CN103409414B - 甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因pcr引物序列及扩增方法 - Google Patents

甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因pcr引物序列及扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列及扩增方法，引物序列是由ScALS-F和ScALS-R组成，PCR扩增方法包括反应体系和扩增条件。本发明为转基因甘蔗PCR检测和物种特异性鉴定提供了基因组内标基因，同时为转基因甘蔗检测精度和结果的准确性提供了保证。

Description

甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列及扩增方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列及扩增方法。
背景技术
转基因技术越来越成熟，转基因甘蔗的种类也日趋多样。目前，抗除草剂、抗虫、抗病转基因甘蔗已经在包括美国、澳大利亚、印度、巴西在内的14个国家进行田间试验，为转基因甘蔗商业化栽培创造了条件。在我国，甘蔗基因克隆和转基因研究则是在20世纪90年代中期才开始的，虽然起步较迟，但进展较快，已经获得的转基因甘蔗有抗虫转基因甘蔗、抗旱转基因甘蔗、耐除草剂转基因甘蔗、抗病毒性病害转基因甘蔗、抗真菌性转基因甘蔗、抗细菌性转基因甘蔗等。随着世界范围内转基因作物的不断增多，建立转基因作物的检测标准显得尤为重要。由于甘蔗染色体复杂，插入的外源基因的检测比其它作物困难得多，尤其是目前仍然没有已知的甘蔗内源低拷贝基因，转基因甘蔗PCR检测的准确性没有保证。没有甘蔗内源低拷贝基因标准，PCR检测的精度便无法确定，容易产生假阴性结果；没有内源低拷贝基因，也无法应用PCR方法快速确定插入外源基因的拷贝数；同时，没有内源低拷贝基因也使得制订转基因作物PCR检测标准缺乏内参基因的必备条件。因此，甘蔗内源低拷贝基因的筛选与鉴定显得尤为重要。
乙酰乳酸合成酶是植物和微生物中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸合成途径的一个关键酶，该基因在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值。对于产生该酶的乙酰乳酸合酶基因已有不少研究，但对于该基因在甘蔗物种基因组中存在的拷贝数迄今没有研究报道。
发明内容
本发明的目的是为转基因甘蔗PCR检测和物种特异性鉴定提供基因组内标基因，重点是提供内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列及扩增方法，为转基因甘蔗检测的精度性提供保证。
本发明的技术方案概述如下：
一种甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列，其特征在于乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列为：ScALS-F：CTCCCAGTGAAGGTCTTTGCG；ScALS-R：TGCTGGAATGTTGAACCCTTT。
一种甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR扩增方法，其特征在于包括PCR反应体系和扩增条件，具体如下：
（1）PCR反应体系：1.0 U Taq DNA 聚合酶，1×PCR缓冲溶液，0.25 mM dNTP，3.0 mM MgCl2，引物ScALS-F 和ScALS-R各0.25 mM，DNA模板 25 ng，反应体系总体积为25??l；
（2）PCR扩增条件：95℃预变性6 min；94℃变性30 s；65℃退火30 s，72℃延伸35 s，共35个循环，最后72℃延伸6 min。
其中，所述的甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR预期扩增片段长度为171bp。
本发明的优点：
1、适用性广：研究所用的受试甘蔗品种数量较多，共有12个，并且入选材料是在对大量甘蔗品种遗传背景进行深入分析的基础上挑选出来的，具有广泛的代表性，可以代表目前生产上使用的甘蔗栽培品种遗传背景。
2、PCR产物大小适中，容易判定：甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR扩增片段长度为171 bp，既可以与PCR引物二聚体明显区分开，容易判定，扩增片段又不会太长，对PCR反应酶没有特别要求。
3、特异性强：PCR扩增片段只有一个，没有非特异扩增，表明设计的PCR引物特异性强，保证了目的片段的扩增效率。
附图说明
图1 为乙酰乳酸合酶基因PCR扩增片段电泳分析：泳道1-12依次为:粤甘34、FN36、云蔗04-241、赣南02-70、云蔗05-51、ROC16、粤甘35、柳城03-1137、云蔗06-407、FN02-5707、FN39、ROC22；13-14：空白对照；15：Marker 100 bp。
图2为乙酰乳酸合酶基因的实时荧光定量PCR标准曲线
图3为甘蔗基因组DNA酶切
图4为乙酰乳酸合酶基因的Southern blotting杂交：图A 泳道1-4:柳城03-1137、FN02-5707、赣南02-70、云蔗05-51，5：阳性对照1 ng/μl，6：空白对照；图B泳道1-4: 粤甘34、粤甘35、ROC16、云蔗06-407，5：阳性对照1 ng/μl，6：空白对照；图C泳道1-4: FN36、云蔗04-241、ROC22、FN39，5：阳性对照1 ng/μl，6：空白对照；图D甘蔗基因组DNA酶切，泳道1-4: 柳城03-1137、FN02-5707、粤甘34、FN36，5-7空白对照，8：Marker 15000+2000 bp。
具体实施方式    
为了充分公开本发明的甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列及扩增方法，以下结合实施例加以说明。
实施例1：
（1）甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因的PCR扩增
乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列为：ScALS-F：CTCCCAGTGAAGGTCTTTGCG；ScALS-R：TGCTGGAATGTTGAACCCTTT。
PCR反应体系：1.0 U Taq DNA 聚合酶，1×PCR缓冲溶液，0.25 mM dNTP，3.0 mM MgCl2，引物ScALS-F 和ScALS-R各0.25 mM，DNA模板 25 ng，反应体系总体积为25??l；
PCR扩增条件：95℃预变性6 min；94℃变性30 s；65℃退火30 s，72℃延伸35 s，共35个循环，最后72℃延伸6 min。
（2）甘蔗乙酰乳酸合酶基因PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析
用乙酰乳酸合酶基因的一对引物，对12个甘蔗品种进行PCR检测，结果发现乙酰乳酸合酶基因引物在PCR扩增时只扩增出一个条带并且每个甘蔗品种均能扩增出同一条带，见图1。
图1显示，用12个甘蔗品种，利用乙酰乳酸合酶基因PCR引物和PCR扩增方法，均可以扩增出单一个条带，大小在100 bp与200 bp之间，接近200 bp，与预期PCR片段长度171 bp一致，符合基因组内标基因特异性和通用性原则，可以对所有受试甘蔗品种进行分子鉴定。
（3）实时荧光定量PCR引物扩增效率分析
对乙酰乳酸合酶基因质粒DNA进行稀释，使质粒DNA的拷贝数为109，再依次稀释为108、107、106、105、104、103、102、101，然后进行实时荧光定量PCR反应，得出乙酰乳酸合酶基因的标准曲线，标准曲线以log10为横坐标，Ct值为纵坐标，如图2所示。由图可知，乙酰乳酸合酶基因扩增曲线相关系数(R2)大于0.95，可以认为曲线线性关系成立，该结果表明定量检测引物适用于定量PCR检测；引物的扩增效率(E)大于0.95，见表1，能够满足实时荧光定量PCR扩增的要求。因此，可用于甘蔗内源基因拷贝数分析。
表1  乙酰乳酸合酶基因的引物扩增效率参数表
基因名称 斜率(K) 相关系数(R2) 扩增效率E=10(1/K)-1
乙酰乳酸合酶基因 -3.4464 0.999 0.950553
（4）甘蔗内源基因拷贝数
以12个受试甘蔗品种的DNA为模板，把模板浓度调整为20 ng/μl，进行实时荧光定量PCR反应，确定Ct值，然后按照对应基因的标准曲线公式将12个甘蔗品种的Ct值代入，计算出其相应的拷贝数。然后再按以下公式：拷贝数/{[6.02*1023*10-9*40/(7740*106*660)]}得出基因在单个细胞基因组的拷贝数。经计算，乙酰乳酸合酶基因在甘蔗单个细胞基因组的拷贝数见表2。
表2 不同基因在12个甘蔗品种的单个细胞基因组拷贝数
表2结果显示，乙酰乳酸合酶基因的样本均值为1.1075，与1接近，因此推断乙酰乳酸合酶基因是甘蔗基因组的内源低拷贝基因。
（5）甘蔗基因组Southern Blotting结果
甘蔗品种基因组DNA经过EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切，在SeaKem?? LE Agarose上电泳分离后，在多功能凝胶成像系统中呈现连续、分布均匀的条带，如图3所示，说明甘蔗DNA被EcoRⅠ和Hind Ⅲ两种限制性内切酶酶切消化较为彻底。
采用DIG酶免疫标记NBT/BCIP检测杂交，结果显示12个甘蔗品种均出现一个杂交信号，如图4所示，1 ng/μl的阳性对照出现杂交信号，空白对照没有出现杂交信号。通过图4可以看出在2000 bp位置只有1个杂交信号，推断乙酰乳酸合酶基因可能只有一个拷贝，与上述利用标准曲线计算结果一致。因此判定，乙酰乳酸合酶基因是甘蔗的内源低拷贝基因。
由图4可以看出，12个受试甘蔗品种均有单一杂交条带出现，根据图4：D的DNA同步酶切对照可以看出杂交条带大小在2000 bp左右。
从实时荧光定量PCR引物扩增效率、甘蔗内源基因拷贝数计算结果、甘蔗基因组Southern Blotting结果可以看出，甘蔗乙酰乳酸合酶基因具备作为甘蔗基因组内标基因的特点，利用本发明所述PCR引物序列及扩增方法可以确定对转基因甘蔗PCR检测的精度，实现甘蔗物种特异性鉴定。

Claims (1)

1.一种甘蔗乙酰乳酸合酶基因作为甘蔗基因组内标基因的用途，其特征在于：
（1）甘蔗乙酰乳酸合酶基因PCR引物序列为：ScALS-F：CTCCCAGTGAAGGTCTTTGCG；ScALS-R：TGCTGGAATGTTGAACCCTTT；
（2）PCR反应体系：1.0 U Taq DNA 聚合酶，1×PCR缓冲溶液，0.25 mM dNTP，3.0 mM MgCl2，引物ScALS-F 和ScALS-R各0.25 mM，DNA模板 25 ng，反应体系总体积为25μl；
（3）PCR扩增条件：95℃预变性6 min；94℃变性30 s；65℃退火30 s，72℃延伸35 s，共35个循环，最后72℃延伸6 min；
（4）PCR扩增片段长度为171bp。
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