CN102876664A

CN102876664A - 叶片直接pcr法及其在转基因植物检测中的应用

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Publication number: CN102876664A
Application number: CN2012103925132A
Authority: CN
Inventors: 任雯; 刘亚; 赵久然; 陈浩; 周秒依
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明公开了一种PCR扩增方法及其应用。本发明所提供的PCR扩增方法是将植物叶片直接作为模板，采用Phire热启动II DNA聚合酶进行PCR扩增的方法；所述叶片为幼嫩叶片。本发明所提供的PCR扩增方法简单、快速、实用性强，获得的PCR检测结果准确、可靠，并且与传统的将种子发芽后取幼嫩叶片进行DNA的提取和PCR检测的方法相比，跳过了制备模板DNA的步骤，大大降低了检测时间和成本；本发明在转基因植物检测及新品种的培育中具有很大的应用前景和空间。

Description

叶片直接PCR法及其在转基因植物检测中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR扩增方法及其应用，特别涉及一种以叶片直接作为模板进行PCR扩增的方法，以及该方法在转基因植物检测中的应用。

背景技术

目前，针对转基因植物检测的方法有很多种，主要基于不同检测目的，可分为以下几类：首先，检测目的为鉴定外源基因整合与否及其整合拷贝数时可使用常规PCR检测法、多重PCR法（Multiplex PCR，也称为MPCR）、降落PCR法（Touchdown PCR，TD-PCR）、反向PCR法（inverse PCR，IPCR）、以及Southern杂交检测法等等。其次，针对外源基因在转化植株中是否转录的检测与鉴定，可通过Northern杂交和实时定量PCR等方法进行检测。此外，检测与鉴定转基因植株外源基因表达情况时可使用Elisa检测和Westhern杂交等方法。其中常规PCR法以其快速、准确、可重复性高等特点已成为转基因检测中应用最为普遍的方法。

为了适应转基因技术的快速发展，提高检测检测效率，国内外都涌现出了大量基于PCR技术的检测方法，其中，武海斌（武海斌，路兴波，孙红炜等.转基因玉米转化体特异性PCR检测技术研究[J].玉米科学，2009,17(1)60-70.武海斌，孙红炜，李宝笃等.转基因玉米多重PCR-基因芯片联用的检测方法[J].农业生物技术学报，2009,17(6):1075-1082.）等建立了一种将多重PCR与基因芯片结合的检测方法，其特点在于较高的准确性和灵敏度。而金芜军（金芜军，郝旸，程红梅等.用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性[J].农业生物技术学报，2005,13(5):562-567.）等则利用复合PCR的方法对不同转基因玉米中的外源DNA片段和玉米内参基因（zein）进行特异性检测。目前随着实验技术的发展，多种多样针对PCR实验革新使得PCR实验可实现简单快捷的规模化操作，大大节省了人力物力和时间成本。而在转基因植物检测过程中使用最为普遍的常规PCR法检测中制备DNA模板不仅是检测的第一步，也是保证检测结果准确与否的基础。目前主要使用CTAB法、SDS法等方法（Matsuoka T,Kuribara H,Akiyama H,et al.A multiplex PCR method ofdetecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize.Journal of Foodand Hygiene Society of Japan,2001,42:24~32.）由待测样品中提取DNA作为PCR反应模板，这些方法操作复杂，提取时间较长，同时提取液中含有的苯酚，氯仿等试剂易对环境造成污染。在大规模检测中，DNA模板的提取已成为检测环节中耗时耗力最多的一个环节。特别是在转基因植物的回交转育过程中，需要进行大量的样本检测，而从田间取材获得的大量的叶片在长途的运输过程中要如何保证样品中的核酸不被降解，是一个相当棘手的问题，而往往消耗大量人力、物力和财力进行叶片的运输和保藏后进行检测的效果不尽理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种叶片直接PCR法及其在转基因植物检测中的应用。

本发明所提供的叶片直接PCR法是将植物叶片直接作为模板，采用Phire热启动II DNA聚合酶进行PCR扩增的方法。

在所述方法中，所述叶片可为幼嫩叶片。

在本发明的一个实施例中，所述幼嫩叶片具体为暗室中发芽的玉米黄化苗（苗高5~8cm），或大田中正常培育的玉米4-5叶期之前叶片，或番茄自种子萌发后第一片真叶出现至花蕾显现时的叶片。

为了达到更加理想的PCR效果，所述叶片在PCR反应体系中可以叶片面积小于等于0.2平方毫米的组织块的形式存在，足以保证有足够的叶片创面与PCR反应体系溶液充分接触。在本发明的一个实施例中，所述PCR反应体系中的所述叶片是用打孔器打出的直径为0.5mm的叶片组织块。

实际操作中，最好使所述叶片悬浮在所述PCR反应体系中，如果所述叶片贴壁则会影响PCR反应结果。

在实际应用中，所述叶片在PCR反应体系中的含量为每20-25μl所述PCR反应体系中悬浮有1-2片叶片面积大于0.03平方毫米小于0.2平方毫米（直径为0.2-0.5mm）的所述叶片。在本发明的一个实施例中，所述叶片在PCR反应体系中的含量具体为每20μl所述PCR反应体系中悬浮有1-2片直径为0.5mm的所述叶片，或所述叶片在PCR反应体系中的含量具体为每25μl所述PCR反应体系中悬浮有1片直径为0.5mm的所述叶片。

在所述方法中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。

在本发明中，所述单子叶植物具体为玉米；所述双子叶植物具体为番茄。

根据实际需要，所述方法中的所述PCR扩增可为单重PCR扩增，也可为多重PCR扩增。

更加具体地，当所述PCR扩增为单重PCR扩增（扩增目的基因单一）时，所述PCR反应体系中各成分的含量具体可为：10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP each，正反向引物各0.5μM，1U Phire热启动II DNA聚合酶0.4μl（按20μl体系计算），所述PCR反应体系中每种待测叶片均悬浮有1-2片，其直径为0.2-0.5mm，余量为ddH₂O。

当所述PCR扩增为多重PCR扩增（扩增的目的基因有多个）时，为了提高产物的特异性，可采用降落式PCR的方法。所述PCR反应体系中各成分的含量具体可为：10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP each，每种正反向引物各0.5μM，1U Phire热启动II DNA聚合酶0.6μl（按25μl体系计算），2%（v/v）DMSO，所述PCR反应体系中每种待测叶片均悬浮有1片，其直径为0.2-0.5mm，余量为ddH₂O。

进一步，为了高产物特异性，所述多重PCR扩增可使用降落PCR方法。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为叶绿体DNA中的高度保守基因IRB18基因、以及转基因玉米NK603的转化体特异性序列，转基因玉米TC1507的转化体特异性序列，转基因番茄5345转化体特异性序列中的至少一种。扩增所述IRB18基因的引物为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA，扩增所述转基因玉米NK603的转化体特异性序列的引物为序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA，扩增所述转基因玉米TC1507的转化体特异性序列的引物为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA，扩增所述转基因番茄5345的转化体特异性序列的引物为序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA。

本发明所提供的叶片直接PCR法在转基因植物鉴定中的应用，或在转基因植物培育中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物；在本发明的一个实施例中，所述单子叶植物具体为玉米；所述双子叶植物具体为番茄。

本发明建立了一套以叶片直接作为模板进行PCR扩增的反应体系和条件，并将其成功应用于转基因植物的PCR检测中，该方法简单、快速、实用性强，获得的PCR检测结果准确、可靠，并且与传统的将种子发芽后取幼嫩叶片进行DNA的提取和PCR检测的方法相比，由于采用了一种Phire热启动II DNA聚合酶，使得PCR反应可以跳过制备模板DNA的步骤，从而大大降低了检测时间。此外由于这种DNA聚合酶的价格与普通DNA聚合酶基本一致，而省去了DNA提取的步骤，在一定程度上节省了试剂耗材人工等人力物力成本，也从根本上降低了检测成本。本发明在转基因植物鉴定及新品种的培育中具有很大的应用前景和空间。

附图说明

图1为利用引物对P-IRB18对内参基因IRB18进行单重PCR扩增的结果。A中，泳道M为100bp DNA分子量标准；泳道1为空白对照；泳道2为非转基因玉米郑单958的叶片直接PCR检测结果；泳道3为转基因玉米NK603的DNA模板扩增结果；泳道4为转基因玉米TC1507的DNA模板扩增结果；泳道5为转基因玉米NK603的叶片直接PCR检测结果；泳道6为转基因玉米TC1507的叶片直接PCR检测结果；泳道7为3种玉米品种混合叶片的直接PCR检测结果。B中，泳道M为DNA分子量标准；泳道1为非转基因番茄2583的叶片直接PCR检测结果；泳道2为转基因番茄5345的叶片直接PCR检测结果；泳道3为非转基因玉米郑单958的DNA的叶片直接PCR检测结果；泳道4为非转基因玉米郑单958的DNA模板扩增结果；泳道-为空白对照；泳道+为转基因番茄5345的DNA模板扩增结果。

图2为利用引物对P-NK603对转基因玉米NK603的转化体特异性序列进行单重PCR扩增的结果。其中，泳道M为100bp DNA分子量标准；泳道1为转基因玉米NK603的DNA模板扩增结果；泳道2为非转基因玉米郑单958的叶片直接PCR检测结果；泳道3为转基因玉米NK603的叶片直接PCR检测结果；泳道4为3种玉米品种混合叶片的直接PCR检测结果。

图3为利用引物对P-TC1507对转基因玉米TC1507的转化体特异性序列进行单重PCR扩增的结果。其中，泳道M为100bp DNA分子量标准；泳道1为转基因玉米TC1507的DNA模板扩增结果；泳道2为非转基因玉米郑单958的叶片直接PCR检测结果；泳道3为转基因玉米TC1507的叶片直接PCR检测结果；泳道4为3种玉米品种混合叶片的直接PCR检测结果。

图4为利用引物对P-5345对转基因番茄5345的转化体特异性序列进行单重PCR扩增的结果。其中，泳道1为空白对照；泳道2为非转基因番茄2583叶片直接PCR检测结果；泳道3为转基因番茄5345叶片直接PCR检测结果；泳道4为转基因番茄5345的DNA模板扩增结果。

图5为利用引物对P-NK603和P-TC1507同时对转基因玉米NK603的转化体特异性序列和转基因玉米TC1507的转化体特异性序列进行多重PCR扩增的结果。其中，泳道M为100bp DNA分子量标准；泳道1为空白对照；泳道2为非转基因玉米郑单958的叶片直接PCR检测结果；泳道3为转基因玉米NK603的叶片直接PCR检测结果；泳道4为转基因玉米TC1507的叶片直接PCR检测结果；泳道5为2种转基因玉米品种混合DNA模板的扩增结果；泳道6为2种转基因玉米品种混合叶片的直接PCR检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、实验植物品种

转基因玉米NK603：可从商业途径得到，由Monsanto公司研发

转基因玉米TC1507：可从商业途径得到，由Mycogen/DAS/Pioneer联合研发。

非转基因玉米郑单958：可从商业途径得到，由河南省农科院粮作所研发。

转基因番茄5345：可从商业途径得到，由Monsanto公司研发

非转基因番茄2583：可从商业途径得到。有相关文献报道（许爽、褚云霞等。定性PCR技术及卡那霉素对8个番茄品种的转基因检测，基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第4期，第765-769页）

2、实验试剂

Phire热启动II DNA聚合酶及dNTPs均为Thermo公司产品，购于北京经科宏达生物技术有限公司。DNA分子量标记（100bp DNAmaker）购自北京全式金生物科技公司。

实施例1、玉米和番茄叶片直接PCR扩增

本实施例以转基因玉米NK603、转基因玉米TC1507、非转基因玉米郑单958、转基因番茄5345和非转基因番茄2583作为实验材料，采用叶片直接PCR法（以三种玉米叶片和两种番茄叶片直接作为模板进行PCR扩增的方法）对叶绿体DNA中的高度保守基因IRB18基因、以及转基因玉米NK603的转化体特异性序列，转基因玉米TC1507的转化体特异性序列，转基因番茄5345转化体特异性序列进行扩增。同时以传统的将种子发芽后取幼嫩叶片进行DNA提取和PCR检测的方法作为对照，以检测叶片直接PCR法的效果。

一、引物设计

根据外源序列与玉米基因组结构特异性，查阅相关资料，使用引物设计软件PrimerPremier5.0分别针对转基因玉米NK603和转基因玉米TC1507设计多对特异性引物（农业部869号公告-13-2007,转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品定性PCR方法[S].农业部869号公告-7-2007,转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品定性PCR方法[S].），同时也参考了农业部玉米转基因检测的相关文件（中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局.SN/Tll96-2003玉米中转基因成分定性PCR检测方法[S]，北京:中国标准出版社），此外还参考了农业部番茄转基因检测的相关公告文件（Agbios GM database：http://www.agbios.com/.GMDD：GMOdetection method database：http：//gmdd.shgmo.org/index/search.）以及已出版的关于检测转基因番茄PCR的文献（Dong W，Yang L T，Shen K L，et al.Database GMDD:adatabase of GMO detection methods[J].BMC Bioinform，2008（9）：260-267.）针对转基因番茄5345设计了特异性引物。进一步对引物进行整理筛选优化，最终确定其中一套引物用于检测（见表1）。本实施例采用了叶绿体DNA中的高度保守基因IRB18基因设计引物作为内标参考，所有引物均由上海生工合成。

表1转基因玉米检测引物

二、检测样品叶片制备

由转基因玉米NK603、转基因玉米TC1507、非转基因玉米郑单958、转基因番茄5345及非转基因番茄2583中挑取籽粒饱满的种子，分别于培养箱内浸泡10h，于28℃下发芽。36h后挑选发芽一致的种子种植于23cm×16cm规格的塑料盆内。每盆4颗苗。每个塑料盆内填充1.8kg壤土、0.7kg蛭石[1∶1(v/v)]及3.0g的复合肥（有效含量45%）。

每个样品植株于幼苗叶片（暗室中发芽的玉米黄化苗（苗高5~8cm），或大田中正常培育的玉米4-5叶期之前取的叶片，或番茄自种子萌发后第一片真叶出现至花蕾显现时的叶片）上分别使用打孔器割取直径为0.5mm的叶片小块备用。用取下的同一叶片其他部分进行DNA提取（使用收集柱试剂盒提取方法），同时进行常规提取DNA模板进行PCR检测试验作为同组样品叶片直接PCR实验的阳性对照。

三、PCR反应体系及条件优化

分别对叶片直接PCR法反应体系中的模板量和退火温度进行梯度实验，以确定最佳退火温度和模板的添加量。

1、单重PCR反应优化后反应体系及反应条件

针对作为内标参考的叶绿体DNA中的高度保守基因IRB18基因、转基因玉米NK603的转化体特异性序列、转基因玉米TC1507的转化体特异性序列、或转基因番茄5345转化体特异性序列的优化后单重PCR反应体系和反应条件具体如下：

单重PCR反应体系总体积为20μl，其中各成分含量为：10mM Tris-HCl，50mMKCl，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP each，正反向引物（P-NK603或P-TC1507或P-5345或P-IRB18）各0.5μM，1U Phire热启动II DNA聚合酶0.4μl。各成分配置完成后，以ddH₂O补齐至20μl体系。将步骤二切割好的0.5mm的叶片小块直接置于反应体系中，无论是以单一叶片作为模板，还是以混合叶片作为模板，在上述反应体系中每种待测叶片均悬浮1-2片。操作中，尽量使叶片悬浮在反应体系中，叶片贴壁则会影响PCR反应结果。

单重PCR反应条件为：98℃预变性5min→（98℃变性5s→62℃退火5s→72℃延长20s）×40个循环→72℃过度延伸1min。

2、多重PCR反应优化后反应体系及反应条件

针对转基因玉米NK603的转化体特异性序列和转基因玉米TC1507的转化体特异性序列的优化后多重PCR反应体系和反应条件具体如下：

多重PCR反应体系使用降落PCR方法，用以提高产物特异性。PCR反应体系总体积为25μl，其中含有：10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP each，两种检测引物（P-NK603和P-TC1507）的正反向引物各0.5μM，1U Phire热启动II DNA聚合酶0.6μl，2%（v/v）DMSO，去离子水补充到25μl。将步骤二切割好的0.5mm的叶片小块直接置于反应体系中，无论是以单一叶片作为模板，还是以混合叶片作为模板，在上述反应体系中每种待测叶片均悬浮1片。

多重PCR反应条件为：98℃预变性5min→（98℃变性5s→65℃退火5s，-1℃/每循环→72℃延长20s）×20个循环→72℃过度延伸1min→98℃变性5s→52℃退火5s→72℃延长20s）×20个循环→72℃过度延伸1min。

四、PCR扩增及产物检测

1、单重PCR扩增

以步骤二得到的直径为0.5mm的叶片小块为模板，采用步骤一设计的四对引物，利用步骤三优化后的单重PCR反应体系和反应条件分别进行叶片直接PCR扩增。实验设置以单一玉米品种叶片作为模板的组别，单一番茄品种叶片作为模板的组别，以及以三种玉米品种混合叶片作为模板的组别。同时以步骤二常规提取的DNA模板进行单重PCR作为阳性对照，阳性对照的反应体系中除模板外的其它组分，以及反应条件均与叶片直接PCR法相同。无论是单一DNA模板的阳性对照还是混合DNA模板的阳性对照，其每种DNA模板的用量在10ng-0.1μg均可。另外，实验设置不添加模板的空白对照组。实验共重复三次。

2、多重PCR扩增

以步骤二得到的直径为0.5mm的叶片小块为模板，采用步骤一设计的引物P-NK603和P-TC1507，利用步骤三优化后的多重PCR反应体系和反应条件分别进行叶片直接PCR扩增。实验设置以单一玉米品种叶片作为模板的组别，以及以2种转基因玉米品种混合叶片作为模板的组别。同时以步骤二常规提取的DNA模板进行多重PCR作为阳性对照，阳性对照的反应体系中除模板外的其它组分，以及反应条件均与叶片直接PCR法相同。无论是单一DNA模板的阳性对照还是混合DNA模板的阳性对照，其每种DNA模板的用量在10ng-0.1μg均可。另外，实验设置不添加模板的空白对照组。实验共重复三次。

3、PCR扩增产物检测及结果

每份扩增产物取15μl进行浓度为2%的琼脂糖电泳，10V/cm，电泳时间45min，使用凝胶成像系统对结果进行观测与分析。

（1）单重PCR检测结果

A.叶片直接PCR法检测内参基因

采用叶片直接PCR法（单重PCR）对3种玉米及2种番茄进行内参基因IRB18的检测，结果如图1所示，无论是以3种玉米品种中的单一玉米品种叶片为模板进行的单重PCR检测，还是以3种玉米品种混合叶片为模板进行的单重PCR检测，或是是以2种番茄中的单一番茄品种叶片为模板进行的单重PCR检测，均可扩增出长度约为297bp的特异性条带（注：内参基因IRB18虽为保守基因，但在不同物种有少许差别，体现为PCR产物条带大小有20bp以内的少许差别），与IRB18基因条带预期大小一致，且以上结果与使用传统提取DNA模板进行PCR检测的结果一致。这一结果表明此批样品叶片可通过直接PCR方法进行转基因检测。

B.叶片直接PCR法检测转基因玉米或番茄特异性序列

采用叶片直接PCR法（单重PCR）对2种转基因玉米和1种转基因番茄进行特异性序列检测，结果如图2和图3和图4所示，无论是以2种转基因玉米品种中的单一玉米品种叶片为模板进行的单重PCR检测，还是以3种玉米品种混合叶片为模板进行的单重PCR检测，还是以转基因番茄5345叶片为模板进行的单重PCR检测，均可观测到高特异性的有效扩增条带，所获目的条带与预期大小一致（转基因玉米NK603为108bp，转基因玉米TC1507为279bp，转基因番茄5345为119bp），且以上结果与使用传统提取DNA模板进行PCR检测的结果一致。

（2）多重PCR检测结果

采用叶片直接PCR法（多重PCR）对2种转基因玉米进行特异性序列检测，结果如图5所示，无论是以3种玉米品种中的单一玉米品种叶片为模板进行的多重PCR检测，还是以2种转基因玉米品种混合叶片为模板进行的多重PCR检测，均可观测到相应转基因玉米品种的高特异性的有效扩增条带，所获目的条带与预期大小一致（转基因玉米NK603为108bp，转基因玉米TC1507为279bp），与单重PCR检测结果一致。由图可见，叶片直接PCR进行多重PCR检测效果（图5中第6泳道）与常规DNA提取方法效果（图5中第5泳道）完全一致。使用待测样品叶片进行直接PCR方法检测效果特异性强，具可重复性，可以作为PCR检测转基因的新方法得到广泛应用。

Claims

1.一种PCR扩增方法，其特征在于：所述方法是将植物叶片直接作为模板，采用Phire热启动II DNA聚合酶进行PCR扩增的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述叶片为幼嫩叶片。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述叶片在PCR反应体系中是以叶片面积小于0.2平方毫米的组织块的形式存在的。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述叶片在PCR反应体系中的含量为每20-25μl所述PCR反应体系中含有1-2片叶片面积大于0.03平方毫小于0.2平方毫米的所述叶片。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为玉米；所述双子叶植物为番茄。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增为单重PCR扩增或多重PCR扩增。

8.权利要求1-7中任一所述的方法在转基因植物鉴定中的应用。

9.权利要求1-7中任一所述的方法在转基因植物培育中的应用。