）是高抗赤霉病的材料。本实验室在前期研究中，利用快中子辐射望水白，筛选获得感赤霉病突变体NAUH117（公知公用材料，Jin Xiao,Xinping Jia,et al.Afast-neutron induced fragment deletion of 3BS in wheat variety Wangshuibai increased itssusceptibility to Fusarium head blight.Chromosome research,2011,19:225-234），该突变体发生了较复杂的染色体结构重排，导致定位于3BS上的抗赤霉病主效位点Fhb1缺失，因而感赤霉病性显著提高。为了获得望水白中与赤霉病抗病相关的基因，本研究利用小麦基因芯片筛选望水白和NAUH117赤霉菌接种前后的差异表达基因，从中选择重要基因进行功能验证。
在抽穗期对小穗采用单花滴注法接种赤霉菌，将赤霉菌分生孢子悬浮液浓度调整为5,000个/ml，于中部小花注射10μl孢子悬浮液，采用人工弥雾保湿方法温室弥雾保湿3天，赤霉菌株是从田间自然发病植株上分离和培养得到（赤霉菌采集和培养方法见：刘传琴，关淑卿，黄巍.小麦赤霉菌分离培养及接种,现代化农业，1998：9），用不含赤霉菌的水接种作为阴性对照，共4个处理。接种后24h取穗样，用TRIZOL(Invitrogen，CA，USA)按试剂说明书分别提取总RNA，进行基因芯片杂交（Affymetrix小麦基因表达谱芯片，part number 900515），该实验在“上海国家生物芯片工程中心”完成。以实验组信号与对照组信号比值大于2为标准筛选上调表达基因。其中1个基因推测为非特异性脂转移蛋白（nonspecifc lipid-transfer protein，探针号为EST-432，增加倍数为24.2倍），在望水白中受赤霉菌诱导上调表达，在NAUH117中不表达，挑选进行候选基因克隆研究。根据探针EST-432序列设计引物，P1（TCTGCCTGAGCTCACTACCA（SEQ ID NO.3））和P2（ATATGTGGGTGTGCGTGTGT（SEQ ID NO.4）），以望水白受赤霉菌诱导后24h的穗部组织cDNA为模板，通过PCR技术克隆望水白中该基因的cDNA全长。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，发现望水白比NAUH117多扩增出一个条带，推测该条带为染色体3BS的特异扩增条带，将该特异条带回收并克隆到pMD18-T载体中，转化DH5α感受态细胞，挑选含有目的片段的单克隆进行测序。对测序结果进行分析，获得了大小为491bp的序列，序列如SEQ ID NO.1所示。通过NCBI网站中的ORF finder搜索该获得序列的开放阅读框，发现其包含一个全长ORF的基因，其中5’-UTR（非翻译区）43bp、3’-UTR100bp、ORF（开放阅读框）348bp，编码115个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示，利用SignaIP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析了编码蛋白，该蛋白N端具有26个氨基酸的信号肽，将该基因命名为TaLTP-B。
实施例2TaLTP-B基因的染色体定位
根据TaLTP-B基因序列设计特异引物P3（AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC（SEQ ID NO.5））和P4（TGCTCGATCAGCGAATCTTA（SEQ ID NO.6）），以一套普通小麦品种中国春的缺体-四体以及缺失系基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，对TaLTP-B基因进行染色体物理定位。PCR程序：10-50ng/ul基因组模板，10μM的5’引物和3’引物各0.4μl；2.5μl 10×buffer；2μl 2.5mM的dNTP；2μl 25mM的Mg2+；0.2μl(5U/μl)Taq polymerase（TaKaRa），加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃45s，57℃45s，72℃1min，33个循环；72℃延伸10min。PCR产物经8%的聚丙烯凝胶电泳检测。该引物只在第3部分同源群缺体-四体中出现扩增带型的差异，TaLTP-B在N3B/T3D和NAUH117中扩增都缺少一条190bp的条带，结果表明TaLTP-B位于3B染色体上，并且在NAUH117缺失。进一步在中国春3BS的缺失系（公知公用，Jin Xiao，Xinping Jia,et al.A Fast-neutron Induced Fragment Deletion of 3BS in wheat variety WangshuibaiIncreased Its Susceptibility to Fusarium Head Blight.Chromosome Research,2011,19:225-234.）中扩增对TaLTP-B进行染色体区段定位，将该基因定位于3BS8FL0.78-0.87的染色体区段，即位于望水白3BS抗FHB主效QTL区域（图1）。
实施例3TaLTP-B基因受赤霉菌诱导的表达特征
应用能特异扩增TaLTP-B的特异引物P3（AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC（SEQ ID NO.5））和P4（TGCTCGATCAGCGAATCTTA（SEQ ID NO.6）），对该基因受赤霉菌诱导进行实时荧光定量PCR（Q-RT-PCR）分析。PCR反应在实时荧光定量PCR仪（MyIQ，Bio-Rad，USA）上扩增并检测荧光。20uL PCR反应体系中含2×SYBR Green PCR Master Mix 10uL，0.4nmol/uL引物P1和P2，反转录产物2uL。扩增参数为：95℃10min，然后95℃15s、58℃30s，72℃1min，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平定量用MyiQ系统软件进行分析。结果表明，在望水白中TaLTP-B受赤霉菌诱导上调表达，72h后表达水平达到峰值，之后开始下调；在NAUH117中TaLTP-B缺失，因此在赤霉菌诱导前及诱导后的各个时段都不能检测其表达。在感赤霉病小麦品种Alondra’s（公知公用，李明浩,陈炜,邢莉萍,等.普通小麦品种Alondra's遗传转化体系的建立.植物学报,2010,45(4):466-471）中，其表达水平在各个时间段也都低于在望水白中的表达量（图2）。Q-RT-PCR的结果表明，TaLTP-B可能与赤霉病抗性相关。
实施例4TaLTP-B正义表达载体构建及其转化普通小麦扬麦158
以TaLTP-B基因cDNA为模板（制备方法见实施例1），使用引物对P5（CGGGATCCATGGCCCGTTCTG（SEQ ID NO.7））和P6（GGGGTACCTCAGCGAATCTTA（SEQ ID NO.8））进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和KpnI双酶切将扩增目标片断插入到载体pBI220（Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive andversatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6:3901-3907.）的35s启动子后面的多克隆位点BamHI和KpnI之间。由此将目标基因TaLTP-B克隆到强启动子35s的下游，获得表达载体pBI220:TaLTP-B（图3）。
将构建好的过量表达载体通过基因枪法转化扬麦158，挑选2800个幼胚愈伤进行基因枪轰击，轰击前在高渗培养基（MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇,pH5.8）上预处理4小时，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。之后将愈伤组织转移至恢复培养基（1/2MS（只有大量元素减半的MS）+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8）上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上（1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D 1mg/L+蔗糖30g/L+4mg/L Bialaphos,pH5.8），筛选培养2周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中（1/2MS+L-谷氨酞胺1mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8%,pH5.8）进行分化，待分化芽长至2-4cm时将其转移至生根培养基（1/2MS+KT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8%,pH5.8）中。至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1-2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共70株。
提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用载体上启动子引物P7（TGCGATAAAGGAAAGGCTATC（SEQ ID NO.9））和基因内部引物P8（TGCTCGATCAGCGAATCTTA（SEQID NO.10））进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序：10-50ng/μl基因组模板，10μM的5’引物和3’引物各0.5μl；2.5μl 10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase（TaKaRa），加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃45s，58℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测。其中11株可以扩增约650bp的目的条带，初步鉴定为阳性植株，株系编号依次为：T0-3、T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-55、T0-58、T0-61、T0-65、T0-67、T0-68（图4）。
选取未接种赤霉菌的阳性转基因植株，利用随机挑选的阴性转基因植株T0-26以及转基因受体扬麦158作为阴性对照植株，提取穗部总RNA，利用TaLTP-B基因的特异引物P3（AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC（SEQ ID NO.5））和P4（TGCTCGATCAGCGAATCTTA（SEQ ID NO.6）），进行Q-RT-PCR分析。结果表明：与对照扬麦158相比，T0-26植株中的TaLTP-B基因的表达量没有显著变化；T0-46植株中的TaLTP-B基因的表达量只上调了约1.6倍；T0-32、T0-51、T0-55植株中的TaLTP-B基因的表达量上调约2.2-2.4倍；T0-3、T0-7、T0-13、T0-58、T0-61、T0-65、T0-67、T0-68植株中的TaLTP-B基因的表达量上调约3.3-12.6倍。其中，植株T0-67中该基因的表达量上调了约5.3倍，植株T0-61中该基因的表达量上调了约9.2倍，植株T0-7中该基因的表达量上调了约12.6倍（图5）。
实施例5转基因植株的赤霉病抗性鉴定
对所有鉴定的阳性植株、阴性植株T0-26进行赤霉病抗性鉴定（赤霉病抗性鉴定采用单花滴注方法：将10μl孢子悬浮液5,000个/ml滴加到刚开花穗子中部的一朵小花，采用人工弥雾保湿方法温室弥雾保湿3天，接种后21天后调查病小穗率。病小穗率=（发病小穗数/总小穗数×100％），以未转化感病小麦品种扬麦158、抗病品种望水白为对照。转基因T0代阳性转基因植株T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-55、T0-58、T0-61、T0-65、T0-67、T0-68与转基因受体扬麦158相比，可以提高对赤霉病的抗性。
转基因植株的病小穗率及t测验结果表明：T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-55、T0-58、T0-61、T0-65、T0-67、T0-68植株与转基因受体材料扬麦158相比，接种小穗的平均病小穗率差异显著；T0-26植株与扬麦158相比，接种穗的平均病小穗率差异不显著；T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-55、T0-58、T0-61、T0-67、T0-68植株与抗病对照望水白相比，接种小穗的平均病穗率差异不显著；T0-65、T0-26与望水白相比，接种小穗的平均病穗率差异显著（表1）。
表1转基因植株的赤霉病抗性鉴定
表1中，T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-55、T0-58、T0-61、T0-65、T0-67、T0-68为鉴定的阳性转化植株，T0-26为鉴定阴性植株，扬麦158为转基因受体小麦品种，望水白为抗病对照。
实施例6转基因植株的白粉病抗性鉴定
用江苏南京地区田间采集的白粉病菌混合菌种同时接种T0代转基因植株、转基因受体品种扬麦158，进行苗期离体和成株期白粉病抗性鉴定。抗性鉴定标准采用“0-9级”白粉病抗性反应型的分级标准，0-2级为高抗、3-4级为中抗、5级以上为感病。苗期离体抗性鉴定的两次重复结果表明：扬麦158和阴性转基因植株T0-26表现为中感或高感；阳性转基因植株中，T0-3、T0-13和T0-32均表现为高抗，T0-61、T0-67和T0-68均表现为中抗，植株T0-7、T0-51一次重复表现为高抗，另一次重复表现为中抗。成株期白粉病鉴定结果表明：扬麦158表现为中感或高感，阳性转基因植株中，T0-3、T0-13、T0-32和T0-51均表现为高抗，T0-7、T0-61、T0-67和T0-68均表现为中抗。除个别植株外，苗期离体和成株期白粉病抗性鉴定结果基本一致（表2）。
表2转基因植株的白粉病抗性鉴定
表2中，T0-7、T0-13、T0-32、T0-51、T0-61、T0-67、T0-68为鉴定的阳性转化植株，T0-26为鉴定阴性植株，扬麦158为转基因受体小麦品种，望水白为抗病对照。
Claims (2)
1.SEQ ID NO.1所述的非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B在培育抗赤霉病和白粉病小麦品种中的应用。
2.含SEQ ID NO.1所述的非特异性脂转移蛋白基因TaLTP-B的表达载体在培育抗赤霉病和白粉病小麦品种中的应用。
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