CN105200052B - 估算烟草n导入片段左端长度的分子标记、引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种估算烟草N导入片段左端长度分子标记、引物及方法。该分子标记为Seq ID No.1或Seq ID No.2所示序列。该估算方法是以GL4.06引物对或GL3.50引物对为引物，以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN相当；如没有扩增出，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短。该方法可以简便、快速、高通量地应用于烟草TMV抗病基因定位和选育烟草抗TMV品种中，有利于减少与N基因连锁的累赘。

Description

估算烟草N导入片段左端长度的分子标记、引物及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及估算烟草N导入片段左端长度的分子标记、引物及方法。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、以及该分子标记和引物在烟草TMV抗病基因定位或选育烟草抗TMV品种中的应用。

背景技术

烟草花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)是我国烟草上的重要病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列。生产上主要采取培育无毒苗、药剂防治和销毁田间病残体等措施进行防治，在控制TMV的发生流行上取得了一定的效果，但TMV在局部田块爆发的情况仍然时有发生，造成较大的经济损失。因此，种植TMV抗病品种依然是防控TMV最根本同时也是最经济有效的手段。抗病品种的推广需要抗性高、且无产量劣势和农艺性状劣势的品种。

目前烟草的TMV抗源主要来源于烟草野生种心叶烟(Nicotiana glutinosa)，其抗性由一个显性单基因(N)控制。N基因在1994年被克隆，是植物中克隆的第一个NBS类抗病基因。N基因抗TMV-U1株系。N基因的基因组序列大小为6656bp，包括5个外显子和4个内含子，属于TIR-NBS-LRR类型抗病基因。N基因的抗病机理为在病毒侵染位点出现过敏性坏死斑(枯斑)，通过诱导产生的细胞过敏性死亡限制TMV在植物体内的移动。在介导了过敏反应后，烟草植株能够获得系统性抗性，对TMV或其它类似病原的再次入侵产生广谱抗性。通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从心叶烟转育至香料烟中，然后转育至烟草品种中。

采用杂交育种转育N基因的抗性，实际上是转育包含N基因的野生烟染色体片段(简称为N导入片段)。世界上抗TMV烟草育种利用的几乎都是N导入片段。代表性品种是较早商业化种植的包含N导入片段的抗TMV烟草品种Cok er176和Speight H20。

由于产量较低、上部叶落黄较慢等连锁累赘，包含N导入片段的烟草品种不能满足生产的迫切需要。已有研究证明N基因本身无产量和产值的连锁累赘，连锁累赘来源于N导入片段上的其他基因。N导入片段较短的枯斑资源，推测其连锁累赘可能较小，育种利用潜力较大。尽管N基因在20年前被克隆，但N导入片段的长度和伴随的累赘基因一直不清楚，限制了的N基因在商业品种中的应用。常规育种技术无法估算N导入片段的长度，产量、落黄和烘烤等性状为数量性状，在育种早期难以选择。估算N导入片段长度的技术手段缺乏，导致抗TMV烟草育种缺乏突破性进展。因此如何克服现有技术的不足是目前烟草抗TMV育种技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种估算烟草N导入片段左端长度的分子标记、引物及方法，该分子标记、引物及方法可用于筛选N导入片段较短的资源和育种单株，达到减少N导入片段的连锁累赘的效果，为选育出高抗TMV，且无明显产量和质量劣势的烟草品种提供技术手段。

本发明的目的是提供估算烟草N导入片段左端长度的分子标记。

本发明的另一目的是提供一种估算烟草N导入片段左端长度的PCR扩增方法所用的引物对。

本发明的又一目的是提供一种估算烟草N导入片段左端长度的方法。

本发明的再一目的是提供上述分子标记、引物对及估算方法在烟草TMV抗病基因定位或选育烟草抗TMV品种中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了估算烟草N导入片段左端长度的分子标记，所述的分子标记为SeqID No.1或Seq ID No.2所示序列。

本发明还公开了估算烟草N导入片段左端长度的PCR扩增方法所用的引物对，所述的引物对为GL4.06引物对或GL3.50引物对；

所述的GL4.06引物对的序列如下：

GL4.06-F1：5’-gatcccacgagtggagca-3’(Seq ID No.3)，

GL4.06-R1：5’-tcctcaccaaacccaacttt-3’(Seq ID No.4)；

所述的GL3.50引物对的序列如下：

GL3.50-F1：5’-ttgagaaccgtccaatttcc-3’(Seq ID No.5)，

GL3.50-R1：5’-cccctgagtcgaacaagtcaa-3’(Seq ID No.6)。

N导入片段是指包含TMV抗病基因(N)的野生烟染色体片段。N导入片段较短的烟株，其连锁累赘可能较小。

本发明还公开了一种估算烟草N导入片段左端长度的方法，以上述的GL4.06引物对或GL3.50引物对为引物，以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；

N导入片段长度估算：根据N导入片段左端分子标记检测为阴性或阳性，判断N片段缺失或者包含该标记对应的基因。利用N导入片段的左末端邻近的两个标记检测估算其长度。若内侧标记为阳性，外侧标记检测为阴性，表明该资源的N导入片段末端位于这两个标记之间，N导入片段的长度用其左右末端阳性标记的基因组物理距离表示。某资源N导入片段特异分子标记检测阴性越多，则表明该资源的N导入片段越短。

其中，

当以所述的GL4.06引物对进行PCR扩增，如果扩增出391bp大小的DNA片段，即SeqID No.1所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出391bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；

当以权利要求2所述的GL3.50引物对进行PCR扩增，如果扩增出654bp大小的DNA片段，即Seq ID No.2所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出654bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短。

本领域技术人员应该理解扩增产物不仅限于用电泳检测，还可以采用测序的方法来确定。

进一步，优选的是所述的PCR的反应体系如下：

总体积为20μL；

所述的引物对为GL4.06引物对或GL3.50引物对。

进一步，优选的是所述的PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

本发明的分子标记序列(Seq ID No.1和Seq ID No.2)是通过以下技术方案获得的。利用参考基因组学的方法，以及已测序的含N基因烟草品种TN90基因组[Sierro,N.,Battey,J.N.,Ouadi,S.,Bakaher,N.,Bovet,L.,Willig,A.,Goepfert,S.,Peitsch,M.C.and Ivanov,N.V.(2014)The tobacco genome sequence and its comparison withthose of tomato and potato.Nat.Commun.,5,doi:10.1038/ncomms4833]。利用烟草抗TMV的N基因序列(Genbank登录号U15605.1)，比对番茄基因组(http://solgenomics.net/)。烟草N基因匹配至番茄基因Solyc11g011350.1.1，该基因位于番茄染色体Chr11:4,391,578..4,397,668处。根据番茄N基因同源体所在11号染色体4.39Mb左侧1.0Mb周围的低拷贝基因，采用BLAST方法调取TN90基因组中的基因序列，将TN90基因序列与野生祖先N.sylvestris和N.tomensformis基因组进行blastn比对，选取比对identity值最高的两个基因。根据TN90的同一位点的两个拷贝与野生祖先N.sylvestris和N.tomensformis比对identity值判断该拷贝是否来自心叶烟。一个拷贝与N.tomensformis中的基因identity大于99％，另一个拷贝与N.sylvestris和N.tomensformis中的基因identity小于95％，即该拷贝为来自心叶烟的渐渗片段，从而得知来自心叶烟的渐渗片段替代了来自N.sylvestris基因组的片段。若比对的identity小于95％的序列为来自心叶烟的渐渗片段，根据在TN90基因组数据库中调取的序列，设计TN90特异引物。在Coker176，心叶烟，Samsun NN，SR1(不含N)中扩增，心叶烟与不含N基因普通烟草相比的特异条带为N导入片段的特异标记。若比对的identity均大于99％，设计保守引物，在Coker176，心叶烟，Samsun NN，SR1(不含N)中扩增，将扩增片段测序，比对测序结果，设计心叶烟特异的引物，再次在上述品种中扩增，筛选心叶烟特异条带，开发为N导入片段的特异标记。将特异条带的PCR产物回收，送宝生物公司测序。获得包含本发明的分子标记序列(Seq ID No.1和SeqID No.2)。

番茄和烟草同为茄科作物，番茄的基因组大小为800Mb，二倍体烟草祖先种的基因组大小约为2.5Gb。烟草基因组大小为番茄的3倍左右。番茄N基因同源体在番茄11号染色体的4.39Mb处，番茄N基因同源体左侧1.0Mb范围内，在烟草染色体距离按照番茄距离的3倍计算，对应烟草N基因所在染色体的范围为3.0Mb。因此，本发明公开的分子标记距离N基因的物理距离可远达3.0Mb左右。与N基因的物理距离较远的分子标记，适宜用于估算N导入片段的长度。本发明公开的分子标记Seq ID No.1和Seq ID No.2在番茄染色体上对应的物理位置分别为Chr11-3.50Mb和Chr11-4.06Mb，在番茄上距离N基因同源体的物理距离分别为0.89Mb、0.33Mb。在烟草染色体距离按照番茄距离的3倍计算，在烟草上距离N基因的物理距离分别为2.67Mb、0.99Mb。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记为烟草基因组中Seq ID No.1和SeqID No.2所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的Seq ID No.1和Seq ID No.2的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是烟草基因组中的序列，优选的，为烟草基因组中Seq ID No.1和Seq ID No.2的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测包含N导入片段的烟草基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增到含有Seq IDNo.1和Seq ID No.2所示的序列。Seq ID No.1和Seq ID No.2的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,200bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。

本发明还公开了上述的估算烟草N导入片段左端长度的方法在选育烟草抗TMV品种中的应用。

本发明还公开了上述的估算烟草N导入片段左端长度的分子标记在烟草TMV抗病基因定位或选育烟草抗TMV品种中的应用。本发明的分子标记可用于选育烟草抗TMV品种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选估算N导入片段的长度。含有所述分子标记表明N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料SamsunNN无差异，不含有所述分子标记表明N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料SamsunNN短。

所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用GL4.06引物对或GL3.50引物对进行PCR扩增。所述检测还可以通过测序方法进行。该烟草育种辅助选择方法具有简便、快速、高通量的优点。

本发明还公开了上述的估算烟草N导入片段左端长度的PCR扩增方法所用的引物对在烟草TMV抗病基因定位或选育烟草抗TMV品种中的应用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供了估算烟草N导入片段左端长度的分子标记，与N基因紧密连锁但与N基因的物理距离较远，与烟草N基因的物理距离在2Mb以上。与文献已报道的N基因抗性相关分子标记相比，本发明所述分子标记是用于估算N导入片段长度，而不是用于评价N基因介导抗性的有无。选择N导入片段较小的材料或育种单株，可望减少与N基因紧密连锁的累赘，如减少产量降低幅度。

本发明的分子标记、PCR扩增方法所用的引物对及估算方法可以简便、快速、高通量地应用于烟草TMV抗病基因定位、选育烟草抗TMV品种及育种材料N导入片段长度鉴定，有利于减少与N基因连锁的累赘。

附图说明

图1是本发明以GL4.06为引物对的扩增产物电泳检测结果；

图2为本发明以GL3.50为引物对的扩增产物电泳检测结果；

其中，1为Coker176；2为心叶烟；3为Samsun NN；4为Xanthi nc；5为K326；泳道M为marker，其为100bp DNA Ladder。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明公开了引物对以及估算N导入片段左端长度的分子标记。利用本发明的引物对，以烟草基因组DNA为模板进行PCR，可以得到估算N导入片段左端长度的分子标记。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述PCR扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。

估算烟草N导入片段左端长度的分子标记，所述的分子标记为Seq ID No.1或SeqID No.2所示序列。

估算烟草N导入片段左端长度的PCR扩增方法所用的引物对，所述的引物对为GL4.06引物对或GL3.50引物对；

所述的GL4.06引物对的序列如下：

GL4.06-F1：5’-gatcccacgagtggagca-3’，

GL4.06-R1：5’-tcctcaccaaacccaacttt-3’；

所述的GL3.50引物对的序列如下：

GL3.50-F1：5’-ttgagaaccgtccaatttcc-3’，

GL3.50-R1：5’-cccctgagtcgaacaagtcaa-3’。

本领域技术人员熟知，在上述Seq ID No.3-6所示序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～30个碱基，所增加的碱基类型可根据烟草基因组DNA上与Seq ID No.3-6相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与Seq ID No.3-6的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No.3-6的5’端或3’端分别增加1～30个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为Seq ID No.3-6所示序列。

包含N导入片段的抗TMV烟草材料：心叶烟(N.glutinosa)，Coker176，Samsun NN，Xanthi nc。未包含N导入片段的感TMV材料SR1和K326。以上烟草材料均为常见的烟草种质资源，公众可从烟草种质资源保存单位或云南省烟草农业科学研究院获得。

N.tobacum(TN90)、番茄、N.sylvestris、N.tomensformis的参考基因组序列公众可从http://solgenomics.net/获得。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。DNA Marker、Taq DNA聚合酶均购自大连宝生物公司。其他化学试剂均为市售产品。

实施例1

一、DNA提取

用常规CTAB法分别提取烟草基因组DNA，方法为：

(1)称取烟草叶片100mg左右置于1.0mL离心管中，加液氮用研棒研磨至粉末状；

(2)加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH为7.5100mM，EDTA20mM，NaCl 1.4M，CTAB质量百分浓度为2％)，65℃度水浴20分钟后取出冷却；

(3)加入200μl氯仿-异戊醇混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24：1)摇匀，4℃离心10min(7200rpm)后转移上清至1.0mL EP管；

(4)再次加入200μl氯仿-异戊醇混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24：1)摇匀，4℃离心10min(7200rpm)；

(5)取出上清置于新的EP管中，加入是该上清1/10体积浓度为3M pH5.2醋酸钠，同时加入与该上清等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；

(6)弃上清，用体积百分浓度为75％的乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液融解，放置-20℃保存备用。

二、PCR扩增及电泳检测

PCR反应体系如下：

总体积为20μL；

所述的引物对为GL4.06引物对或GL3.50引物对。

所用试剂购自宝生物公司。

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，运行35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

PCR产物电泳检测：用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶120v电泳25min，EB染色10min，照胶并记录。

三、N导入片段的检测

提取待检测材料如Xanthi nc、Coker176的基因组DNA，采用N基因特异分子标记N1/N2，按照文献的方法(Lewis,R.S.,S.R.Milla,and J.S.Levin.Molecular and geneticcharacterization of Nicotiana glutinosa L.chromosome segments in tobaccomosaic virus-resistant tobacco accessions.Crop Sci.2005,45:2355–2362)进行的PCR扩增。N1/N2检测为阳性，则判断为包含N导入片段，N1/N2检测为阴性则判断为未包含N导入片段。挑选出包含N导入片段的材料，用于估算N导入片段的长度。

四、估算N导入片段左端长度

以感TMV的烟草品种K326为感病对照，以已知包含N基因抗TMV的烟草品种SamsunNN和心叶烟为抗病对照；以GL4.06引物对或GL3.50引物对为引物，以待检测的包含N导入片段烟草的基因组DNA、感病对照的烟草基因组DNA、抗病对照的烟草基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测；

PCR反应体系如下：

总体积为20μL；

所述的引物对为GL4.06引物对或GL3.50引物对。

所用试剂购自宝生物公司。

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，运行35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

PCR产物电泳检测：用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶120v电泳25min，EB染色10min，照胶并记录，结果如图1和图2所示。

采用GL4.06引物对进行扩增，抗病对照有391bp扩增产物，感病对照无391bp扩增产物。表明PCR扩增正常。然后按照如下的标准判断烟草种质的N导入片段左侧的大小：N1/N2阳性且无391bp扩增产物，判断该种质N导入片段左侧缺失了Seq ID No.1，缺失了Seq IDNo.1表明该种质的N导入片段比抗病对照小。N1/N2阳性且有391bp扩增产物，判断该种质N导入片段左侧含有Seq ID No.1。结果表明：抗TMV的烟草品种Coker176无391bp扩增产物，即在分子标记Seq ID No.1这一端Coker176的N导入片段比Samsun NN的N导入片段小。抗TMV的烟草品种Xanthi nc有391bp扩增产物。即Xanthi nc的N导入片段含有Seq ID No.1、在该分子标记位置Xanthi nc与抗病对照材料Samsun NN无差异。表明该分子标记可用于鉴定烟草种质的N导入片段长度。

采用GL3.50引物对进行扩增，抗病对照有654bp扩增产物，感病对照无654bp扩增产物。表明PCR扩增正常。然后按照如下的标准判断烟草种质的N导入片段左侧的大小：N1/N2阳性且无654bp扩增产物，判断该种质N导入片段左侧缺失了Seq ID No.2，缺失了Seq IDNo.2表明该种质的N导入片段比抗病对照小。N1/N2阳性且有654bp扩增产物，判断该种质N导入片段左侧的含有Seq ID No.2。结果表明：抗TMV的烟草品种Coker176无654bp扩增产物，即在分子标记Seq ID No.2这一端Coker176的N导入片段比Samsun NN的N导入片段小。抗TMV的烟草品种Xanthi nc有654bp扩增产物。即在分子标记Seq ID No.2这一侧Xanthinc的N导入片段含有Seq ID No.2、在该分子标记位置Xanthi nc与Samsun NN的N导入片段无差异。表明该分子标记可用于鉴定烟草种质的N导入片段长度。

本发明所述分子标记及引物的序列如下：

Seq ID No.1:

Seq ID No.2:

Seq ID No.3:

gatcccacga gtggagca 18

Seq ID No.4:

tcctcaccaa acccaacttt 20

Seq ID No.5:

ttgagaaccg tccaatttcc 20

Seq ID No.6

cccctgagtc gaacaagtca a 21

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种估算烟草N导入片段左端长度的方法在选育烟草抗TMV品种和在烟草TMV抗病基因定位中的应用，其特征在于步骤如下：

以GL4.06引物对或GL3.50引物对为引物，以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；所述的分子标记为Seq ID No.1 或Seq ID No.2所示序列；其中，

当以所述的GL4.06引物对进行PCR 扩增，如果扩增出391bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.1所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出391bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；

当以所述的GL3.50引物对进行PCR 扩增，如果扩增出654bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.2所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出654bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；

所述的GL4.06引物对的序列如下：

GL4.06-F1：5’-gatcccacgagtggagca-3’，

GL4.06-R1：5’-tcctcaccaaacccaacttt-3’；

所述的GL3.50引物对的序列如下：

GL3.50-F1：5’-ttgagaaccgtccaatttcc -3’，

GL3.50-R1：5’-cccctgagtcgaacaagtcaa-3’。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCR 的反应体系如下：

DNA模板50 ng/μL 2.5 μL，

10×PCR buffer 2.0 μL，

dNTPs 2.5mM 1.2 μL，

引物对中的引物10umol/μL 各1.5 μL，

Ex-Taq DNA酶5U/μL 0.3 μL，

ddH₂O 余量，

总体积为20 μL。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。