CN105087802B - 鉴定番茄抗晚疫病性状的方法及其所用分子标记和引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定番茄抗晚疫病性状的方法及其所用分子标记和引物。该方法包括以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用R2M1S进行PCR扩增得到R2M1S的PCR扩增产物；检测所述R2M1S的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的抗晚疫病性状：如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为抗晚疫病番茄；如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄；所述R2M1S由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。

Description

鉴定番茄抗晚疫病性状的方法及其所用分子标记和引物
本申请是申请号为201410059173.0、申请日为2014年02月21日、发明创造名称为“鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法及其专用分子标记和引物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及鉴定番茄抗晚疫病性状的方法及其所用分子标记和引物。
背景技术
番茄属于茄科植物，一年生或多年生。番茄染色体数2n＝24，基因组约为950Mb。番茄由于具有风味独特、食用多样、适应性广、容易栽培等特点，早已成为世界上重要的蔬菜作物。据联合国粮农组织统计，2010年世界番茄总产量达1.45亿吨。随着生产上长时间连续栽培，以及全球范围的气候的变化，番茄生产面临越来严重的生物和非生物逆境的挑战，同时消费者对产品品质以及产品的多样性的要求也越来越高。利用不断发展的育种理论和技术，培育满足生产和市场需求的优良品种，是番茄育种的根本目的。从上世纪80年代后期开始，分子标记辅助选择技术和基因工程技术为核心的生物育种技术得到了快速的发展。同时作为重要的模式植物，番茄在分子遗传学、分子生理学、基因组学以及生物进化领域等得到了广泛而深入的研究。这一切共同推动番茄育种比其他任何蔬菜作物都更早地进入到了分子操作的新阶段。随着遗传学的发展，遗传标记的应用得到广泛推广，分为形态标记、细胞学标记、生化标记等表现型标记和DNA片段标记等基因型标记。DNA片段标记能够直接反映生物个体或种群间基因组的某种差异，具有不受环境和基因表达的影响，而且具有数量丰富，遗传稳定，操作简单等优点。常用的分子标记有基于Southern杂交的限制性片段长度多态性标记(RFLP)，基于PCR技术的DNA扩增方法的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)，特定序列扩增标记(SCAR)和简单重复序列标记(SSR)，以及基于PCR与酶切相结合的扩增片段长度多态性标记(AFLP)、切割扩增的多态性序列标记(CAPS)和单核苷酸多态性(SNP)等。
晚疫病由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起，是最具毁灭性的番茄田间病害之一。在有利病原菌生长的条件下，晚疫病可以以惊人的速度蔓延，7至10天便可杀死宿主。由于近几年番茄晚疫病的不断流行，挖掘抗番茄晚疫病的分子标记也显得越来越重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法及其专用分子标记和引物。
本发明提供了四种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法。
本发明所提供的第一种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法，包括如下步骤：以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用R2M1S进行PCR扩增得到R2M1S的PCR扩增产物；检测所述R2M1S的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的抗晚疫病性状：
如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为抗晚疫病番茄或为候选抗晚疫病番茄；
如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄或为候选非抗晚疫病番茄；
所述R2M1S由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。
本发明所提供的第二种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法，包括如下步骤：检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3的DNA片段，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的抗晚疫病性状：
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为抗晚疫病番茄或为候选抗晚疫病番茄；
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄或为候选非抗晚疫病番茄。
上述第二种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法中，所述检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3的DNA片段的方法为：以所述待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用R2M1S进行PCR扩增得到R2M1S的PCR扩增产物，检测所述R2M1S的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3的DNA片段：
如果所述R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID No.3的DNA片段；如果所述R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID No.3的DNA片段；所述R2M1S由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。
本发明所提供的第三种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法，包括如下步骤：以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用R2M1S进行PCR扩增得到R2M1S的PCR扩增产物；以所述待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用M67-3进行PCR扩增得到M67-3的PCR扩增产物；检测所述R2M1S的PCR扩增产物的序列和所述M67-3的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的抗晚疫病性状：
如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR扩增产物含有SEQ ID No.6的DNA片段，所述待鉴定番茄为抗晚疫病番茄或为候选抗晚疫病番茄；
如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.6的DNA片段，所述待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄或为候选非抗晚疫病番茄；
所述R2M1S由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述M67-3由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成。
本发明所提供的第四种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法，包括如下步骤：检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3的DNA片段和SEQ ID No.6的DNA片段，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的抗晚疫病性状：
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中既含有SEQ ID No.3的DNA片段也含有SEQ IDNo.6的DNA片段，所述待鉴定番茄为抗晚疫病番茄或为候选抗晚疫病番茄；
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中既不含有SEQ ID No.3的DNA片段也不含有SEQ ID No.6的DNA片段，所述待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄或为候选非抗晚疫病番茄。
上述第四种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法中，所述检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3和SEQ ID No.6的DNA片段的方法为以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用R2M1S进行PCR扩增得到R2M1S的PCR扩增产物；以所述待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用M67-3进行PCR扩增得到M67-3的PCR扩增产物；检测所述R2M1S的PCR扩增产物和所述M67-3的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定所述待鉴定番茄是否含有SEQ IDNo.3和SEQ ID No.6的DNA片段：
如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR扩增产物含有SEQ ID No.6的DNA片段，所述待鉴定番茄含有SEQ ID No.3和SEQ ID No.6的DNA片段；如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ IDNo.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.6的DNA片段，所述待鉴定番茄不含有SEQ ID No.3和SEQ ID No.6的DNA片段；
所述R2M1S由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述M67-3由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成。
上述四种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法中，所述用R2M1S进行PCR扩增采用的引物退火条件可为55℃退火30s；和/或，所述用M67-3进行PCR扩增采用的引物退火条件可为55℃退火30s。
上述四种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法中，所述用R2M1S进行PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可以是：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸8min；所述用M67-3进行PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可以是：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸8min。
上述方法可用于番茄育种、番茄抗晚疫病的早期预测和筛选抗晚疫病番茄。
在番茄育种中，可选择上述方法鉴定出的抗晚疫病番茄或候选抗晚疫病番茄进行育种。
本发明还提供了两种鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的分子标记。一种分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段。另一种分子标记是鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的成套DNA片段，由DNA片段1和DNA片段2组成，所述DNA片段1和所述DNA片段2独立包装；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
上述鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的成套DNA片段中，DNA片段1和DNA片段2的摩尔比可为1:1。
下述A1)-A4)中任一种产品也属于本发明的保护范围：
A1)鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的引物对，名称为R2M1S，所述R2M1S由SEQID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。
A2)含有A1)的鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的试剂或试剂盒；
A3)鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的成套引物对，由独立包装的R2M1S和M67-3组成，所述R2M1S由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述M67-3由SEQ ID No.4所示的单链DNA和SEQ ID No.5所示的单链DNA组成；
A4)含有A3)的鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的试剂或试剂盒。
上述鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的成套引物对中，R2M1S和M67-3的摩尔比可为1:1。
下述B1)-B4)中的任意一种用途也属于本发明的保护范围：
B1)上述任一种方法在番茄育种中的应用；
B2)上述任一种方法在番茄抗晚疫病性状的早期预测中的应用；
B3)上述任一种方法在筛选抗晚疫病番茄中的应用；
B4)A1)-A4)中任一种产品在番茄育种中的应用；
B2)A1)-A4)中任一种产品在番茄抗晚疫病性状的早期预测中的应用；
B3)A1)-A4)中任一种产品在筛选抗晚疫病番茄中的应用。
上文中，SEQ ID No.1由22个脱氧核苷酸组成，SEQ ID No.2由20个脱氧核苷酸组成，SEQ ID No.3由440个脱氧核苷酸组成，SEQ ID No.4由18个脱氧核苷酸组成，SEQ IDNo.5由18个脱氧核苷酸组成，SEQ ID No.6由615个脱氧核苷酸组成。
上文中，所述晚疫病具体由致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]生理小种T1,2,4引起。
上文中，所述抗晚疫病番茄是指晚疫病的病害等级≤4的番茄品种或品系；所述非抗晚疫病番茄是指晚疫病的病害等级＞4的番茄品种或品系。
上文中，所述待鉴定番茄具体可为选自LA4084×CLN2037B的杂种后代，如LA4084×CLN2037B的F2及其以后世代的株系。
上文中，所述R2M1S中，SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA的摩尔比可为1:1。
上文中，所述M67-3中，SEQ ID No.4所示的单链DNA和SEQ ID No.5所示的单链DNA的摩尔比可为1:1。
实验证明，利用成套引物对(由独立包装的R2M1S和M67-3组成)和/或成套DNA片段(由DNA片段1和DNA片段2组成)对番茄育种群体进行辅助选择得到了抗晚疫病株系，利用引物对R2M1S和/或DNA片段1对番茄育种群体进行辅助选择得到了抗晚疫病株系，这表明由独立包装的R2M1S和M67-3组成的成套引物对和/或由DNA片段1和DNA片段2组成的成套DNA片段和/或引物对R2M1S和/或DNA片段1用于番茄抗花叶病毒育种的分子标记辅助选择是切实有效的，利用本发明进行分子标记辅助选择可提高番茄抗晚疫病育种的选择效率，加快育种进程。
附图说明
图1为引物对R2M1S的PCR产物的电泳结果。
图1中，M为100bp DNA ladder，p1为父本CLN2037B，p2为母本LA4084，其余为LA4084×CLN2037B的F2株系编号。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的番茄(Solanum lycopersicum)CLN2037B(AVRDC Report 1999)在Asian Vegetable Research and Development Center(AVRDC)的Accession Number是CLN2037B，公众可从AVRDC获得该生物材料。在下述实施例中简称CLN2037B。
下述实施例中的番茄(Solanum lycopersicum)LA4084在Tomato GeneticsResource Center(TGRC)的Accession Number是LA4084，公众可从TGRC获得该生物材料。在下述实施例中简称LA4084。
下述实施例中的致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]生理小种T1,2,4(中国18省市番茄晚疫病菌生理小种的鉴定.园艺学报2004,31(6):758～761)公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
在以下的实施方案中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京:科学出版社，2002)所提供的方法进行。
实施例1、鉴定LA4084×CLN2037B的F2株系的抗晚疫病性状
一、鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂
本实施例的鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂有两种，分别是鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂A和鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂B。
本实施例的鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂A由引物对R2M1S、引物对M67-3、10×Taq缓冲液，dNTP混合物，MgC12溶液、Taq DNA聚合酶和ddH2O组成。其中，引物对R2M1S和引物对M67-3单独包装，其摩尔比为1:1。
本实施例的鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂B由引物对R2M1S、10×Taq缓冲液，dNTP混合物，MgC12溶液、Taq DNA聚合酶和ddH2O组成。
其中，PCR引物对R2M1S由正向引物和反向引物这两条单链DNA组成，其序列如下：
正向引物:5’-CGAGTTGCAACCTCTAGACTCA-3’(SEQ ID No.1)，
反向引物:5’-GGAAATCCTCCGCCTTACTT-3’(SEQ ID No.2)。
其中，PCR引物对M67-3由正向引物和反向引物这两条单链DNA组成，其序列如下：
正向引物:5’-TGCGAATCCTTGTGGTAT-3’(SEQ ID No.4)，
反向引物:5’-CTTACTGTGGACTGTGGG-3’(SEQ ID No.5)。
二、待鉴定番茄
LA4084×CLN2037B的F2株系是按照如下方法获得：LA4084(作为母本)和CLN2037B(作为父本)杂交，得到F1，F1自交收获F1植株所结的种子获得F2的种子。随机取F2的种子进行种植，得到F2植株，取编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的F2植株分别进行扦插繁殖，每个株系得到3株扦插株，得到编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的株系。
三、鉴定晚疫病抗性
(一)温室接种致病疫霉鉴定晚疫病抗性
参照Chen等(CHIEN-HUA CHEN,etal.Phenotypic and Genotypic Changes inthe Phytophthora infestans Population in Taiwan–1991to 2006.J.Phytopathol157:248–255(2009))和Brouwer等(Douglas J.Brouwer,Elizabeth S.Jones,and DinaA.St.Clair.QTL analysis of quantitative resistance to Phytophthora infestans(late blight)in tomato and comparisons with potato.Genome 47:475–492(2004))方法进行致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]生理小种T1,2,4活体接种鉴定CLN2037B(株系编号为p1)、LA4084(株系编号为p2)、编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的株系对晚疫病抗性，实验重复三次，每次具体实验方法如下：将5片叶完全展开的植株移到接种室内适应1-2天，接种室温度调至20℃，每天12h光照12h黑暗。接种之前，给植株浇足水分，保证接种室的高湿环境。采用喷雾法进行接种，致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)deBary]生理小种T1,2,4菌液浓度为1000孢子囊/mL。接种时喷雾一定要均匀，保证各层叶片都能接上，喷菌液直至植株滴水为止。接种后24h内，保证室温20±2℃，黑暗，100％相对湿度，之后室温不变，将湿度控制在60％-95％之间，光照12h。接种后第7天调查每一植株叶面积被害率(病斑面积占叶面积的百分数)，进而鉴定每一植株的病害严重度，即单株病害等级。
单株病害等级：根据叶片发病情况，病情分为0-6级。0级：无病症；1级：叶部病斑细小，叶面积被害率≤5％；2级：叶部形成限制性病斑，5％＜叶面积被害率≤15％；3级：叶部有病斑，茎部无病斑，15％＜叶面积被害率≤30％；4级：茎部病斑少量，30％＜叶面积被害率≤60％；5级：茎部病斑扩展型，60％＜叶面积被害率≤90％；6级：茎部严重受害，叶面积被害率＞90％，甚至植株死亡。其中，0-4级为对晚疫病具有抗性，5-6级为对晚疫病敏感。
温室鉴定结果如表3和表4所示，表明株系编号为p1、1、2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、21、23、24、26、28、29、30和31的单株病害等级均小于4，是抗晚疫病番茄；株系编号为p2、5、8、14、18、19、20、22、25、27和32的单株病害等级均大于5，是非抗晚疫病番茄。
(二)利用鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂A、以及鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的PCR试剂B鉴定番茄的抗晚疫病性状
在步骤(一)编号为1-32的株系、LA4084(株系编号为p2)和CLN2037B(株系编号为p1)的3叶期分别采集番茄叶片提取其基因组DNA，其中，编号为1-32的株系每个株系采集3株扦插株的叶片等质量混合后提取基因组DNA，LA4084采集3株植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA，CLN2037B采集3株植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA。
分别以提取的各个株系的基因组DNA为模板，利用引物对R2M1S进行PCR扩增，反应体系如表1:
表1.引物对R2M1S的PCR扩增体系
成份 体积
DNA模板(25ng/μl) 2μl
正向引物(50ng/μl) 0.2μl
反向引物(50ng/μl) 0.2μl
10×Taq缓冲液 1μl
MgC12(25mM) 0.8μl
dNTPs混合物(10mM) 0.8μl
Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl
ddH20 4.8μl
总体积 10μl
引物对R2M1S的PCR反应温度程序:先94℃4min(预变性)；然后进行30个如下循环：然后进行30个如下循环：先94℃30s(变性)，然后55℃30s(引物退火)，最后72℃1min30s(引物延伸)；最后72℃8min。4℃下保存。
分别以提取的各个株系的基因组DNA为模板，利用引物对M67-3进行PCR扩增，反应体系如表2:
表2.引物对M67-3的PCR扩增体系
成份 体积
DNA模板(25ng/μl) 2μl
正向引物(50ng/μl) 0.2μl
反向引物(50ng/μl) 0.2μl
10×Taq缓冲液 1μl
MgC12(25mM) 0.8μl
dNTPs混合物(10mM) 0.8μl
Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl
ddH20 4.8μl
总体积 10μl
引物对M67-3的PCR反应温度程序:先94℃4min(预变性)；然后进行30个如下循环：先94℃30s(变性)，然后55℃30s(引物退火)，最后72℃1min30s(引物延伸)；最后72℃8min。4℃下保存。
PCR反应完成后，将引物对R2M1S的PCR产物和引物对M67-3的PCR产物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Goldview染色，缓冲液为0.5×TBE，在4V·cm-1恒压下电泳1h,Bio-Rad凝胶成像系统观察并照相。其中，10×TBE(1L)的配制方法如下：Tris 108g，硼酸55g，EDTA 7.44g，用ddH2O定容至1L，使用前用蒸馏水配制成0.5×工作液，常温保存。引物对R2M1S的PCR产物的电泳结果如图1所示，CLN2037B(株系编号为p1)、LA4084(株系编号为p2)和编号为1-32的株系的R2M1S的PCR产物均得到特异条带。引物对M67-3的PCR产物的电泳结果表明CLN2037B(株系编号为p1)、LA4084(株系编号为p2)和编号为1-32的株系的M67-3的PCR产物均得到特异条带。
回收各个株系的R2M1S的PCR扩增产物的所有条带，对每个条带分别进行测序，根据R2M1S的PCR扩增产物的序列按照下述方法M鉴定各个株系对晚疫病的抗性：
方法M：检测R2M1S的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定待鉴定番茄的抗晚疫病性状：
如果待鉴定番茄的R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，待鉴定番茄为抗晚疫病番茄；如果待鉴定番茄的R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄。SEQ ID No.3由440个核苷酸组成。
回收各个株系的M67-3的PCR扩增产物的所有条带，对每个条带分别进行测序，根据R2M1S的PCR扩增产物的序列和M67-3的PCR扩增产物的序列按照下述方法N鉴定各个株系对晚疫病的抗性：
方法N：
如果待鉴定番茄的R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，且M67-3的PCR扩增产物含有SEQ ID No.6的DNA片段，待鉴定番茄为抗晚疫病番茄；
如果待鉴定番茄的R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，且M67-3的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.6的DNA片段，待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄。SEQ IDNo.6由615个核苷酸组成。
方法M的鉴定结果表明，株系编号为p1、1、2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、21、23、24、26、28、29、30和31的引物对R2M1S的PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(表3)，均为抗晚疫病番茄；株系编号为p2、5、8、14、18、19、20、22、25、27和32的引物对R2M1S的PCR产物不含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(表3)，均为非抗晚疫病番茄。方法M的鉴定结果与温室接种致病疫霉的鉴定结果一致。
方法N的鉴定结果表明，株系编号为p1、1、2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、21、23、24、26、28、29、30和31的引物对R2M1S的PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段且M67-3的PCR扩增产物含有SEQ ID No.6的DNA片段(表3和表4)，均为抗晚疫病番茄；株系编号为p2、5、8、14、18、19、20、22、25、27和32的引物对R2M1S的PCR产物不含有SEQ ID No.3所示的DNA片段，且M67-3的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.6的DNA片段(表3和表4)，均为非抗晚疫病番茄。方法N的鉴定结果与温室接种致病疫霉的鉴定结果一致。
表3.各个株系的晚疫病的单株病害等级及R2M1S的PCR扩增产物是否含有SEQ IDNo.3所示的DNA片段
表3中，株系1-32的单株病害等级为3株扦插株的平均值，株系p1和p2的单株病害等级为3株的平均值，PCR扩增产物中是A表示PCR扩增产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段，PCR扩增产物中是B表示PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3所示的DNA片段。
表4.各个株系的晚疫病的单株病害等级及M67-3的PCR扩增产物是否含有SEQ IDNo.6所示的DNA片段
表4中，株系1-32的单株病害等级为3株扦插株的平均值，株系p1和p2的单株病害等级为3株的平均值，PCR扩增产物中是C表示PCR扩增产物含有SEQ ID No.6所示的DNA片段，PCR扩增产物中是D表示PCR扩增产物不含有SEQ ID No.6所示的DNA片段。
以上实验结果说明本发明的方法M和方法N鉴定番茄抗晚疫病性状的方法准确性高。

Claims (3)

1.鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法，包括如下步骤：以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用R2M1S进行PCR扩增得到R2M1S的PCR扩增产物；检测所述R2M1S的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的抗晚疫病性状：
如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为抗晚疫病番茄或为候选抗晚疫病番茄；
如果所述待鉴定番茄的所述R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄或为候选非抗晚疫病番茄；
所述R2M1S由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述待鉴定番茄为选自LA4084×CLN2037B的杂种后代。
2.鉴定或辅助鉴定番茄抗晚疫病性状的方法，包括如下步骤：检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3的DNA片段，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的抗晚疫病性状：
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为抗晚疫病番茄或为候选抗晚疫病番茄；
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄为非抗晚疫病番茄或为候选非抗晚疫病番茄；所述待鉴定番茄为选自LA4084×CLN2037B的杂种后代。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3的DNA片段的方法为：以所述待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用R2M1S进行PCR扩增得到R2M1S的PCR扩增产物，检测所述R2M1S的PCR扩增产物的序列，按照下述方法确定所述待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID No.3的DNA片段：
如果所述R2M1S的PCR扩增产物含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID No.3的DNA片段；如果所述R2M1S的PCR扩增产物不含有SEQ ID No.3的DNA片段，所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID No.3的DNA片段；所述R2M1S由SEQID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成。
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Development of the gene-based SCARs for the Ph-3 locus, which confers late blight resistance in tomato;Younghoon Park，et al;《Scientia Horticulturae》;20131231;第9-16页及附件1 *
Younghoon Park，et al.Development of the gene-based SCARs for the Ph-3 locus, which confers late blight resistance in tomato.《Scientia Horticulturae》.2013,第9-16页及附件1. *
番茄抗晚疫病QTL及Ph-3基因的分析;张春芝;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20111015;D048-18页 *

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