CN105385772B - 用于筛选小麦抗叶锈病qtl的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物及其应用，涉及包括核酸的测定或检验方法技术领域。QTL位于2DS染色体，标记区间为Xgwm261‑Xgwm484，来自于感病亲本Thatcher；引物是由引物wms261和wms484的上下游核苷酸序列组成的引物对。本发明引物用于筛选小麦抗叶锈病QTL‑QLr.hebau‑2DS，利用与该QTL紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明中发现的新抗叶锈QTL及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物及其应用

技术领域

本发明涉及包括核酸的测定或检验方法技术领域。

背景技术

禾本科农作物小麦是全世界广泛种植的重要粮食作物，其总产量仅次于玉米，全世界内35%-40%的人口以小麦为主粮。在我国，小麦的种植区域很广，其主要种植于河南、山东、江苏、河北、湖北、安徽等省，主要以冬小麦为主，其种植面积和总产量仅次于水稻，居我国粮食作物第二位。由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是一种世界性病害，发生严重时可造成很大的产量损失，主要为害小麦叶片，很少发生在叶鞘及茎秆上。发病初期，在叶片上首先出现褪绿斑点，后慢慢扩展，后期在叶片上长出褐色夏孢子堆，该病害为气传病害，分布范围很广，在世界各小麦种植区域均有发生，会造成严重的产量损失。在我国，1969、1973、1975、1979、2012和2015年间小麦叶锈严重流行，造成了重大的经济损失。生产实践证明，培育和利用抗病品种是控制小麦叶锈病最经济有效且对环境安全的重要手段。加强小麦品种及其遗传资源的抗病性研究，对于病害持续控制、确保小麦安全生产至关重要。小麦品种抗病基因研究是抗病育种及抗病基因合理布局的基础工作，逐步探明品种和抗源所具有的抗病基因，对建立抗源的遗传多样性具有重要意义。

小麦对叶锈病的抗性，根据是否为小种专化型分为两种，一种是小种专化抗性，另一种是非小种专化抗性。小种专化抗性是目前研究最多并且最清楚的防卫体系，这种抗性为单基因抗性，也称为“垂直抗性”，常表现出过敏性坏死反应（HR），其抗病机理是病原生理小种中的一个无毒基因与宿主中的一个抗病性基因两者之间产生特异的作用，寄主对病原菌某个或少数生理小种表现为免疫或者高抗，而对另一些生理小种则表现为感病，这类抗性通常是由单个或少数主效抗病基因控制的，具有明显的抗感差异，表现为质量性状。非小种专化抗性，又称水平抗性，当一个品种抵抗一种病原物的所有小种时，其抗性一般为水平抗性。寄主对病原菌的抗性表现不如垂直抗性，但其对所有生理小种反应基本一致，水平抗性通常由多个微效基因控制，表现为数量性状。具有这种抗性的品种一般表现为中等抗性和慢病性，且不会因病原菌生理小种变异而丧失抗性，表现更加持久和稳定。这些控制数量性状的基因构成数量性状位点（quantitative trait loci，QTL），不易使病原菌产生新的变异，抗性比较持久。为了挖掘持久抗病基因，近年来人们已经开始关注成株期抗性，尤其是具有持久抗性的成株期慢病性。目前已知的小麦成株慢叶锈基因有Lr34、Lr46、Lr67和Lr68，而且这些基因多数是兼抗多种病害，因此成株慢锈性基因的发掘对培育持久兼抗多种病害的小麦品种具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物及其应用，引物用于筛选小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS，利用与该QTL紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明中发现的新抗叶锈QTL及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种用于筛选小麦抗叶锈病QTL 的引物，QTL位于2DS染色体，标记区间为Xgwm261-Xgwm484，来自于感病亲本Thatcher；引物是由引物wms261和wms484的上下游核苷酸序列组成的引物对；

其中引物wms261由序列表中其上游序列（19个碱基）和下游序列（19个碱基）组成；引物wms484由序列表中其上游序列（20个碱基）和下游序列（19个碱基）组成，见表1。

表1用于检测抗叶锈基因的两引物上下游序列

本发明所提供的用于筛选小麦抗叶锈病QTL的分子标记分别是gwm261和gwm484，标记gwm261由引物wms261扩增获得（164 bp/194bp），标记gwm484由引物wms484扩增获得（143 bp/153bp）。

本发明还提供了引物在筛选小麦抗叶锈病QTL中的应用。

本发明应用的具体方法为：以待测小麦基因组DNA为模板，分别在引物wms261和wms484的引导下进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测；当用wms261扩增的产物有164 bp条带，并且用wms484扩增的产物有143 bp条带时，则待测小麦含有目的小麦抗叶锈病QTL；当用wms261扩增的产物有194 bp条带，并且用wms484扩增的产物有153 bp条带时，则待测小麦不含有目的小麦抗叶锈病QTL。

优选的，PCR扩增：

10 μL PCR反应体系为：10×buffer 1 μL、10 mmol L^-1 dNTP 0.2 μL、4 μmol L^-1引物1 μL、30 ng μL^-1 DNA模板1 μL、Taq酶0.5 U、ddH₂O 6.7 μL；

PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 sec，55℃退火45 sec，72℃延伸45 sec， 35个循环；最后72℃延伸10 min，10℃保存，PCR结束后在每个反应体系中加入2.5μL 6×Loading buffer。

优选的，对扩增产物进行检测是：对扩增产物在12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后银染显色。

罗马尼亚小麦品系Fundulea 900在苗期和成株期对叶锈病均表现出良好的抗性。王翠芬在成株期对Fundulea 900进行了成株抗叶锈性QTL分析，利用Fundulea 900与Thatcher杂交、自交得到的的F_2:3群体为材料，通过田间进行抗性的鉴定并结合分子标记技术进行成株叶锈性QTL分析，结果检测到慢叶锈病基因Lr34存在于Fundulea 900中，但是通过群体鉴定，发现在不含有Lr34的株系仍具有较低严重度，说明该群体可能还存在其它微效抗叶锈QTL位点。由于Lr34基因具有较大效应，可能会掩盖其它基因表达，通过用与Lr34紧密连锁的分子标记csLV34检测大群体，剔除含有Lr34的株系，重新构建了一个含有70个株系的群体以分析该群体中含有的其它QTL。在重新构建的Fundulea 900/Thatcher群体中，检测到了一个QTL位点QTL-QLr.hebau-2DS，其位于2DS染色体上，标记区间为Xgwm261- Xgwm484，能够在2012MDS和2013MDS环境中检测到，分别解释了20.4和23.4%的表型变异，其加性效应分别为13.5和15.0，该QTL位点来自于感病亲本Thatcher，与该QTL紧密连锁的SSR分子标记可用于标记辅助育种培育持久抗病品种。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

（1）本发明首次公开了一个新的小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS；

（2）本发明首次公开了与上述小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS紧密连锁的SSR标记gwm261和gwm484。利用与该QTL紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性；

（3）本发明中发现的新抗叶锈QTL及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明；

图1是SSR引物wms261对亲本、抗病家系和感病家系单株的PCR扩增结果；

图2是SSR引物wms484对亲本、抗病家系和感病家系单株的PCR扩增结果；

图3是2DS染色体抗叶锈性QTL的位置。

具体实施方式

用于筛选小麦抗叶锈病QTL 的引物，QTL位于2DS染色体，标记区间为Xgwm261-Xgwm484，来自于感病亲本Thatcher；引物是由引物wms261和wms484的上下游核苷酸序列组成的引物对；

引物wms261的上游序列为：5' CTCCCTGTACGCCTAAGGC 3'，下游序列为：5'CTCGCGCTACTAGCCATTG 3'；

引物wms484的上游序列为：5' ACATCGCTCTTCACAAACCC 3'，下游序列为：5'AGTTCCGGTCATGGCTAGG 3'。

应用本引物序列筛选小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS的具体方法如下：

1、提取待测小麦基因组DNA为模板；

2、以wms261和wms484为引物、待测小麦基因组DNA为模板，进行PCR扩增。10 μLPCR反应体系为：10×buffer 1 μL、10 mmol L^-1 dNTP 0.2 μL、4 μmol L^-1引物1 μL、30 ngμL^-1 DNA模板1 μL、Taq酶0.5 U、ddH₂O 6.7 μL；反应程序是94℃预变性5 min；94℃变性45sec，55℃退火45 sec，72℃延伸45 sec，35个循环；最后72℃延伸10 min，10℃保存。

3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入2.5μL 6×Loading buffer，在浓度为12％(w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，若用wms261扩增的产物有164 bp条带，并且用wms484扩增的产物有143 bp条带时，则待测小麦含有小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS；若用wms261扩增的产物有194 bp条带，并且用wms484扩增的产物有153 bp条带时，则待测小麦不含有小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

实验例：

小麦抗叶锈病新QTL-QLr.hebau-2DS的SSR标记gwm261和gwm484的获得：

Fundulea 900、Thatcher以及188个Fundulea 900/ThatcherF_2:3群体分别于2010-2011、2011-2012和2012-2013连续三年在小麦生长季节种植于河北保定试验田，田间种植时采取完全随机区组设计，共设置2次重复，行长为1.2 m，行距为0.25 m，每行撒播50粒左右。每10行种1行高感品种郑州5389为对照。诱发行（郑州5389）与试验材料垂直种植。

用混合叶锈菌种接种诱发行，待诱发行叶片充分发病时，对群体进行抗锈病鉴定，统计分析其田间最大病害严重度（MDS）。

提取亲本和群体DNA，整理田间病害最大严重度数据，根据优选小群体（PSG）策略组建小群体。在后代群体中分别选取5个典型的抗病株系（严重度小于等于5%）和5个典型的感病株系（严重度大于等于90%）组成优选小群体，用于分子标记的初步筛选。

在亲本之间进行SSR分子标记的筛选，亲本间有差异的分子标记来检测小群体，10个小群体中重组率在20%及以下的分子标记被认为可能与抗叶锈病基因连锁，用该分子标记来检测大群体，获得大群体基因型。根据小麦遗传连锁图谱(http://wheat.pw.usda.gov)，用多态性的分子标记所在染色体区域附近的其它标记进行进一步筛选检测，构建遗传连锁图谱。

所用分子标记为遍布小麦整个染色体组的1215对SSR分子标记、特异性检测Lr34的STS分子标记csffr1和csfr2以及与Lr34紧密连锁的标记csLV34。

结合基因型和田间表型数据，采用软件MapManager QTXb20进行连锁分析（P =1e-6），将重组交换率用Kosambi函数转换为遗传距离。用QTL IciMapping 3.1软件，采用完备区间作图法，运用ICIM-ADD功能，以LOD阈值2.5，进行QTL定位。运用ICIM-EPI功能来进行上位性分析，分析不同QTL位点间的互作，LOD阈值设置为2.5。

由于Lr34基因具有很大的效应，可能会掩盖住其它基因表达，通过用与Lr34紧密连锁的分子标记csLV34检测大群体，剔除含有Lr34的株系，重新构建一个含有70个株系的群体用于分析该群体中含有的其它QTL。在重新构建的Fundulea 900/Thatcher群体中，检测到了一个新QTL位点-QLr.hebau-2DS，该位点位于2DS染色体上，如图3所示，标记区间为Xgwm261-Xgwm484，能够在2012MDS和2013MDS环境中检测到，分别解释了20.4和23.4%的表型变异，加性效应为13.5和15.0，该QTL位点来自于感病亲本Thatcher。

实施例1：

1、提取Thatcher基因组DNA为模板；

2、以wms261和wms484为引物、Thatcher基因组DNA为模板，进行PCR扩增。10 μLPCR反应体系为：10×buffer 1 μL、10 mmol L^-1 dNTP 0.2 μL、4 μmol L^-1引物1 μL、30 ngμL^-1 DNA模板1 μL、Taq酶0.5 U、ddH₂O 6.7 μL。

反应程序是94℃预变性5 min；94℃变性45 sec，55℃退火45 sec，72℃延伸45sec，35个循环；最后72℃延伸10 min，10℃保存。

3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入2.5μL 6×Loading buffer，在浓度为12％(w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，如图1和图2所示（图1为wms261扩增产物的非变性聚丙酰胺凝胶电泳图片，图2为wms484扩增产物的非变性聚丙酰胺凝胶电泳图片；其中，P₁：Fundulea 900；P₂：Thatcher； R：5个抗病家系；S：5个感病家系），用wms261扩增的产物有164 bp条带，并且用wms484扩增的产物有143 bp条带，表明Thatcher含有小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS。

实施例2：

1、提取Fundulea 900基因组DNA为模板；

2、以wms261和wms484为引物、Fundulea 900基因组DNA为模板，进行PCR扩增。10 μL PCR反应体系为：10×buffer 1 μL、10 mmol L^-1 dNTP 0.2 μL、4 μmol L^-1引物1 μL、30ng μL^-1 DNA模板1 μL、Taq酶0.5 U、ddH₂O 6.7 μL。

反应程序是94℃预变性5 min；94℃变性45 sec，55℃退火45 sec，72℃延伸45sec，35个循环；最后72℃延伸10 min，10℃保存。

3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入2.5μL 6×Loading buffer，在浓度为12％(w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，如图1和图2所示（图1为wms261扩增产物的非变性聚丙酰胺凝胶电泳图片，图2为wms484扩增产物的非变性聚丙酰胺凝胶电泳图片；其中，P₁：Fundulea 900；P₂：Thatcher； R：5个抗病家系；S：5个感病家系），用wms261扩增的产物有194 bp条带，并且用wms484扩增的产物有153 bp条带，表明Fundulea 900中不含有小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS。

SEQUENCE LISTING

<110> 保定学院

<120> 用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物及其应用

<130> 2015

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctccctgtac gcctaaggc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcgcgctac tagccattg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acatcgctct tcacaaaccc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agttccggtc atggctagg 19

Claims (4)

1.用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物的应用，其特征在于，所述QTL位于2DS染色体，标记区间为Xgwm261-Xgwm484，来自于感病亲本Thatcher；所述引物是由引物wms261和wms484的上下游核苷酸序列组成的引物对；所述引物wms261的上游序列为：5'CTCCCTGTACGCCTAAGGC 3'，下游序列为：5'CTCGCGCTACTAGCCATTG 3'；所述引物wms484的上游序列为：5'ACATCGCTCTTCACAAACCC 3'，下游序列为：5'AGTTCCGGTCATGGCTAGG 3'；所述引物在筛选小麦抗叶锈病QTL中的应用。

2.根据权利要求1所述的用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物的应用，其特征在于：所述小麦抗叶锈病QTL为QTL-QLr.hebau-2DS；以待测小麦基因组DNA为模板，分别在引物wms261和wms484的引导下进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测；当用wms261扩增的产物有164bp条带，并且用wms484扩增的产物有143bp条带时，则待测小麦含有小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS；当用wms261扩增的产物有194bp条带，并且用wms484扩增的产物有153bp条带时，则待测小麦不含有小麦抗叶锈病QTL-QLr.hebau-2DS。

3.根据权利要求2所述的用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物的应用，其特征在于，所述的PCR扩增：

10μL PCR反应体系为：10×buffer 1μL、10mmol L^-1dNTP 0.2μL、4μmol L^-1引物1μL、30ngμL^-1DNA模板1μL、Taq酶0.5U、ddH₂O 6.7μL；

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存，PCR结束后在每个反应体系中加入2.5μL 6×Loading buffer。

4.根据权利要求2或3所述的用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物的应用，其特征在于，所述的对扩增产物进行检测是：对扩增产物在12％w/v的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后银染显色。